实验四 超氧化物歧化酶测定
4氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力
氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：植物叶片。
（二）仪器设备：高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx），试管或指形管数支，黑色硬纸套。
（三）试剂（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。
[0.2M的Na2HPO491.5mL和NaH2PO48.5mL混合后稀释4倍]or[0.05mol/L PBS缓冲液（pH7.8）：7.1g/L ，6.8g/LKH2PO4，按体积9:1混合，如pH高或低于7.8，则用KH2PO4或Na2HPO4调节。
每1000mL缓冲液含8gNaCl，0.2gKCl] 提取介质：内含1%聚乙烯吡咯烷酮的上述缓冲液。
（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。
（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液（NBT）：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
（4）100µmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。
（5）20 µmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存，现用现配。
超氧化物歧化酶的活性测定
超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
离子(O2-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。
由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。
最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。
每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。
第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。
[原理]SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。
其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。
在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。
其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。
化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。
SOD
实验四植物中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化一、实验目的1通过超氧化物歧化酶的分离纯化，了解有机溶剂沉淀蛋白质以及纤维素离子交换柱层析方法的原理。
2掌握测定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。
二、实验原理（一）SOD的性质超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。
SOD金属蛋白酶，对pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。
它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn—SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn—SOD)和铁超氧化物歧化酶(Fe—SOD)。
SOD催化如下反应： O2-+ O2-+2H+一H202+O2（二）SOD的分离提取蛋白质包括酶的分离纯化方法很多，主要有：①根据蛋白质溶解度不同的分离方法，蛋白质的盐析、等电点沉淀法、低温有机溶剂沉淀法；②根据蛋白质分子大小的差别的分离方法，透析与超滤、凝胶过滤法；③根据蛋白质带电性质进行分离，电泳法、离子交换层析法。
④根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法。
1、酶的提取纯化：在分离制备时首先将植物细胞破碎，用提取液制备粗酶液。
经加热变性、有机溶剂沉淀除去大量杂蛋白，再用DEAE-纤维素柱层析或DEAE-葡聚糖柱层析纯化，可得到更纯的酶。
经过以上分离纯化步骤后，酶可提纯100倍以上。
大部分酶都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用水溶液提取分离和纯化酶。
稀盐和缓冲系统的水溶液对酶稳定性好、溶解度大,是提取酶最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于酶的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数酶的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使酶变性失活，因此，基于这一点考虑提取酶时一般采用低温（5℃以下）操作。
超氧化物歧化酶活性的测定
植物组织中超氧化物歧化酶和平测定方法【实验目的】1. 了解还原法测定抗氧化酶活性测定的原理方法。
2. 熟悉植物叶片中ROS 去除机制。
【实验原理】超氧化物歧化酶（SOD ）普遍存在于动植物与微生物体内。
SOD 是含金属辅基的酶。
高等植物有两种类型的SOD ：Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 。
SOD 能够清除超氧阴离子自由基 （O 2—），它与CAT 、POD 等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对机体的毒害。
超氧阴离子自由基（O 2—）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
SOD 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H 2O 2和O 2。
生成的H 2O 2可被过氧化氢酶分解为O 2和H 2O ：2 O 2—+ 2H + H 2O 2+O 2 2 H 2O 2 O 2+H 2O超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般用间接方法测定SOD 活性。
本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。
有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下还原。
被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2—。
当加入NBT 后，在光照条件下O 2—又可将NBT 还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大光吸收。
当加入SOD 时，SOD 可通过清除O 2—，而抑制NBT 的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。
于是，进行光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶的活性越低，反之酶的活性越高。
抑制NBT 光还原的相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。
常常将抑制50%的NBT 光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U ）。
【器材与试剂】 1. 实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、微量移液枪、刻度移液管、离心管、光照箱（光照度为4000lx ）、容量瓶（10ml ）、试管2. 实验试剂50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）； 130mmol/L 甲硫氨酸（MET ）溶液； 750μmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液； 100μmol/L EDTA- Na 2溶液；CATSOD20μmol/L 核黄素溶液；SOD 提取介质：50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）内含1% PVP 。
超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法
超氧化物歧化酶（SOD ）活性的测定方法
一、试剂
1. 0.1mol/L HCl
2. 10mmol/L HCl
3. 0.1mol/L Tris 标准溶液：12.114g 三羟甲基氨基甲烷溶于蒸馏水，并定容至1000ml.
