分子生物学实验设计

分子生物学实验设计

彭杰2012141241104 摘要：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是源于海洋生物多管水母属（aequoia victoria）的一种发光蛋白,能够自身催化形成生色团并在蓝光激发下发出绿色荧光,能在活细胞内稳定表达,本试验首先从含有GFP的大肠杆菌中提取质粒,并利用胶回收试剂盒纯化质粒,采用氯化钙法将工程菌DH5a制成感受态细胞,然后将纯化后的质粒转入已制备好的感受态细胞中,使得工程菌DH5a转化成具有抗氨苄青霉素的大肠杆菌,并表达绿色荧光蛋白,接种于加氨苄青霉素的LB培养基上,筛选阳性克隆。

实验目的：获取发绿色荧光的大肠杆菌BL21

实验材料：

（一）仪器

1、恒温摇床

2、低温离心机

3、恒温水浴

4、超净工作台

5、隔水式培养箱

6、琼脂糖凝胶电泳仪系统

7、台式高速离心机8、凝胶成像系统（Dark Reader）

9、高压灭菌锅 10、10、100、1000μL微量移液器各一支

11、制冰机 12、恒温培养箱

13、PCR热循环仪 14、漩涡混合器

（二）材料

1、少量含pEGFP-N3和pET-28a质粒的菌液

2、限制酶Bam HⅠ5'⋯G↓GATCC ⋯3' →5'⋯G GATCC⋯3'

3'⋯CCTAG↑G ⋯5' →3'⋯CCTAG G⋯5'

3、限制酶Not I 5'⋯GC↓GGCCGC⋯3'→5'⋯GC GGCCGC⋯3'

3'⋯CGCCGG↑CG⋯5'→3'⋯CGCCGG CG⋯5'

4、0.2mL EP管架

5、1.5ml塑料离心管

6、一次性手套

7、大肠杆菌DH2a和BL21

8、氯化钙氢氧化钠乙醇氯仿蔗糖硼酸

9、乙二胺四乙酸（EDTA）

10、三羟甲基氨基甲烷(Tris)

11、氨苄青霉素

12、溴酚蓝

13、PCR产物快速胶回收试剂盒

14、dNTP混合物

15、引物对（正反向引物）

16、Ex-Taq酶 T4DNA连接酶

17、酵母提取物胰蛋白胨氯化钠

18、小指管、吸头、培养皿、三角瓶、试管等

（三）试剂

·1、LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。

2、溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)

作用：分散细胞，螯合金属离子使酶失活，防止DNA的降解

3、溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ，2% SDS 临用前1：1配制

作用：细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性

4、溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60m冰醋酸 11.5ml 双蒸水 28.5ml

作用：酸性条件上质粒DNA复性，留在上清液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS 复合物等发生沉淀

5、抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ）

作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。平衡酚密度大，可是DNA在上清中。异戊醇防止抽提液起泡。

·6、Gold view（DNA染料）0.5×TBE缓冲液上样缓冲液（6×）

·7、ddH2O,10×buffer

8、5 X TBE (5倍体积的TEB贮存液) 1000mL

Tris 54g 硼酸27.5g 0.5mol/L EDTA(Ph8.0) 20μL

9、RTE

将RNA酶溶于10mmol/L Tris-HCl(Ph7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10mg/Ml 的浓度，于100o C加热15min，缓慢冷却至室温，10000r/min离心5min，上清液于—20o C保存。

10、凝胶加样缓冲液（10× loading buffer）

溴酚蓝 0.4% 蔗糖 60%

11、2.5mmol/L dNTP混合物 1U/μL Taq酶10X PCR buffer(含镁离子)

12、200mg/mL IPTG:取2gIPTG溶于8mL双蒸去离子水中，再用水补至10mL，用

0.22μm滤膜过滤除菌，每份1mL，贮存于—20o C。

*IPTG作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用

实验步骤：

（一）质粒DNA的提取：（两种质粒分别在两个EP管中操作）

1、将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌分别接种在液体培养基中（加氨苄

青霉素50μg/mL），370C培养过夜。

2、取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液

3、加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min。

4、加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min。

5、加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰

上放置15 min。

6、10000rpm× 5 min，取上清液于另一干净的离心管中。

7、向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，

10000rpm × 10 min，将上清液转移至新的离心管中。

*、饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL。

8、加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新

离心管中

9、向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h

10、12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

11、加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min。

12、加30μL ddH2O (或20μL RTE溶解DNA)，-200C保存备用。

*制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和II

以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。

（二）质粒DNA的琼脂凝胶电泳