复方黄芪颗粒抗肝纤维化机制的实验研究

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而减轻肝细胞损伤，提示复方黄芪颗粒有一 定改善肝功能的作用，与临床观察较一致。 我们发现ＦＨ和ＦＬ组在治疗第２、３个月结束 后，肝细胞水样交性明显减轻，而Ｒ组肝细 胞变性好转不如ＦＨ和ＦＬ组明显，提示可能 复方黄芪颗粒在保护肝细胞作用上略优于复
方鳖甲软肝片。
细胞总数占肝脏内细胞的绝大多数，其作用 不容忽视，需进一步研究。我们观察随着肝 纤维化的进展，Ｍ组Ｍ即一１３酶蛋白表达逐渐 减少，ＴＩＭＰ＿ｌ表达逐渐增强；ＦＨ、ＦＬ组Ｍ肝一１３ 酶蛋白的表达在治疗第２个月结束时明显增 多，在治疗第３个月结束时增多更加明显（Ｐ ＜Ｏ．０５），而ＴＩＭＰ．１酶蛋白表达在药物治疗 第２个月结束明显减少，在治疗第３个月结 束时减至最低（Ｐ＜０．０５）。我们推测删Ｐ一１３
杭州市第六人民医院 施军平荀运浩 近年来，由于生活水平提高、饮食结 构变化等多方面原因，我国非酒精性脂肪 性肝病（ｎｏ晌ｌｃｏｈｏｌｉｃ
ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄＩｓｅａｓｅ，
ＮＡＦＬＤ）的发病率有逐渐增加的趋势，其
１８３
３．３
ＴＩ船一１免疫组化观察 Ｃ组大鼠肝组织内偶见个别间质细胞表
达ＴＩ肝一ｌ。各造模组大鼠肝组织在造模结束 时ＴＩ好一１主要表达在纤维间隔内、汇管区和 窦周间隙的间质细胞内表达，部分纤维间隔 以及汇管区周围的部分肝细胞胞浆中亦呈阳 性表达，阳性染色位于细胞胞质中，未见细 胞核表达。Ｆｌｌ、ＦＬ以及Ｒ组大鼠肝组织内 ＴＩＭＰ—ｌ阳性表达在治疗第２个月结束时明显 减弱，治疗第３个月结束时减弱更加明显， 而Ｍ组随肝纤维化的进行性加重，ＴＩ肝一１阳 性表达逐渐增强。 ４讨论 迄今，异种血清诱导的免疫性肝纤维化
达Ｍ肝一１３。各造模组大鼠肝组织在造模结束
时姗一１３主要表达在纤维间隔内、汇管区和
窦周纤维化等部位间质细胞内表达，纤维间 隔以及汇管区周围的部分肝细胞胞浆中亦呈 阳性表达，免疫组化阳性着色位于细胞胞质
中，未见细胞核表达。姗一１３阳性细胞多呈
梭形或星状，胞核略呈椭圆型。ＦＨ、ＦＬ以及 Ｒ组大鼠肝组织内Ｍ肝一１３阳性表达在治疗第 ２个月结束时有所增强，与模型组之间比较 有显著差异（Ｐ＜Ｏ．０５）：治疗第３个月结束 时，各药物治疗组Ｍ好一１３阳性表达增强更加 明显，与模型组之间比较有显著差异（Ｐ＜ Ｏ．０５）：而Ｍ组随肝纤维化的进行性加重， 删Ｐ一１３阳性表达逐渐减少。
Ｃｏｗｄｅｎ
一走气分一走血分，两药合用可通腑泻下、
调和气血。诸药合用，共奏活血化瘀、消积 止痛之功。现代医学研究表明…１，方中药物 具有调节免疫功能，抑制肝癌细胞生长等作 用。 在本实验中，着重于ＰＴＥＮ蛋白的表达的
病、
Ｉｈｅ加ｉｔｔｅＤｕｃｌｏｓ
病和
ＢａｎｎａｙａｎＺｏｎａｎａ综合征，表明ＰＴＥＮ在胚胎 正常发育过程中是必需的；４）抑制端粒酶活 性我们发现，把野生型ＰＴＥＮ基因转染入ＰＴＥＮ 突变的胶质母细胞瘤Ｕ一８７ＭＧ，细胞的端粒酶 活性明显降低。ＰＴＥＮ蛋白的氨基端具有与细 胞骨架蛋白ｔｅｎｓｉｎ和辅助蛋白ａｕｘｉｌｉｎ的同 源序列，含１７７个氨基酸，在锚着点与肌动 蛋白结合，并与该位点的复合物共同调节细
胞扩散和局部黏附的形成，从而对细胞迁移