4. 50mmol/LTris 缓冲溶液：50ml0.1mol/L Tris 标准溶液中加入0.1mol/L HCl 19.9～22.0ml,定容至100ml ，PH 为8.20。
5. 30mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液：3.7833g 邻苯三酚溶于10mmol/LHCl 中，并用10mmol/LHCl 定容至1000ml.
二、仪器
1. 紫外分光光度计
2. 酸度计
3. 恒温水浴锅
三、操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率测定
在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris 缓冲溶液，于25℃保温20min,加入10～20ul 30mmol/L 邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm 下，每隔1min 测吸光值一次，空白以10mmol/L HCl 代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min 左右。
%1004
min 1min 5⨯值值－第第自氧化速率＝OD OD 2.SOD 活性测定
将样液加入到Tris 缓冲溶液中，其余步骤同自氧化速率测定方法。
活力单位定义：将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量定义为一个单位（u ）。
样品质量样液体积样品稀释倍数自氧化速率速率自氧化速率－样液氧化＝活力（⨯⨯⨯⨯5.4%50%100)/SOD ml u。
0101.超氧化物歧化酶(SOD)-NBT法--分光计
超氧化物歧化酶（SOD）-NBT法（酶标仪48T）（1）检测原理：超氧化物歧化酶（SOD）（EC 1.15.1.1）在动植物、微生物和培养细胞体内广泛存在，其具有抗衰老、提高机体对多种疾病的抵抗力，能增强机体对外界环境的适应力。
本实验是NBT法测定SOD活性，NBT可以和黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XO)催化产生的超氧化物阴离子(O2.-)反应产生有颜色物质，后者在560nm处有吸收；SOD 可清除O2.-，从而抑制有色物质形成；反应液颜色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。
1①组织样本：取约0.1g组织（水分充足的样本可取0.25g），加入1mL提取液，在4ºC或冰浴进行匀浆(或使用各类常见匀浆器)。
4ºC×12000rpm离心10min，取上清作为待测液。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取②细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为500~1000：1的比例进行提取。
③液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测①可见分光光度计预热30min以上，调节波长至560nm，蒸馏水调零。
②测定前将试剂一、三和四25℃水浴5min以上。
③试剂四每次加样前务必混匀，保证试剂的均一性。
④在1mL玻璃比色皿（光径1cm）中依次加入：【注】：1、若样本量较多，测定前可将试剂一、三和四按照240μL:60μL:320μL比例混成一个混合液（需依据当次检测的样本数量混合对应的试剂量），每管务必最后一步加620μL该混合液。
2、样本对照管*：提取后样本颜色较深的，一定要做此管，否则抑制率偏低，即SOD活性偏低。
超氧化物歧化酶活性的测定
超氧化物歧化酶活性的测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物体内一种重要的抗氧化酶，它能够将有害的超氧自由基（superoxide radical, O2•⁻）转化为氧和过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2），从而防止细胞和组织受到氧化应激的损伤。
因此，超氧化物歧化酶活性的测定对于研究氧化应激与各种疾病的关系具有极大的重要性。
超氧化物歧化酶活性的测定方法有多种，以下主要介绍两种常用的方法：一、停止法停止法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，用发生超氧自由基的化学反应（如PMS-NADH系统）制造超氧气自由基以模拟体内超氧自由基的生成，观察并测定经超氧化物歧化酶处理后剩余的超氧自由基量的下降速率，通过计算算出SOD活性。
步骤：1、准备试剂：PMS（N-甲基-苯肼）溶液、NADH（辅酶Ⅰ）溶液、EDTA-Na2溶液、碳酸氢钠-硫酸溶液、紫外分光光度计。
2、制定反应液：取适量PMS溶液和NADH溶液加入缓冲液中，使最终浓度分别为100μM和780μM，混匀。
