PCR反应及琼脂糖电泳实验报告

实验原理:

多聚酶链式反应（PCR 扩增DNA 片段及

琼脂糖凝胶电泳产物检测

一、实验目的:

1、 了解PCR 技术的基本操作

2、 理解PCR 的原理

3、 讨论PCR 的应用

PCF 是 一种在体外模拟细胞内环境进行迅速扩增

DNA 片段的技术，这一技术需要模板、

四种脱氧核苷酸等组分条件外，还需要不同温度环境以进行

DNA 的解旋和聚

1、PCR 反应组分

细胞内DNA 复制条件分析:

条件

参与的组分

在DNA M 制中 的作

用

实验条件/材 料

模板

DNA 的两条单链

提供复制的模

板

模板DNA

原料

四种脱氧核苷酸

合成DNA 子链 的

原料

dNTP mixture 酶 DNA 聚合酶 催化合成DNA 子

链

Taq DNA 聚合 酶

酶

解旋酶 打开DNA 双链 温度控制

引物

一小段单链DNA 或

RNA

为DNA 聚合酶提供 合成的3 '端起点

引物I 引物II

此外，试验中用到的还有 Mgcl2， Mg2+能激活酶的活性；10* Buffer 缓冲液，为 Taq

酶提供合适的PH 条件。

2、PCR 反应条件

PCR 利用了 DNA 的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合， 现在使用的PCR

仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。

PCR —般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤——变性、复性和延伸。

(!)变性(模板DNA解旋)

模板DNA经加热至90 C以上。一定时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便

于它与引物结合，为下轮反应作准备。

(2) 复性(退火)

模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50C左右，引物与模板 DNA单链的互补序列

配对结合。

(3) 延伸

DNA模板-引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板, 按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。

3、PCR产物的检测

(1) 紫外分光光度计

DNA在 260nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，可以通过与蒸馏水的对比进而计算扩增出 DNA的含量。

(2) 琼脂糖凝胶电泳

DNA在电厂作用下，可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与 DNA片段的长度成负

相关，与电压强度成正比，因此可以分离不同长度的DNA在有DNAmarker (不同已知碱基

对大小的DNA片段的混合物)的条件下，由于不同碱基大小的DNA片段在琼脂糖凝胶上涌动的速度不同，因此电泳完毕后会出现在胶块的不同位置。通过将扩增出的 DNA片段与已知的

条带做比较，可以大概推测出该片段的碱基对的大小。如果要进一步检测其大小，可以换另外规格的DNA marker继续电泳。核酸荧光染料可以与 DNA嵌合，一起电泳，DNA图谱观察仪可以激发特

定的蓝色光源，荧光染料在该光照射下可见到荧光，荧光的亮度与DNA大小成正比。

三、实验仪器及试剂

7种PCF组分微量可调移液器离心管PCR仪水平电泳槽电泳仪电源紫外分光光度计250ml锥形瓶（封口膜）记号笔卫生纸

四、实验步骤

1、DNA体外扩增

（1）将所有试剂管瞬时离心一次（4000r/min,1min ），使管壁没有残留药品，在引物 I和引物II的离心管内用移液器各加入 40ul双蒸水（ddHO），混匀后瞬时离心一次。所有的离心管都摆到双面板上。

原有的Taq DNA聚合酶有15ul，此时混合液体系共计500ul,此步骤由第一、二组同学合作完成。（在实验老师的监督指导下操作，确保此后其他同学的实验顺利进行）

（3）共分25组，第一、二组的同学并入其他小组进行实验。每组取20ul的上述混合液于0.5ml 的离心管中，加入15ul的液体石蜡封闭体系，以防止在加热过程中蒸发。

（4）对自己组的离心管上进行标记之后，放到PCF仪上进行DNA扩增。

2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA

（1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。

（2）配制浓度为1%（ 1 g/100 mL ）的琼脂糖凝胶2块。在锥形瓶中，称取 1g的琼脂糖粉，加入100ml 1x电泳缓冲液，用封口膜封住瓶口后在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，

然后冷却至60 C,倒入电泳槽中（每块胶50ml），插好梳子，待其凝固。（电泳槽首先用

透明胶带将两端封住再进行倒胶）

（3）待胶凝固后，去掉胶带纸，小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。将倒胶槽至于水平电泳槽内，梳井（点样孔）一端朝负极方向。向电泳槽中缓缓倒入 1x 电泳缓冲液，以没过胶面2 mm为宜。

（5）将 80ul 的 6xLoading Buffer 加入到 80ul 的核酸荧光染料中，按 1:1 比例混合。

（6）移液器枪头插入到扩增出的样品离心管的底部，吸取20ul 样品于另一 0.5ml 的

离心管中，注意不要吸到液体石蜡，再加 1ul 的染料混合液，充分振荡混匀。用移液器吸取 10ul 缓慢加入梳井内，枪头抵到梳井口，以防止样液被缓冲液冲散，此外，为防止手抖将凝胶破坏，可以用左手扶住右手的手腕。

（6）盖上电泳槽盖，接通电源，电压为80 V ，电流最大。

（7）当指示剂移动到凝胶中间时，断开电源，终止电泳。

（8）取出凝胶块，在 DNA图谱观察仪中观察电泳带及其位置，判断扩增产物的情况。

3、紫外分光光度计检测DNA含量

（1）最后 1 组取 2ulPCR 反应液，加入 98ul 蒸馏水，将样品稀释 50 倍。

（2 ）以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。

（3）加入DNA稀释液100ul至比色杯中，测定 260nm处的光吸收值。

（4）根据下面的公式计算 DNA含量：

DNA含量（ul/ml ）=50*（ 260nm的读数）x稀释倍数

五、注意事项

1 离心机上盖没有锁，在离心机运转时，转速最高可达 16000r/min ，如果这时打开离心机

上盖，里面的离心管就会甩出，对人身造成危险，切忌等全部停下来之后再打开上盖取出离心管。

另外，离心管一定要对称放置。

2 水平电泳槽在电泳时一定要盖上上盖，此时的缓冲液电压可以达到80V,大大

超过了人体的安全电压，切忌不能用手触碰缓冲液或者是电源两端接头。