酶工程酶的分离纯化优秀课件

一、材料预处理及细胞破碎
材料预处理：酶蛋白在细胞内外的分 布有三种情况：胞外酶，胞内酶（溶 酶和晶酶）。
微生物胞外酶 可以用盐析或有机溶剂沉
淀等从发酵液中沉淀成酶泥
胞内酶 要先收集菌体，经细胞破
碎后提取
动物材料 应先剔除结缔组织和脂肪
组织等
植物材料 应去皮等以免单宁等物质
着色污染
细胞破碎： 物理和化学两大类方法
（II）自溶
向菌体中加入醋酸乙酯，甲 苯，乙醚以及氯仿，使细胞渗透 性改变保持一定时间后可以使细 胞自溶；
（III）酶处理
用溶菌酶专一性地分解原核微生 物细胞壁，使胞内酶释放
（IV）表面活性剂
膜结合的晶酶在细胞破碎后 很难溶解，常借助于表面活性剂 与脂蛋白形成微泡，使之溶解。
二、抽 提
—大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此， 可用稀盐、稀碱或稀酸的水溶液进行 抽提；
酶的比活力是酶纯度的量度，是 指单位重量酶蛋白所具有的酶活力， 单位为IU/mg。比活力越大，酶纯度 越高。
酶活力的测定方法：
１终止反应法 ２和连续反应法。
终止反应法
在恒温反应系统中，每隔一定时间， 取出一定体积的反应液，用强酸强碱或 SDS以及加热等使反应立即停止，然后用 化学法、放射性化学法或酶偶联法分析产 物的形成量或底物的消耗量。这是最经典 的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以 根据这一原理设计出具体的测定方法。
盐的选择
——大多数酶在低浓度的盐溶液 中有较大的溶解度，一般选 择等渗盐溶液，如0.02-0.05 mol/L的磷酸缓冲液或0.15 mol/L的NaCl等。
温度的选择
——一般控制在0-4 0C，如果酶 比较稳定可以例外。
抽提液用量 ——常采用材料量的1-5倍
其它
——加入蛋白酶抑制剂、半胱 氨酸或细胞色素C等，来 稳定抽提系统。
1、物理破碎：
—研磨（手磨，球磨和石磨）， —机械捣碎（匀浆器和高速组织 捣碎器等）， —高压法， —爆破性减压法， —专用波振荡， —快速冷冻融化法等。
2、化学破碎：
—渗透作用 —自溶： —酶处理 —表面活性剂
（I）渗透作用
将指数生长期的菌体用缓冲液洗 净，并悬浮于含蔗糖和EDTA的稀Tris 缓冲液中，离心，加入 MgCl2剧烈搅 拌，可使一些水解酶从细胞内释放出 来。
三、酶溶液的絮凝、净化与脱色
絮凝
——由于发酵液黏度较大，细胞表面电荷排 斥以及多糖蛋白质等大分子物质形成的 水化层等给酶溶液的离心或过滤带来困 难；因此要用絮凝剂进行处理。
——絮凝剂：多种类型 无机：如醋酸钙和磷酸钙等 有机：如聚丙烯酰胺等 天然高分子：如壳多糖等
—抽提液的具体组成和抽提条件的选 择取决于酶的溶解性、稳定性以及有 利于切断酶与其它物质的连结。
1、提取的主要方法：
（1）盐溶液提取 （2）酸溶液提取 （3）碱溶液提取 （4）有机溶剂提取
2、酶提取过程的注意事项
——pH的选择 ——盐的选择 ——温度的选择 ——抽提液用量 ——其它
pH的选择
——首先考虑酶的稳定性；其次应 远离等电点；一般选择pH4-6 为宜。
细胞破碎 碎片分离
路线一A
溶解(加盐酸胍、脲) 复性
粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 纯化(层析、电泳)
脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤)
精制(结晶、干燥)
第二节 酶溶液的制备
酶溶液的制备：
把酶从生物原料中抽提出来，作 成酶溶液
酶溶液的制备包括：材料预处理 及细胞破碎、抽提、净化脱色、抽体 液的浓缩等几个步骤。
酶工程酶的分离纯化优秀课件
酶分离纯化的目的
酶分离纯化的目的是使酶制剂 产品达到应用所需的纯度。
分离纯化过程包括3个基本步骤：
1 抽提 2 纯化 3 制剂
Crude product concentration versus selling price (Dwyer, 1984)
某些生化物质在原料液中的 浓度与价格的关系(1984年)
蛋白质 不可逆失活
重金属离子 和巯基试剂
变性剂 热
机械力 冷冻和脱水
辐射作用
蛋白质的稳定化
蛋白质稳定化
如何防止蛋白质的可逆伸展
蛋白质稳定化途径
如何防止蛋白质不可逆失活反应发生
稳定蛋白质（酶）的方法
酶分离的一般流程
原料液
细胞分离(离心，过滤)
路线一 细胞－胞内产物
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
物质名 尿激酶 荧光素酶 胰岛素 头孢菌素 乙醇
浓度(C) 510－5 810－3 410－1
10 1102
价格(P，＄) 3108 2106 9104 102 310－1
在分离纯化中必须注意：
1 防止酶的变性失活； 2 在分离纯化过程中的每一步都
应检测酶的活性，以确定酶的 纯化程度和回收率。
第一节 酶活力的测定
几个名词 1 酶活力或酶活性 2 酶活力单位 3 mol催化活性（分子活性）和转换 数（催化中心活力) 4 酶的比活力
酶活力（又称酶活性） (enzyme activity)（IU/g或IU/mL)
指酶催化一定化学反应的能力；用在 一定条件下，所催化的反应初速度来表示； 是研究酶的特性，酶制剂生产应用以及分 离纯化时的一项必不可少的指标。
mol催化活性是指单位时间内，每个酶 分子所转换的底物分子数目；转换数（Kcat) 是指酶分子中每个活性中心所转换的底物分 子数目。如果酶分子中只有一个活性中心， 那么mol催化活性与转换数相等，如果酶分 子中含有n个活性中心，那么转换数则为mol 催化活性除以n 。
酶的比活力 （specific activity)
连续反应法
无须终止反应，而是在酶反应过 程中用光化学仪器或电化学仪器等来 监测反应的进行情况，对记录结果进 行分析，然后计算出酶活力。
酶不可逆失活的原因和机理
蛋白质（酶）的失活机理
蛋白质不可逆失活的原因
脲和胍 高浓度盐 螯合 有机溶剂
蛋白酶水解 或自溶作用
聚合作用
极端pH 氧化作用
表面活性剂 和去垢剂
酶活力单位(enzyme activity unit)
表示酶活力大小的尺度； 一个国际单位（IU）是指在特定条件 下（25 0C），每分钟内转化1mol底物或 催化形成1mol产物所需的酶量 一个Kat是指每秒钟内转化1mol底物 所需的酶量，1 Kat = 6107 IU。
mol催化活性（分子活性Biblioteka Baidu和 转换数（催化中心活力）