改性处理对花生蛋白致敏性的影响

基础研究　食品研究与开发　Ｆｏｏｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　２０１１年４月　

第３２卷第４期　

改性处理对花生蛋白致敏性的影响　王烁　。吴海文　，邱志龙　，汝海健　。高美须　，李淑荣　，’　（１．中国农业科学院农产品加工研究所，农业部农产品加工与质量控制重点开放实验室，北京１００１９３；　２．沈阳产品质量监督检验院，辽宁沈阳１１００２２）　

摘要：通过检测花生蛋白ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳及免疫印迹图谱研究不同改性处理对花生蛋白致敏性的影响。结果表　明，物理方法及化学方法虽然能降低一定的致敏性，但效率不高。经转谷氨酰胺酶处理后６３．２、５３．２、４７．４、４１．６　ｋｕ的　致敏蛋白含量及致敏性随加酶量的增加而降低。　关键词：改性；花生；致敏蛋白　

Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ　Ｐｒｏｐｅｒｔｙ　ｏｆ　Ｐｅａｎｕｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ＷＡＮＧ　Ｓｈｕｏ　，ＷＵ　Ｈａｉ－ｗｅｎ　，ＱＩＵ　Ｚｈｉ－ｌｏｎｇ２，ＲＵ　Ｈａｉ－ｊｉａｎ　，ＧＡＯ　Ｍｅｉ－ｘｕ　，ＬＩ　Ｓｈｕ—ｒｏｎｇ　，　（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏ—ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ａｎｄ　Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００１９３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｈｅｎｙａｎｇ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ　１　１００２２，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｎ　ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｐｅａｎｕｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｂｙ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅａｎｕｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　ｐａｔｔｅｒｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒｉｔｙ　ｏｆ　ｐｅａｎｕｔ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｋｅｐｔ　ｓｔａｂｌｅ　ａｇａｉｎｓｔ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ．Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ　ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　６３．２，　５３．２，４７．４　ａｎｄ　４１．６　ｋｕ　ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｇｒａｄｕａｌｌｙ．　Ｋ　ｙ　ｗＯｒｄｓ：ｍｏｄｉ　ｅｄ；ｐｅａｎｕｔ；ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　

食物过敏是食品安全的重要研究内容之一，引起　国内外食品安全专家的高度关注。花生作为我国重要　的油料和经济作物之一，是人们主要的食物来源和重　要的食品加工原料。据报道花生过敏占食物过敏的　１０％～４７％【１］，由于各民族的遗传因素的差异和饮食习　惯的不同，引起过敏反应的原因也有所不同。流行病　学研究表明在美国约有０．６％的人群，英国约有０．５％　的人群对花生过敏翻。在中国，对９６例过敏性皮炎的　诱因分析发现，其中１２．５％是由食物过敏引起的，而　对３２例进行体外ＩｇＥ检测发现６－３％对大豆／花生过　敏［３１。但国内在花生致敏方面的研究较少，至今少有人　做过系统的研究。　蛋白质改性是人为地对蛋白质结构进行修饰，从　基金项目：中国农业科学院院所创新基金　作者简介：王烁（１９８３一），女（汉），助理工程师，硕士，主要从事生物　化学及食品辐照技术的应用和研究。　通信作者　而改善产品的相容性和功能性。与蛋白质改性方法相　类似，花生蛋白中过敏原的去除可根据原理不同，分为　物理法、化学法、生化法、酶法、基因工程方法和育种学　方法等，在食品领域中主要采用物理法、化学法和酶　法。为保证花生制品的安全性，本研究采用的物理法　主要涉及了加热、机械作用、声波、微波等方式，化学法　主要是采用还原剂对蛋白进行结构修饰，酶法主要采　用转谷氨酰胺酶对蛋白进行改性处理。本文通过ＳＤＳ—　ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ免疫印迹判断致敏蛋白分　布及致敏性的变化，探讨花生致敏蛋白的物化性质，　旨在获得低致敏性的蛋白质，为花生脱敏方法的建立　提供理论参考。　

