高效液相色谱法32h2
【论文】高效液相色谱法检测植物激素方法的建立
摘要植物激素是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的几类微量有机物质。
也被称为植物天然激素或植物内源激素。
它们在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养等方面，分别或相互协调地调控植物的生长、发育与分化。
由于它在植物体内含量甚微，一般水平为1000 ng/g鲜重，建立一种有效，简便的检测方法对于研究植物激素具有指导性意义。
目前植物激素的定性和定量分析主要以理化方法为主，理化测试法包括气相色谱法、液相色谱法、气象－质谱联用等。
本次研究是利用高效液相色谱法来检测植物体内的酸性激素，即吲哚乙酸IAA,吲哚三丁酸IBA，赤霉素GA3,以及脱落酸ABA。
以HPLC进行分析测试，非常适合用于分析那些不能汽化或者在易于裂解不稳定的物质，用HPLC分析植物激素（IAA、IBA、GA3、ABA），采用二极管阵列检测器检测，本次研究的前处理方法为固相萃取法。
通过本次实验，得到了一种简便易操作的前处理方法，找到了液相色谱的最佳工作条件，并通过检测实际样品，证明了该方法是一种有效可行的植物酸性激素的定性定量分析方法。
关键字：植物激素，提取，高效液相色谱。
AbstractPlant hormone is several kinds of trace of organic matter that synthesized in the plant,and it have significant effect on plant growth. They separately or coordinatively regulate of plant growth, development and differentiation. Because it is a trace contect in plants and general level, 1000 ng / g in fresh weight. Therefore, the establishment of an effective and simple detection method for the study of plant hormones is very significant.Present plant hormones qualitative and quantitative analysis mainly based on physical and chemical methods, physical and chemical testing methods including GC, HPLC, GC-MS.with high performance liquid chromatography, the acidic hormones of IAA, indole-3 butyric IBA, gibberellic acid GA3, and ABA in plants are detected. It is suitable for the analysis of those which do not vaporize easily at high temperatures by HPLC. Analysis of plant hormones (IAA, IBA, GA3, ABA), usually use UV monitor testing, and this study of pre-treatment method for solid phase extraction.A simple and easy pre-treatment methods was established, and found the best conditions for liquid chromatography.With detecting the actual samples, Iit shows that it is the feasible and effective method of the acidic hormones analysis .Key words: plant hormones, extraction, detection, HPLC.目 录第一章 前 言 (1)1.1 植物激素的研究背景与意义 (1)1.2 植物激素的种类及性质 (1)1.2.1植物激素概述 (1)1.2.2植物激素——生长素 (2)1.2.3植物素——赤霉素 (3)1.2.4植物激素——细胞分裂素 (4)1.2.5植物激素——脱落酸 (4)1.2.6植物激素——乙烯 (4)1.3液相色谱法的研究 (5)1.3.1液相色谱仪 (5)1.3.2 液相色谱法的主要类型 (8)第二章 实验材料与方法 (11)2.1仪器与试剂 (11)2.2 实验方法 (11)2.2.1 芽样品激素含量的测定 (12)2.2.2种子样品激素含量的测定 (12)2.2.3 C18柱系统的处理及使用（需临时处理） (12)2.2.4 高效液相色谱分析 (12)2.2.5溶液的配制 (13)2.2.6 标准曲线的测定 (14)2.2.7 稳定性实验 (15)2.2.8回收率的测定 (16)2.2.9 检出限的测定 (16)第三章 实验结果与讨 (17)3.1标准曲线的绘制 (17)3.1.1 IAA标准曲线的绘制 (17)3.1.2 IBA标准曲线的绘制 (17)3.1.3 ABA标准曲线的绘制 (18)3.1.4 GA3标准曲线的绘制 (19)3.2稳定性实验 (20)3.3 实际样品激素含量测定 (21)3.4回收率的测定 (22)3.4.1 GA3回收率谱图 (22)3.4.2 IAA回收率谱图 (23)3.4.3 ABA回收率谱图 (24)3.4.4 IBA回收率谱图 (24)3.5 检出限的测定 (25)第四章 结论 (27)参考文献 (28)致谢 (30)第一章前言1.1 植物激素的研究背景与意义植物激素是存在于植物体内的具有调节植物生长发育作用的微量元素。