3、制备样品：用生理盐水或缓冲液将要测定的样品进行稀释，并在4℃下保存备用。
4、制备标准品：以SOD标准品（0-10U/mL）为浓度系列，每组分别加入50μL的样品和反应液，在37℃水浴中反应30min。
5、反应终止：以碳酸氢钠-硫酸溶液均匀混合停止反应。
6、测定吸光度：用紫外分光光度计测定反应液的吸光度，波长设置在340 nm。
7、计算超氧化物歧化酶活性：计算标准品的反应速率（Vx）和酶反应的反应速率（Vt），按照以下公式计算超氧化物歧化酶活性：SOD活性（U/mL）=（Vt–Vx）/Vx×标准品的酶活力二、降解法降解法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，将超氧自由基产生物质注入试管中，随着时间的推移，样品中的超氧自由基将越来越少。
超氧气自由基和非酶物质将通过电子色谱法被检测和测量。
1、制备反应液：将样品加入含有相应浓度的降解剂中，使反应液中超氧气自由基的浓度达到稳定状态。
超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
胞外抗氧化酶类酶活力的测定
原理:在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,并产生O2-,在SOD存在下,自氧化反应受到抑制。
参考邻苯三酚测活法(Marklund 法)孙 [66]，按下表加入0.1M Tris-HCl（PH 8.0,内含1mM EDTA）和ddH2O，25℃恒温水浴20 min，加入1 mL 待测液后加入25℃预热的邻苯三酚溶液，摇匀，立即于320nm测吸光值A320，每0.5 min测定一次，持续测到5 min。
邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活力
酶活力的定义为：温度25 ℃，pH 8.0，波长320 nm处，在每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量为1个酶活力单位，酶活力按下式计算。
单位菌体SOD酶活力（U/g）=
1
-
50%
A A
V N V A
V W
∆∆
⨯⨯⨯∆
⨯⨯
邻菌
邻
A∆
邻:1分钟邻苯三酚自氧化时A320的变化量；A∆
菌：加入待测液后1分钟邻苯三酚氧化
时A320的变化量；V：待测液总体积；N：待测液稀释倍数；V0：加入的待测液的体积;W:菌体重；V1：反应总体积。
超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
超氧化物歧化酶（SOD）活力测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。
这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。
近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。
过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。
自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。
生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。
植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。
抗坏血酸（VC ）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。
SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。
自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。
二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。
超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。
如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。
H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。
超氧化物歧化酶SOD活性测定
Fe-SOD的活性中心 是由一个铁离子构成 的。
Mn-SOD的活性中心 是由一个锰离子构成 的。
03
SOD活性测定的方法
化学发光法
总结词
灵敏度高、检测范围广
详细描述
化学发光法是一种通过化学反应产生光子的方法，其灵敏度高，可以检测到超低浓度的超氧化物歧化 酶活性。该方法具有较宽的检测范围，适用于不同来源和不同浓度的超氧化物歧化酶活性测定。
3
反应时间
根据实验要求，控制反应时间，以便准确测定酶 活性。