１材料与方法　１．１材料与仪器　花生浓缩蛋白：中国农业科学院农产品加工研究　所，农业部辐照产品监督检验测试中心实验室自制；花　２　王烁，等：改性处理对花生蛋白致敏性的影响　基础研究　生过敏患者血清（７例，中国医学科学院附属北京协和　医院变态反应科）；转谷氨酰胺酶：ＴＧａｓｅ，１００　Ｕ／ｇ，江　苏泰兴一鸣生物制品有限公司。　ＡＥ一８１３０型电泳仪、ＡＥ一６４５０型垂直电泳槽、ＡＥ一　６６７５＆ＡＥ一６６７５１　型转移电泳槽：日本ＡｑＴＯ公司；　ＫＱ一２００ＶＤＢ型双频数控超声波清洗器：昆山市超声　仪器有限公司；ＨＭＳ一３５０小型旋涡振荡器：天津市恒　奥科技发展有限公司。　１．２实验设计　１．２．１物理处理　１）热处理　８％的花生浓缩蛋白溶液，８０℃水浴６　ｒａｉｎ，冷却　至室温，冷冻干燥。　２）高速搅拌　８％的花生浓缩蛋白溶液，１２　０００　ｒ／ｒａｉｎ搅拌６０　Ｓ，　冷冻干燥。　３）超声辐射　８％的花生浓缩蛋白溶液，悬浮液置于超声波发　生器内，超声仪探头浸入液面２　ｅｍ，１　０００　Ｗ超声　６　ｒｎｉｎ，冷冻干燥。　４）微波辐射　８％的花生浓缩蛋白溶液，功率８００　Ｗ微波辐射　３０　Ｓ，冷冻干燥。　１．２．２化学处理　１）还原剂一１处理　９．６％的花生浓缩蛋白溶液（ｐＨ７．０）５　ｍＬ，加入　１　ｍＬ０．６２５　ｍｍｏｌ／Ｌ的还原剂一ｌ溶液，３０　ｃｃ振荡９０　ｒａｉｎ，　冷冻干燥。　２）还原剂一２处理　９．６％的花生浓缩蛋白溶液（ｐＨ７．０）５　ｍＬ加入试　管中，加入１　ｍＬ　０．７５　ｍｍｏｌ／Ｌ的还原剂一２溶液，３０℃　振荡１２０　ｍｉｎ，冷冻干燥。　１．２．３酶处理　花生浓缩蛋白溶于ｐＨ７．０的Ｎａ２｝｛ＰＯ　一ＮａＨ　ＰＯ　缓冲液中，配制成ｌ５％（ｇ／ｍＬ）的溶液，搅拌２　ｈ，每克　蛋白质分别添加１、２、３、４、５、７．１５、８．７５、１２．５、１６．２５、　１８．８１Ｕ转谷氨酰胺酶，５０℃反应１　ｈ，保鲜膜封口，９０℃　下处理１５　ｍｉｎ，流动水快速冷却，４℃冰箱保存１４　。　１．３方法　１．３．１花生浓缩蛋白的制备　以脱脂花生蛋白粉为原料，料液比１：１１（ｇ／ｍＬ），　３６　８５％乙醇浸提６０　ｍｉｎ；１　５００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ；　沉淀用８倍９７．５％乙醇，３８　ｑＣ浸提３０　ｍｉｎ，１　５００　ｒ／ｍｉｎ　离心１０　ｍｉｎ去除上清液，４０℃鼓风干燥９０　ｍｉｎ，得花　生浓缩蛋白（ＰＰＣ）。　ｌ－３．２花生粉中蛋白的提取　花生粉２．０　ｇ溶解于４０　ｍＬ　０．０ｌ　ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ７．２的　ＰＢＳ缓冲溶液中，振荡提取２　ｈ，于４℃离心（１５０００　ｒ／ｒａｉｎ，　１５　ｍｉｎ），取上清液待用，即花生粉溶液。　１．３．３酶处理后花生粉中蛋白的提取　酶处理后花生粉２．０　ｇ，溶解于４０　ｍＬ　０．０１　ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ８．８的Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲溶液中，振荡２　ｈ，９　０００　ｒ／ｍｉｎ　４℃离心２０　ｍｉｎ，取上清液待用。　１．３．４酶活力测定　酶活力测定采用ＳＢＦＦ　１０３１７—１９９９蛋白酶活力测　定法。　１．３．