hplc高效液相色谱
hplc高效液相色谱HPLC高效液相色谱简介高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），也被称为液相色谱法（Liquid Chromatography），是一种广泛应用于药物分析、环境监测、食品检测等领域的分离技术。
HPLC色谱技术通过物质在液体流动相和固定相之间的相互作用，实现对分子化合物的分离、检测和定量。
相对于传统的柱层析技术，HPLC具有分离效率高、分析灵敏度高、分析速度快等特点，被广泛应用于科学研究和工业生产。
HPLC的基本原理HPLC色谱技术是建立在分配系数理论的基础上。
它通过固定填料上溶解物质与流动相中溶解物质之间的分配与再分配，实现目标化合物在固定相中的分离。
HPLC色谱法的基本步骤包括：样品制备、装柱、选择流动相、进样、洗脱分离、检测及数据处理等。
HPLC的主要组成部分HPLC主要由一系列组成部分组成，包括：溶剂输送系统、无菌进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统等。
其中，溶剂输送系统用于控制流动相的输送速率和压力，确保流动相以一定速率通过色谱柱；无菌进样器用来将样品进样并转送到色谱柱中；色谱柱是分离目标化合物的关键组成部分，根据所分离物质的化学性质和目标要求选择合适的色谱柱；检测器用来检测溶质的浓度，并将信号转换为电信号输出；数据处理系统用来处理和分析检测到的信号，得出结果。
HPLC的种类和应用领域根据不同的分离机制和柱填料，HPLC可以分为很多不同的类型，包括：反相色谱、离子交换色谱、分子筛色谱等。
反相色谱是最常用的一种HPLC技术，其应用领域非常广泛。
例如，在药物研究领域，HPLC被广泛应用于药物分析、药代动力学研究、质量控制等方面。
在环境监测领域，HPLC被用来检测土壤和水体中的有机污染物、重金属和农药等化学物质。
在食品安全检测领域，HPLC被用来检测食品中的添加剂、农药残留和重金属等有害物质。
HPLC的发展和进展自HPLC技术在20世纪60年代首次提出以来，随着科学技术的不断发展，HPLC技术也在不断进步和改进。
高效液相色谱法测定大豆中游离氨基酸含量
高效液相色谱法测定大豆中游离氨基酸含量一、本文概述本文旨在探讨高效液相色谱法（HPLC）在大豆中游离氨基酸含量测定中的应用。
作为一种重要的植物蛋白来源，大豆中的氨基酸组成对于其营养价值及食品工业应用具有重要意义。
游离氨基酸作为大豆蛋白质水解的产物，其含量直接反映了大豆的蛋白质质量和营养价值。
因此，准确测定大豆中游离氨基酸的含量对于评估大豆品质及开发高附加值产品至关重要。
高效液相色谱法作为一种高效、准确的分离分析技术，在氨基酸分析领域具有广泛应用。
本文将详细介绍高效液相色谱法的基本原理、样品处理方法、色谱条件优化以及结果计算与分析等方面的内容，并通过实验验证该方法的可行性和准确性。
本文还将讨论高效液相色谱法在大豆游离氨基酸含量测定中的优势及局限性，以期为相关领域的研究和实践提供有益的参考。
二、实验材料与方法（1）大豆样品：选择新鲜、无病虫害、无杂质的大豆作为实验材料，经过清洗、烘干、破碎后备用。
（2）试剂：实验所需试剂包括高效液相色谱仪用流动相（如乙腈、甲醇等）、衍生化试剂（如OPA、FMOC等）、标准品氨基酸等，均为分析纯或更高纯度。
（3）仪器：高效液相色谱仪（配备紫外检测器或荧光检测器）、离心机、涡旋混合器、水浴锅、移液枪等。
（1）样品处理：称取适量大豆样品，加入适量的水或缓冲液，进行匀浆处理。
然后，将匀浆液进行离心，取上清液作为游离氨基酸提取液。
（2）衍生化处理：取一定体积的游离氨基酸提取液，加入适量的衍生化试剂，进行衍生化反应。
衍生化反应的目的是将氨基酸转化为易于检测的衍生物，提高检测灵敏度和准确性。
（3）高效液相色谱分析：将衍生化后的样品进行高效液相色谱分析。
选择合适的流动相和色谱柱，设置合适的检测波长或激发/发射波长，记录色谱图和峰面积。
（4）数据处理：根据标准品氨基酸的色谱图和峰面积，绘制标准曲线。
然后，根据样品的色谱图和峰面积，结合标准曲线，计算样品中游离氨基酸的含量。
本实验采用高效液相色谱法测定大豆中游离氨基酸的含量，通过样品处理、衍生化处理、高效液相色谱分析和数据处理等步骤，实现对大豆中游离氨基酸的快速、准确测定。
高效液相色谱分析方法及注意事项3
碱性化合物:容易发生拖尾的化合物中通常包 含-NH2、-NHR、-NR2，即伯、仲、叔三种电荷 的极性基团，即伯、仲、叔三种富含电荷的极性 基团，碱性强弱为-NH2 ＜ ＜-NHR＜-NR2 ，其 碱性强弱与N原子直接连接的基团有关：
吸电子基团削弱碱性
供电子基团（如烷基）增强碱性
伯安中甲胺的碱性最弱，pKa为10.64
而pH＜2.5条件下，也仍后拖，因为-NH3足 够强，即使硅羟基以分子状态存在仍能与Si-Oδ-H δ+中氧原子产生吸引作用，导致峰形拖尾。
当pH＞12.64，99%甲胺以分子状态存在，不 会引起拖尾。因此分析有些碱性化合物，流动相 的pH需要调致强碱性条件下峰形才会变好。
3）、增加缓冲盐或增大缓冲盐的浓度
离子状态-N+H3、-N+H2R、-N+HR2，也能与Si-O-
形成较强的静电引力，但三乙胺有先占住位的优 势，使样品与硅羟基的作用大大减弱，缓解了拖 尾的产生；同时N+H（NCH2CH3）3与样品分子 中的极性基团与硅羟基的相 互产生竞争，更进一 步削弱了样品分子与硅羟基的接触机会，改善峰 形。
