种子扩大培养

常用的连续培养方法有： 恒浊法 恒化法


恒浊法 是以培养器中微生物细胞的密度为 监控对象，用光电控制系统来控制流入培 养器的新鲜培养液的流速，同时使培养器 中的含有细胞与代谢产物的培养液也以基 本恒定的流速流出，从而使培养器中的微 生物在保持细胞密度基本恒定的条件下进 行培养的一种连续培养方式。 用于恒浊培养的培养装置称为恒浊器



微生物发酵中，所消耗的底物主要用于3个 方面： 合成新的细胞物质 合成代谢产物 提供能量
●按产物的生成与微生物生长关系的动力学模式分为三种类型
(a)：相关联型，产物的形成速度与细胞的比生长速度成正比，因此要 提高产物的形成速度就应当努力获得高的细胞的比生长速度 (b)：部分关联模式：取决于有关联和无关联的两种形式。
实验室阶段
培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终 的培养物可分为两类： 对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体 对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的孢子，获得一定数量和质量 的菌丝体

斜面培养基接种法 用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。 操作方法： 1、 以无菌操作法用接种环挑取单个菌落，自斜面底向上 划一直线，然后再从底向上轻轻来回作蜿蜒划线。 2、 管口通过火焰，塞上棉塞，接种环烧灼后方可放下。 置37℃温箱孵育18-24小时，取出观察斜面上菌苔生长情况。
补料分批培养
在分批培养过程中补入新鲜的料液， 以克服营养不足而导致的发酵过早结 束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液 的取出，所以发酵结束时发酵液体积 比发酵开始时有所增加。在工厂的实 际生产中采用这种方法很多。
补料分批培养的优缺点
优点 在这样一种系统中可以维持低的 基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应； 可以通过补料控制达到最佳的生长和产物 合成条件；还可以利用计算机控制合理的 补料速率，稳定最佳生产工艺。 缺点 由于没有物料取出，产物的积累最 终导致比生产速率的下降。由于有物料的 加入增加了染菌机会
培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当（要求大米 的白点小）有利于孢子的生长。 大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子
一级种子 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 培养条件：27℃，40小时 接种量：200亿孢子/吨
目的：长菌体
二级种子 培养基：同上 培养条件：27℃、10-14小时 接种量：10%
当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓 度达到一定程度，细胞开始分裂，这 时细胞生长很快，比生长速率几近常 数。这个时期称为对数生长期
随着细胞生长，培养液中的营养物减少， 废物积累，导致细胞生长速率下降，进 入减速期和稳定期。最后当细胞死亡速 率大于生成速率，进入死亡期
代谢产物合成与微生物生长的关系


影响种子质量的因素

原材料质量
一般情况：培养基糖分相对要少，氮源要多，无 机盐所占的比例要大。种子罐和发酵罐培养基 成分趋于一致也有好处，种子很快适应，但各 成分的数量根据目的各自确定。

培养条件
如温度、PH值、湿度、培养时间和冷藏时间等 都影响种子质量。
种子质量的控制

菌种的稳定性检查与复壮
优良种子应具备的条件



活力强 生理状态稳定 菌体数量浓度达到要求 无杂菌污染 适应性强，能保证稳定生产
种子质量的判定



通常测定的参数包括 pH 培养基中营养物质的含量 菌丝形态、色泽、浓度 酶活，溶解氧，尾气等
实验室制备阶段

实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为 培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂 这些培养过程一般都在菌种室完成，因此 将这些培养过程称为实验室阶段的种子培 养。
培养物的选择原则：
在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌 丝体。
菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
种子扩大的级数



指制备种子需逐级扩大培养的次数，需要 根据菌种的生长繁殖速率，发酵罐的容积 综合确定。 一级种子二级发酵：谷氨酸棒杆菌 二级种子三级发酵：青霉菌 三级种子四级发酵：灰色链霉菌
无杂菌检查

青霉素生产的种子制备
制备过程
安培管
→ 斜面孢子 → 大米孢子
→ 二级种子 → 发酵
→ 一级种子
斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等
培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
大米孢子 培养基：大米及氮源（玉米浆）
培养条件：25℃、7天，控制湿度
种子扩大培养
种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻 干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管 斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐 逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯 种过程。这些纯种培养物称为种子。