数据处理与分析
数据记录
01
详细记录实验过程中的数据，如反应速率、吸光度等。
数据处理
02
对记录的数据进行适当的处理，如计算酶活性、绘制图表等。
结果分析
03
根据实验结果，分析超氧化物歧化酶的活性变化，并得出结论。
05
SOD活性测定的应用
医学领域
SOD活性测定可以用于某些疾 病的辅助诊断和防治。例如， 在一些疾病中，SOD活性可能 会降低，导致生物体抗氧化能 力下降，加速细胞损伤。通过 对SOD活性进行测定，可以为 疾病的诊断和防治提供依据。
药物研发与评价
SOD活性测定可以用于药物研 发和评价。一些药物可能会影 响SOD活性，通过对SOD活性 进行测定，可以评估药物对生 物体抗氧化系统的影响，从而 为药物研发和评价提供参考。
电化学法
总结词
快速、便携
详细描述
电化学法是一种通过测量电化学信号来测定 超氧化物歧化酶活性的方法。该方法具有快 速、便携的特点，适用于现场检测和实时监 测。电化学法可以通过设计不同的电极和电 化学反应，实现对超氧化物歧化酶活性的快 速、准确测定。
04
SOD活性测定的实验步骤
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高级植物生理实验报告植物抗性生理农学院农药学东保柱20132020542013年12月27日实验1 超氧化物歧化酶（SOD ）活性和丙二醛含量的测定（操作步骤）1 试剂配制1.1 磷酸缓冲液 (PBS) 配制注：配成PBS2000ml ，其中1000ml 用于A 液配制，另1000ml 用于酶液制备。
1.2 其它溶液配制2 酶液制备称取植物材料１g ，加少许0.05mol/L 、pH7.8的磷酸缓冲液在冰浴中研磨，最终定容制得10 ml 匀浆。
转移至10ml 离心试管中，在3000 rpm 下粗离心１分钟，粗提液再转移至2个5ml 离心管中，在冷冻离心机13000g 、４℃下离心20分钟，上清液即为酶液，用于SOD 活性和丙二醛含量的测定。
3 丙二醛含量测定吸取酶液２ml →加入Ｆ液２ml →沸水浴加热15分钟(呈粉红色)→快速冷却→4000rpm 下离心５分钟。
若以种子为材料，则加热后溶液混浊，需增加离心力。
以Ｆ液为参比液，分别在532nm 和600nm 处测定光密度值。
丙二醛含量（nmol ·g -1）＝式中：V/v --- 提取液总量(10ml)／测定液用量(2ml)R --- 反应液总量(４ml)Ｗ --- 植物材料鲜重或干重(g)0.155 --- 丙二醛的摩尔浓度消光系数(当[MDA]=1nmol/ml 时,OD 532-OD 600=0.155)[即( OD532—OD600) / 0.155的单位为1nmolMDA / ml ]室温下处理的叶片在523nm出的光密度值室温下处理的叶片在600nm出的光密度值室温下丙二醛含量（nmol·g-1）=-0.0022+0.039/0.155×4×10/2×1=4.75 nmol·g-1 冷处理下的叶片在523nm出的光密度值室温下处理的叶片在600nm出的光密度值冷处理下丙二醛含量（nmol·g-1）=0.077-0.026/0.155×4×10/2×1=6.58 nmol·g-14 超氧化物歧化酶活性测定4.1 操作及说明* 仪器调零液中的“酶液”0.1ml，可以取对照植株的，也可以取胁迫植株的。
(2)将试管置于阳光下反应15分钟（NBT还原产物为蓝色），然后在560nm下测定光密度(OD560)。
(3)若样品反应后蓝色很浅或无，则须减少酶液用量后，再重复上表步骤；若样品反应后蓝色极深或与无酶液同，则须增加酶液用量后，再重复上表步骤。
4.2 计算1个酶活单位定义: SOD抑制NBT还原50% 时的酶液用量(ml)。
SOD活性(u/g)＝式中：u --- 1个酶活单位 (ml)V --- 提取液总量 (10 ml)v --- 测定酶液用量 (0.1 ml)Ｗ --- 植物材料鲜重或干重 (g)5 问题与讨论5.1在自然光照下，蓝色几乎立即生成，至15分钟时基本稳定。
但随照光时间延长，酶会失活，蓝色渐退。
故照光时间以15 分钟为好，不宜再长。
5.2 光质、光强、时间、温度、试管质地等因素均对结果产生影响，应尽量保持一致。
5.3 酶液用量应使处于合适范围之内，否则须加调整（见4.1(3)）。
5.4 酶液在反应液中所占比重较小，对OD影响也小。
但如果浑浊、有色，则需考虑其影响。
实验2 游离脯氨酸含量的测定（茚三酮法）（操作步骤）1 药品配制1.12.5%的酸性茚三酮试剂：称取2.5g茚三酮→加入60 ml冰醋酸→加入40 ml 6 mol／L的磷酸→加热溶解→冷却贮于棕瓶中备用。
（85％的浓磷酸约为14.6 mol／L）。
1.2 3%磺基水杨酸：称取3g 磺基水杨酸，溶于100 ml蒸馏水中。
2 标准曲线绘制称取0.025 g 脯氨酸，定容于500 ml 蒸馏水中，配成浓度为50μg ／ml 的脯氨酸母液。
