第五章 种子扩大培养

菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结团 菌丝粘壁
影响种子质量的因素
原材料质量 培养温度 湿度 通气与搅拌
斜面冷藏时间 培养基 pH
原材料质量

原材料质量波动引起种子质量不稳定 原材料质量波动的主要原因：无机离子 含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+ 能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少 也会影响孢子的质量）。
第五章 发酵工业的种子制备
本章内容
种子制备的目的与要求 种子制备举例 种子制备技术
影响种子质量的因素
种子扩大培养的目的与要求
种子扩大培养的概念:
种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻 干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜 面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩 大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
利用孢子作为接种物

在固化的培养基上产生孢子
“滚瓶”技术应用于产黄青霉的孢子生 产
在固体培养基上产生孢子



在谷类的颗粒表面形成大量的孢子
在液体深层培养基中产生孢子 灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明在良好的 通气条件下，培养基中含氮是在0.05～0.1％ （w/v）之间时，可以产生大量的孢子
培养温度


温度过低，菌种生长发育缓慢
温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时，孢子 接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨 基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
湿度
湿度低，孢子生长快； 湿度大，孢子生长慢
制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时 发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下 部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速 蒸发呈干瘪状，孢子稀少。
通气与搅拌

足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高 种子的质量 搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度 搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶易 氧化变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能 耗。 丝状微生物不宜剧烈搅拌。


斜面冷藏时间
对孢子的生产能力有较大影响
冷藏时间越长，生产能力下降越多
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
二、实验室阶段
1、培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终 的培养物可分为两类：
对于不产孢子和芽孢的微生物
——获得一定数量和质量的菌体
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培 最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培 养。
对于产孢子的微生物
获得一定数量和质量的孢子 菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种 子，但操作繁琐。 获得一定数量和质量的菌丝体

最初采用纯种进行酵母发酵并设计出酵母繁 殖流程，他将每一步的接种量规定为10％， 并控制繁殖条件与酿造时一致 现代的流程中，接种量为1%或更低，控制的 条件也与酿造时不同。

面包酵母时的种子扩大培养的程序
丝状真菌发酵的种子扩大培养
丝状真菌既可以利用孢子，也可以利用菌丝 体作为接种物接种到发酵罐进行发酵
种子的质量要求 菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 Ⅲ—Ⅳ期 青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期， 4-6期合成青霉素的能力最强
第二节 种子制备的技术概要
一、种子制备的过程
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常 见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此形象 地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。 生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般归为发酵车间管 理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
三、生产车间阶段
1、培养物的选择原则
在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。
菌丝体比孢子要有利：

缩短发酵时间
有利于获得好的发酵结果
2、培养基选择的原则
目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应 首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所 以营养要比发酵培养基丰富。
在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于 发酵培养基，这有两个方面的原因:
便于操作，但需要更仔细的控制。
2、培养基选择的原则 培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基 应该是有利于孢子的生长。 在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小， 因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较 精细。
3、起始接种物的传代问题
细菌
保藏斜面 → 活化斜面
产孢子
发酵级数确定的依据


级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难， 一般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常 重要的一个方面。


级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并可减少种
子罐污染杂菌的机会，减少消毒及值班工作量， 减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动。
3.
二级种子(种子罐) 培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为2.5%
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
种子的质量要求：
108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列
PH 7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2
这些纯种培养物称为种子。
种子扩培的目的
接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求：
总量及浓度能满足要求
生理状况稳定，个体与群体 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染
菌种适应性强，能保持稳定的生产能力
1、斜面 (AS1.299) 培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2 培养条件：32℃，生长18-24小时
麦汁
10% 0.5% 2% 22-28%
3、发酵级数的确定
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次数。 一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。 谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵 青霉素：三级发酵
一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
4、接种量的确定
移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为 7-15%。但是一般认为大一点好。
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。 倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
5、种龄 种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种 子罐或发酵罐时的培养时间。
培养基

培养种子的目的：


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扩大培养，增加细胞数量；
同时也必须培养出强壮、健康、活性高的
细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快
速生长。
种子培养基特点

有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足 氮源和生长因子，无机氮源比例大；

各种营养物质的浓度不必太高； 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源； 应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
活力旺盛
二、青霉素生产的种子制备
制备过程
安培管
→ 斜面孢子 → 大米孢子
→ 二级种子 → 发酵
→ 一级种子
1、斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
2、大米孢子
培养基：大米及氮源（玉米浆）
培养条件：25℃、7天，控制湿度
培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当（要求大米 的白点小）有利于孢子的生长。 大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子
3、一级种子 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 培养条件：27℃，40小时 接种量：200亿孢子/吨
目的：长菌体
4、二级种子 培养基：同上 培养条件：27℃、10-14小时 接种量：10%

pH

选择最适种子培养pH的原则是获得最大比生 长速率和适当的菌量

培养最后一级种子的培养基的pH应接近于发 酵培养基的pH，以便种子能尽快适应新的环 境
种子质量的控制措施

菌种稳定性的检查

测定其生产能力，从中挑选高产菌株， 并及时对退化菌种进行复壮

提供适宜的生长环境 种子无杂菌检查，保证纯种发酵。 种子液生化分析项目主要有：营养基质的消 耗速度、pH变化、溶氧变化、色泽和气味等
丝状真菌的菌丝体作为接种物

不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作 为接种物，如生产赤霉素的菌种—— 藤仓赤霉

问题：难以获得均一的接种物
接种前将菌丝打成碎片，形成大量的 菌丝段，它具有大量的生长点
放线菌发酵时的种子扩大培养

斜面培养，制备孢子悬浮液作初级种子 可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子
本章小节：
种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较 大，但是最终由实验结果定。
嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好
6、种子的质量要求：
量：要求达到一定的浓度
质: 形态(生长处于某个阶段、均匀等）、 理化指标（C、N、P的含量）、pH、酶活等 无污染
种子异常分析
保藏 → 母斜面 → 子斜面
目的：使菌种的传代次数尽可能的少。
孢子培养
母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。
子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。
接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落 ②接种时密一点，得到大量的孢子。
孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月
种子制备的放大原理与技术

细菌发酵时的种子扩大培养； 细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的是为 了获得大量的活力强的种子 ； 种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种物含 大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期

举 例：
梭状芽孢杆菌发酵丁醇－丙酮时种子扩大培养的程序
酵母发酵时的种子扩大培养

酿酒酵母的扩大培养
一是成本
二是驯化
例：柠檬酸发酵
以蔗糖为原料
成分 麦芽汁 蔗糖 NH4NO3 K2HPO4 MgSO4.H2O KCl 琼脂
斜面 麦汁
种子罐
发酵
2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025%
20% 0.11% 0.025% 0.015%
2%
薯干粉
成分
斜面
种子罐
发酵
麦芽汁 薯干粉 (NH4)2SO4 琼脂
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细 生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml, 32℃培 养12小时。
培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基
理解种子扩培的目的和要求
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念 掌握控制种子质量的基本方法和手段