种子扩大培养应根据菌种的生理特性， 选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数 量足够的种子。 培养良好的种子接入发酵罐后，将使发 酵生产周期缩短，设备利用率提高。种子 液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作 用。
发挥菌种的最大生产潜力要考虑
菌种本身的代谢特点：生长速率、呼吸 强度、营养要求（酶系统）、代谢速率 菌代谢与环境的相关性：温度、pH、渗 透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等
微生物代谢是一个复杂的系统，它的 代谢呈网络形式，比如糖代谢产生的 中间物可能用作合成菌体的前体，可 能用作合成产物的前体，也可能合成 副产物，而这些前体有可能流向不同 的反应方向，环境条件的差异会引发 代谢朝不同的方向进行。
种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和 控制，并可减少由于多次移种而带来染菌 的机会。但也必须考虑尽量延长发酵罐生 产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长 而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生 产率。
种龄与接种量

种龄：种子的培养时间。
接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体 积的比例。 双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。 倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分 来源于发酵罐。
(c) ：无关联模式：产物的形成速度与生长速度无关联，而只与细胞的 浓度有关。
生长相关型

指产物的生产与细胞的生长密切相关，产 物的生成是微生物主要能量代谢的直接结 果。 产物通常为细胞生长必须的初级分解代谢 产物，如葡糖酸等

生长部分相关型


产物是能量代谢的间接结果，不是底物的 直接氧化产物，产物的生成与细胞生长部 分偶联。 主要有柠檬酸、氨基酸发酵
非生长相关型

产物的生成与能量代谢没关系，与细胞生 长也无直接关系，产物均为次级代谢产物， 细胞进入稳定期后产物才开始大量合成。 在基质消耗和菌体生长后，菌体利用中间 代谢反应来形成产物。

分批培养的优缺点
优点 操作简单，周期短，染菌机会少，生 产过程和产品质量容易掌握 缺点 存在底物抑制或限制问题，对于底物 类型及初始浓度敏感的次级代谢物就不适用， 设备利用效率较低，产率不高。
生产车间种子的制备

孢子或摇瓶菌丝在实验室中制备好后，即 可转移到种子罐中扩大培养。
种子罐的作用是使有限的数量的孢子或菌 丝生长繁殖成大量的菌丝体。 种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其 原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、 玉米浆、磷酸盐等，同时还需供给足够的 无菌空气，并不断搅拌


生产车间阶段
种子的质量要求
菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小 空孢，处于Ⅲ—Ⅳ期
青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期， 1-4为年青期，4-6期合成青霉素的能力最 强
发酵动力学

分批发酵动 力学
微生物生长分为：迟滞期、对数 生长期、稳定期和死亡期
在迟滞期，菌体没有分裂只有生长， 因为当菌种接种入一个新的环境， 细胞内的核酸、酶等稀释，这时细 胞不能分裂。
源自文库
半连续培养
在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵 液（带放）称为半连续培养。 优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液， 使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，提 高了总产量。 缺点 代谢产生的前体物被稀释，提取 的总体积增大
连续培养
发酵过程中一边补入新鲜料液一边放 出等量的发酵液，使发酵罐内的体积 维持恒定。 达到稳态后，整个过程中菌的浓度， 产物浓度，限制性基质浓度都是恒定 的。

连续发酵的优点：
在发酵达到稳定后，其非生产时间大大减 少，设备利用效率高，生产能力大，产品 质量较稳定，工艺易于实现自动化 缺点：染菌和菌种退化


如果不发生污染杂菌，不出现菌种退化， 连续培养是不是能一直生产下去？
发酵过程工艺控制的目的
有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生 长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来 目标是得到最大的比生产速率和最大的生 产率

用恒浊法连续培养微生物，可控制微生物 在最高生长速率与最高细胞密度的水平上 生长繁殖，达到高效率培养的目的

恒化法是通过控制培养基中营养物，主要 是生长限制因子的浓度，来调控微生物生 长繁殖与代谢速度的连续培养方式。用于 恒化培养的装置称为恒化器。恒化连续培 养在研究微生物利用某种底物进行代谢的 规律方面被广泛采用。因此，它是微生物 营养、生长、繁殖、代谢和基因表达与调 控等基础与应用基础研究的重要技术手段。
因此对发酵过程的了解不能机械的，割裂的 去认识，而要从细胞代谢水平和反应工程水 平全面的认识 微生物的生长与产物合成有密切相关性，不 仅表现在菌体量的大小影响产物量的多少， 而且菌体生长正常与否，即前期的代谢直接 影响中后期代谢的正常与否。特别是对于次 级代谢产物的合成更具有复杂性
发酵过程受到多因素又相互交叉 的影响如菌本身的遗传特性、物 质运输、能量平衡、工程因素、 环境因素等等。因此发酵过程的 控制具有不确定性和复杂性。