按下表绘制标准曲线： 用微量取样器取母液 (μl) ０ 100 200 300 400 500 用微量取样器取水 (μl) 1000 900 800 700 600 500 配成1ml Pro 标准液浓度(μg/ml) 0 5 10 15 20 25 加入冰醋酸 （ml ） 1 1 1 1 1 1 加入茚三酮 (ml) 2 2 2 2 2 2 加入水杨酸 (ml) 1 1 1 1 1 1 显色液Pro 浓度 (μg ／ml)12345在沸水浴中加热显色50分钟→冷却至室温→测定ＯＤ５２０光密度 (ＯＤ５２０)，以水为参比液3 游离脯氨酸测定3.1提取：称取0.5g 植物材料→剪碎后放入试管中→加6ml 3%磺基水杨酸→在沸水浴中提取10分钟 → 3000rpm 离心5分钟。
上清液为脯氨酸提取液。
3.2测定：提取液１ml →冰醋酸１ml →茚三酮２ml →水１ml →沸水浴中加热显色50分钟→冷却至室温→比色测定ＯＤ５２０(以蒸馏水为参比液)→查标准曲线得样品中Pro 浓度。
4 计算脯氨酸含量 (μg ／g) ＝Wv V V C 21⨯⨯⨯式中：Ｃ --- 样品比色液的脯氨酸浓度 (μg ／ml)，由基于脯氨酸显色浓度的标准曲线查得。
Ｖ1 --- 样品研磨或煮沸提取液总量 (本实验中6 ml) Ｖ2 --- 显色反应液 (本实验中５ml)v --- 样品测定汲取液 (本实验中１ml) Ｗ --- 植物材料重量 (g) 次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 ＯＤ５２０ 0.036 0.370 0.352 0.350 0.350 0.363 0.373 0.362 0.362 0.373脯氨酸含量 (μg ／g) ＝Wv V V C 21⨯⨯⨯=C次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值 ＯＤ５２０ 0.858 0.858 0.869 0.858 0.844 0.858 0.846 0.859 0.858 0.858 0.857脯氨酸含量 (μg ／g) ＝Wv V V C 21⨯⨯⨯=C5 问题讨论5.1若植物材料加热显色后溶液浑浊，可用4ml 甲苯萃取，然后比色(标准曲线也相同)。
5.2植物样品取样量应视脯氨酸含量而定，并根据经验进行调整，使样品OD 位于标准曲线范围之内。
5.3公式中没有包含萃取液量(4ml)。
若样品测定与标准曲线不同，则必须在计算公式中予以相应表示。
实验3 过氧化物酶活性的测定（比色法）一、原理过氧化物酶广泛分布于植物各组织中。
过氧化物酶与植物的呼吸作用、光合作用以及生长发育密切相关。
在H2O2存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成的棕红色产物可用比色法予以测定。
O-CH3 O-CH34 - O –CH3 + 4H2O2 =-O-O-O-CH3 O-CH34邻甲氧基苯酚 + 4H2O2＝ 4-邻甲氧基苯酚 (棕色)(愈创木酚) (过氧化氢) （测定波长470nm）二、仪器药品1、仪器：分光光度计、离心机、计时秒表2、药品：愈创木酚(4邻甲氧基苯酚)30% 过氧化氢20 mmol／L KH2PO4100 mmol／L 磷酸缓冲液，pH6.03、反应混合液配制：100 mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）＋ 28μl 愈创木酚＋ 19μl 30% 过氧化氢配成液贮于棕瓶中在冰箱中保存。
三、操作步骤1、酶液制备：称取植物材料1g，加入20 mmol/L KH2PO4 2ml，研磨匀浆，转移至离心管中，再加入3ml KH2PO4 冲洗研钵一并转入离心管。
以4000rpm离心10分钟。
上清液即为过氧化物酶制备液，贮藏于冰箱冷藏室中备用。
2、试剂加入：取2支小试管，按下表加入各试剂：* 此2ml酶制备液必须在仪器调整好之后进行！3、仪器调节：将分光光度计波长调节至470nm ；将上表中的调零液倒入比色杯中，放入仪器中，调节仪器零点和100%。
4、酶液加入、计时和读数：吸取酶制备液2ml ，加入到2号试管中，立即摇匀并同时开启秒表计时，然后迅速将试管中溶液倒入比色杯中并放入仪器中。
读取30-180秒钟之间的光密度值，每30秒钟读取1次。
实验结果统计3.1丙二醛含量测定 丙二醛含量计算公式：室温下丙二醛含量（nmol ·g -1） 如下表所示：冷冻过程会使植物体内的丙二醛含量迅速上升，植物体内的丙二醛含量和植物的抗寒性密切相关表1 丙二醛含量3.2 超氧化物歧化酶活性测定如图所示，外界条件变化时无论冷处理或者热处理过氧化物歧化酶的活性都会降低，冷处理和热处理与对照之间均存在显著性差异，冷处理热处理之间不存在显著性差。
从结果不难看出外界条件不适宜植物生长时，植物体内超氧化物歧化酶活性会降低。
DO 平均值 丙二醛含量（nmol/g ）室温600 -0.039 4.75B 室温523 -0.0022 冷冻600 0.026 6.58A冷冻5230.077图1 不同处理的过氧化物歧化酶活性3.3过氧化物酶活性测定过氧化物酶活性以单位样品重量每分钟吸光度变化率表示，即：。