５　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳　１）十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳法（ＳＤＳ—　ＰＡＧＥ），１３．５％分离胶，５％浓缩胶。　２）将花生蛋白溶液与２￣ＳＤＳ样品缓冲液混合，煮　沸，离心数秒，静置。　３）将处理过的样品和标准分子量Ｍａｒｋｅｒ用微量　加样器加到梳孑Ｌ中。　４）１２０　Ｖ恒压电泳，至溴酚蓝前沿到达凝胶下边　界，停止电泳，取出凝胶，固定染色。　１．３．６电转移（半干式）　１）将硝酸纤维素膜作上标记，与ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶　的大小一样。再将大小相同的６张滤纸每３张一组，分　别浸泡在阳极及阴极电极缓冲液中。　２）将电泳完毕的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶取下，放入电转　缓冲液中平衡２０　ｍｉｎ　３０　ｍｉｎ。按以下顺序铺于阳极　上：３层阳极滤纸一ＮＣ膜一凝胶一３层阴极滤纸，轻轻　压紧“凝胶三明治”，盖上盖子，降低并锁定负极。　３）定流９６ｍＡ，ｇｅｌ，电转移２．０ｈ。　４）电转移结束后，ＮＣ膜用丽春红溶液染色５　ｍｉｎ，　脱色５　ｍｉｎ，观察转印效果及蛋白质位置，进行免疫　印迹。　１．３．７免疫印迹　１）转印后的ＮＣ膜漂洗，封闭。　２）ＮＣ膜与合适浓度的第一抗体（１：２．５～１：５）室温　下孵育过夜。　３）ＮＣ膜与合适浓度的ＨＲＰ（辣根过氧化物酶）标　记的鼠抗人ＩｇＥ（酶标记过的ｌ：２００稀释）于３７℃孵　育２　ｈ。　４）漂洗后的ＮＣ膜浸没在底物溶液中显色，待蛋　白带显色清晰，终止反应。　５）用去离子水冲净ＮＣ膜，夹于双层滤纸中风干　保存　基础研究　王烁，等：改性处理对花生蛋白致敏性的影响　１．３．８　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ结果分析　采用Ｆｌｏｕｒ　Ｃｈｅｍ　Ｖ　２．０凝胶成像分析软件（Ａｍｅｒｉｃａ）　分析。　７例血清与花生蛋白反应变化程度基本相同，仅　以其中最为明显一例进行说明。　２结果与讨论　２．１物理处理对花生致敏蛋白的影响　物理及化学处理对花生致敏蛋白的影响见图ｌ。　Ｍ　Ｐ　ｌ　２　３　４　５　６　７　Ｍ　ｌＪ　１　２　３　４　６　（ａ）　（ｂ）　Ｍ．低分子量标准蛋白；Ｐ．花生蛋白粉；０．花生浓缩蛋白；１．热处理；　２．高速搅拌；３．超声辐射；４．微波辐射；５．还原剂一１处理；６．还原剂一２　处理；７．花生浓缩蛋白。　（ａ）ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳罔，（ｂ）Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ印迹图。　图１物理及化学处理对花生致敏蛋白的影响　Ｆｉｇ．１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｈｙｓｉｃｓ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｎ　ａｌｌｅｒｇｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｐｅａｎｕｔ　从图１中可看出，花生蛋白粉出现２０余条深浅　不一的蛋白区带，分子量主要介于１４．６　ｋｕ～９６．９　ｋｕ之　间。其中有１０条带蛋白含量较多，分子量分别为６３．２、　３７．５、３４．３、３０、２３．６、２２．５、２０．