痛、臌胀等迁延不愈，导致肝脾受损、脏腑
失和、气机阻滞、瘀血内停，遂生积聚包块。 《医林改错》云：“凡肚腹疼痛，总不移动， 是血瘀”。故作者取膈下逐瘀汤治之，方中当 归、ＪｆＩ芎、桃仁、红花、赤芍、丹皮活血化
生长扩散及细胞骨架发挥调节作用，这种作
用通过ＰＴＥＮ抑制整合素下游分子ＦＡＫ及ＦＡＫ 下游分子Ｐ１３０ｃａｓ的酪氨酸磷酸化实现。 Ｚｕｎｄｅｌ研究发现在恶性胶质细胞瘤细胞株 中，缺乏ＰＴＥＮ的细胞在导入外源性ＰＴＥＮ后，
色、Ｍａｓｓｏｎ三色染色及网状纤维染色。组织 学疗效评估采用Ｃｈｅｖａｌｌｉｅｒ等的ＳＳＳ半定量 计分系统。
抑制剂ＴＩ好一１多克隆抗体以及免疫组化
ＳＡＢＣ即用型试剂盒购自武汉博士德生物工程 有限公司。，
１．４
２．３免疫组织化学检测 采用ＳＡＢＣ法，Ｍ肝一１３、ＴＩ肝～１一抗工
作浓度分别是１：３００和１：２４０ｊ常规设立 阴性对照。主要步骤如下：石蜡切片脱蜡至 水；３％的１１２０２室温２０分钟去内源酶；切片浸 入枸橼酸盐缓冲液，微波炉煮沸２０分钟行热 修复；５％牛血清白蛋白３７℃封闭１小时：滴
采用Ｓｔａｔａ统计学软件进行数据处理。
３结果
３．１造模结束时，１０８只大鼠均发生肝纤维 化，且造模结束后肝纤维化程度呈进行性加
重。高、低剂量ＦＦＨＱＩ【Ｌ治疗肝纤维化的疗效 见表１。
１８ｌ
表１
复方黄芪颗粒治疗实验性肝纤维化各时间段肝组织内纤维化半定量评分（ｘ±ｓ）
注：ＳＳＳ＝ＣＬＶ＋ＰＳ＋ＰＴ＋２（ＷＳ×ＮＳ）； 与Ｍ组比较△Ｐ＜０．０１
２００
ｍｇ／Ｌ膈下逐瘀汤组亦介于Ｏ．５ ｍｇ／Ｌ顺
胞生长。提示”ＥＮ在维持细胞的结构和信号
传导中起一定作用。 祖国医学将肝癌归于“积聚”的范畴， 发病多因情志郁结、酒食虫毒所伤，以及胁
铂组和１．０ｍ∥Ｌ顺铂组之间。这就说明，膈
下逐瘀汤的作用机制可能就是其促进了ＰＴＥＮ 蛋白的表达增加，从而阻断肝癌的发生发展。
瘀、祛瘀生新、消积止痛；五灵脂、香附、 乌药、延胡索行气散结止痛，且增加祛瘀之
功；甘草缓急止痛，调和诸药；积实合桃仁，
下调Ａｋｔ活性和眦卜１调控基因的表达，可
以控制ＩＧＦ一１介导的血管源性基因的表达， 有助于抑制肿瘤的恶性扩散；（３）参与胚胎的 生长、发育。Ｄｉ等报道ＰＴＥＮ基因参与内胚 层、中胚层和外胚层的分化，其等位基因的 丢失会引起皮肤、胃肠道、前列腺过度增生 而形成肿瘤。若胚系ＰＴＥＮ基因突变可以引发
药物 复方黄芪颗粒浸膏由解放军３０２医院药
研室提供，２ｌｇ浸膏＝复方黄芪颗粒６０９（为 临床成人每日用量）。复方鳖甲软肝片由解放 军３０２医院研制，内蒙古集宁制药厂馈赠， 生产批号２００２０６０９。复方黄芪颗粒浸膏以及 复方鳖甲软肝片碾磨成粉状，灌胃前分别用 蒸馏水配制。 ２方法
２．１
加ＰＢＳ稀释的一抗，４℃冰箱过夜；顺加ＳＡＢＣ
（ＨＳＣ），与Ｉ【ｎｉｔｔｅｌ等报道较一致；同时， 纤维间隔以及汇管区周边的部分肝细胞胞浆 中亦呈阳性表达，而远离病变的肝细胞无表 达，推测这部分“特化一的肝细胞也是删Ｐ＿１３ 和ＴＩ肝一ｌ酶蛋白的来源之一，尽管肝细胞不 是ｍ乎和ＴＩ肝的主要细胞来源，但考虑到肝
理气化痰祛瘀中药抗非酒精坳鼢峨大鼠
脂质过氧化损伤的研究
组（Ｍ组）２２只，复方黄芪颗粒高剂量组（ＦＨ
组）２２只，复方黄芪颗粒低剂量组（ＦＬ组）
２２只，复方鳖甲软肝片治疗组（Ｒ组）２２只，
正常对照组（Ｃ组）２０只。肝纤维化模型的