２、１８．６、１７．６和８．１９　ｋｕ，又　以６３．２、２０．２、１８．６、１７．６和８．１９　ｋｕ等５个区带蛋白　含量最丰富。据报道，食物过敏原为具有酸性等电点　的蛋白质或糖蛋白，分子量在１０　ｋｕ￣７０　ｋｕ阁。研究中发　现有６３．２、５３．２、４７．４、４１．６、３９．３、３４．３、３０．０、２３．６、２０．２、　ｌ８．６、１７．６和１４．６　ｋｕ，共ｌ２条蛋白带的分子量与花生　致敏蛋白相近嘲。　对于过敏原为蛋白质的食品，高温处理会破坏蛋　白质空间构象，进而会＿定程度的降低食品的致敏　性。例如，病人对冻干的蛋清蛋白过敏，却对经过烹调　的蛋清蛋白不过敏用。高速搅拌过程中，高速剪切作用　使蛋白质大分子聚集体破碎，即打断蛋白分子间的较　弱的作用力，如氢键，范德华力等，同时增加原先包埋　在分子内部的致敏基团的暴露机会，从而有可能改变　花生蛋白的致敏性。此外，Ｒｙｏ　Ｎａｋａｍｕｒａｌｍ￣１］用超声波　处理浸泡过的大米，结果去除了９０％的致敏蛋白，而　其他蛋白没有明显损失。超声波在介质中传播时，会　产生热效应，机械效应或空化效应，引起介质的一些特　性发生改变。但从图１可以看出，热处理、高速搅拌、超　声辐射对花生致敏蛋白分子量及致敏性均无明显影　响，与Ｒｙｏ　Ｎａｋａｍｕｒａ等研究的结论有所不同，这可能　与原料有关。　由图１可知，微波辐射未改变花生致敏蛋白的分　子量分布，但明显降低了６３．２、３０　ｋｕ蛋白的致敏性。微　波能是一种由离子迁移和偶极子转动而引起分子运　动的非离子化辐射能，当它作用于分子时，可促进分子　的转化运动，产生键的振动、撕裂和粒子间的摩擦和碰　撞，并迅速生成大量的热能，促使分子间和分子内部的　非共价键，一ｓ—Ｓ一等断裂，部分包裹于分子内部的不溶　性蛋白分子释放出来并扩散至溶剂中，蛋白的游离巯　基含量和表面疏水性指数增大，从而使蛋白的致敏性　发生一定程度的改变。　２－２化学处理对花生致敏蛋白的影响　二硫键存在时，致敏蛋白具有致敏性。二硫键被　硫氧降解为硫氢基后，致敏蛋白的致敏性就会消失。　Ａｍｉｎｌａｒｉ　Ｍ等在研究中发现在蛋白中添加一定量的还　原剂，例如ＮａＳＯ　和Ｃｙｓ（半胱氨酸），是改变二硫键从　而改善蛋白ＰＤＩ的有效方法。Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ　Ｄ等在研究　中也得出了类似的结论。由于ＮａＳＯ，和Ｃｙｓ都是对二　硫键有特异性的还原剂，因此一些学者将这一结果解　释为还原剂的使用打破了蛋白中的二硫键，也就是说，　导致蛋白质溶解度下降的原因是二硫交联。因此，本　研究也考察了还原剂的添加对蛋白致敏性的影响，试　图利用还原剂处理蛋白来降低其致敏性，但从图ｌ中　可以看出，还原剂一１及还原剂一２都未改变花生致敏　蛋白的分子量分布。　总体来讲，物理方法及化学方法虽然能降低一定　的致敏性但效率不高。蛋白分子上的抗原决定簇（表　位）有空间表位和线性表位２种，物理及化学２种变性　方式只在一定程度上破坏了空间表位，但线性表位却　很难遭到破坏。　２．３酶处理对花生致敏蛋白的影响　利用微生物或酶制剂催化蛋白质发生化学反应　属于生物改性，可以改变蛋白质的基本结构，同化学反　应相比它的反应专一、条件缓和、易于控制，越来越受　到人们的重视。转谷氨酰胺酶是一种可以导致蛋白质　（或多肽）之间发生共价交联形成共价化合物的聚合酶。　酶处理对花生致敏蛋白的影响见图２。　从图２可以看出，随转谷氨酰胺酶加酶量的增　加，中低分子量的蛋白逐渐聚合成大于１７５　ｋｕ的蛋　白，６３．２、５３．２、４７．４、４１．６　ｋｕ的致敏蛋白含量及致敏性