建立参考Ｐａｒｏｎｅｔｔｏ等的方法，除正常对照 组，其余４组大鼠腹腔内注射无菌猪血清 Ｏ．５ｍ１／只，每周２次，共１０周，建立免疫损 伤性肝纤维化模型，正常对照组以生理盐水 替代猪血清注射。造模结束后，ＦＨ组给予 ３．７８∥Ｋｇ．ｄ（相当于临床成人每日用量的２ 倍）灌胃，ＦＬ组给予１．８９９／Ｋｇ．ｄ（相当于临
略呈椭圆型，推测为活化的肝星状细胞
表达增强，同时ＴＩ肝一１表达减弱的结果使局
部游离删Ｐ—１３的浓度势必会超过其抑制物 ＴＩ肝一１的浓度，并解除ＴＩＭＰ－１对＾彻ｋ１３酶 活性的抑制作用，从而更有效地发挥ＥｃＭ降 解作用。Ｒ组也有较一致的结果，与赵景１报 道较一致。以上提示复方黄芪颗粒可增强 Ｍ即一１３的表达，同时抑制ＴＩ肝一１的表达， 促进Ｉ、Ⅲ型胶原的降解，达到抗肝纤维化 作用，其疗效与复方鳖甲软肝片无显著性差 异，且高低剂量之间比较无显著性差异。 此外，为防止长期药物灌胃引起大鼠肝 脏药物毒性损害，复方黄芪颗粒高剂量组给 予的治疗剂量仅相当于临床成人每日用量的 ２倍，高剂量复方黄芪颗粒未能提高抗肝纤 维化疗效可能主要与药物剂量偏低有关。
复方黄芪颗粒抗肝纤维化机制的实验研究
北京解放军３０２医院张驶李筠赵景民周光德潘登孙艳玲赵雨来杨建法
肝纤维化（１ｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）为诸多慢 性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理组 织学改变，是影响慢性肝病预后的重要环节。
果。复方黄芪颗粒是我科的科研制剂。由黄
芪、丹参、制何首乌、虎杖等１０味中药组成， 具有健脾补肾、疏肝活血、清热利湿之功效， 临床观察能有效地抑制乙肝病毒复制，改善
二抗、三抗工作液；ＤＡＢ显微镜下控制显色； 苏木素衬染细胞核。结果阳性染色呈棕黄色。
大鼠肝纤维化模型的制备及分组给药
ＳＤ雄性大鼠１０８只随机分成５组，模型
２．４免疫组化染色阳性细胞计数判定标准
每张切片组织选取４个角加中央区（排 除边缘效应）在２００×视野下计数阳性细胞 数，取其平均数表示每只大鼠肝组织内阳性 细胞数，每组大鼠肝组织内阳性细胞数以Ｘ ±ＳＤ表示。 ２．５统计学处理
近年来中医中药，特别是中药复方抗肝纤维
化的临床以及实验研究取得了另人瞩目的成
肝功能。本研究是进一步探讨其有无抗肝纤
１８０
维化作用及作用机制。 １材料 １．１实验动物 ＳＤ雄性大鼠１０８只，清洁级，体重（１１０ ±１０）ｇ，购自北京维通利华有限公司。
床成人每日用量）灌胃，Ｒ组给予０．５４９／Ｋｇ．ｄ （相当于临床成人每日用量）灌胃，Ｍ组以
情况，通过噻唑蓝发现，与Ｏ．５ ｍ∥Ｌ顾铂组
和１．Ｏ ｍｇ／Ｌ顺铂组比较，２００ ｍｇ／Ｌ膈下逐 瘀汤组的细胞抑制率介于０．５ ｍｇ／Ｌ顺铂组和
１．０
ｍｇ几顺铂组之间。通过ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔｔｉｎｇ发现，与空白对照组比较，２００ ｍｇ／Ｌ
膈下逐瘀汤组、Ｏ．５ ｍｇ／Ｌ顺铂组和１．Ｏ ｍｇ／Ｌ
顺铂组均能促进ＰＴＥＮ蛋白的表达水平，且

及Ｃ组给予等体积的生理盐水灌胃。分别于 造模结束时、药物治疗第１个月、第２个月
和第３个月结束时，每组随机断头处死５只
１．２猪血清
实验用无菌猪血清购自中美合资兰州民 海生物制品有限公司。 １．３试剂 兔抗大鼠基质金属蛋白酶ＭＭＰ一１３、其酶