3）增加流动相中缓冲盐的浓度
可减少因静电的作用（可能存在于样品分子 之间，或样品他子与填料表面之间）引起前拖。
例子如下：
4）流动相中加适入适量的四氢呋喃
加入少量的四氢呋喃可以改善峰形，增大分 离度。通常加入量在5%以内即可，需要时可以加 入更大的量。 机理：很少人提及
5）升高柱温
加入缓冲盐，可增强流动相的离子强度，在NH3+和 Si-O-之间存在着许多离子的干扰，减少了样品分子与 硅羟基之间的互相作用，有助于削弱极性基团与硅羟 基之间的相互作用，改善峰形。 适合于碱性较弱（氨基的N原子与强吸电子基相 连），或碱性很强，但在刚性结构中，比较难以接近 被C18长链和封尾试剂覆盖的硅羟基。 如高乌甲素的测定：
HPLC高效液相色谱法
HPLC高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。
高效液相色谱法有“四高一广”的特点：①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。
②高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。
③高效：分离效能高。
可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。
④高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng,进样量在μL数量级。
⑤应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。
此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。
高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。
在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。
高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。
结构综述高效液相色谱仪可分为“高压输液泵”、“色谱柱”、“进样器”、“检测器”、“馏分收集器”以及“数据获取与处理系统”等部分。
技术动态液相色谱和质谱连接，可以增加额外的分析能力，能够准确鉴定和定量像细胞和组织裂解液，血液，血浆，尿液和口腔液等复杂样品基质中的微量化合物。
环境空气—苯胺的测定—高效液相色谱法
FHZHJDQ0024 环境空气苯胺的测定高效液相色谱法F-HZ-HJ-DQ-0024环境空气—苯胺的测定—高效液相色谱法1 范围进样2.0µL样品洗脱液，检出限为2×10－3µg。
若采样体积80L，样品洗脱体积2mL，取2.0µL进样测定，最低检出浓度为0.025mg/m3，测定范围为0.125～1.25mg/m3。
使用本法所列举的高效液相色谱测试条件，空气中的醇类、胺类、硝基化合物等均无干扰。
2 原理空气中苯胺吸附在硅胶采样管上。
用甲醇洗脱后，经高效液相色谱柱分离，用紫外吸收检测器测定，以保留时间定性，峰高定量。
3 试剂3.1 硅胶：40～60目，需活化处理后使用。
活化处理方法：将硅胶倒入浓硫酸中浸泡过夜，用水洗去酸液至中性为止，倒出水后，将硅胶在90～100℃温度下干燥，再于350℃活化4h，冷后放于干燥器中备用。
3.2 甲醇。
3.3 苯胺：重蒸馏，取180℃馏分液于棕色瓶中。
3.4 标准溶液：在10mL棕色容量瓶中，放人5mL甲醇，盖塞．准确称量。
加入5滴新蒸馏苯胺，盖塞，再准确称量。
两次称量之差．即为苯胺的重量。
然后，用甲醇稀释至刻度，计算1mL溶液中苯胺的含量（mg）。
临用时用甲醇稀释成所需浓度苯胺的标准溶液。
4 仪器4.1 采样管：用长10cm，内径4mm的玻璃管，前段填装600mg硅胶，后段填装200mg硅胶，中间及后端塞人2mm长的玻璃棉。
进气口填放少量玻璃棉。
采样管两端套上塑料帽密封备用。
4.2 空气采样器：流量范围为0.2～1.0L/min。
流量稳定。
使用时，用皂膜流量计校准采样系列在采样前和采样后的流量，流量误差应小于5％。
4.3 具塞试管：5mL。
4.4 微量注射器：50µL，体积刻度应校正。
4.5 高效液相色谱仪，附紫外吸收检测器。
5 采样采样时，取下硅胶采样管两端的塑料密封帽。
将采样管的出气口（硅胶少的一端）垂直接到空气采样器上，以0.8L/min的流量．采气80L。
高效液相色谱实验
实验1气相色谱分析条件的选择和色谱峰的定性鉴定一、目的要求1.了解气相色谱仪的基本结构、工作原理与操作技术；2.学习选择气相色谱分析的最佳条件，了解气相色谱分离样品的基本原理；3.掌握根据保留值，作已知物对照定性的分忻方法。
4.掌握归一化法测定混合物各组分的含量。
二、基本原理气相色谱是对气体物质或可以在一定温度下转化为气体的物质进行检测分析。
由于物质的物性不同，其试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，虽然载气流速相同，各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定时间的流动后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱峰。
根据出峰位置，确定组分的名称，根据峰面积确定浓度大小。
对—个混合试样成功地分离，是气相色谱法完成定性及定量分析的前提和基础。
而其中气相色谱分离条件的选择至为关键。
主要涉及以下几个方面：1.载气对柱效的影响：载气对柱效的影响主要表现在组分在载气中的扩散系数D m(g)上，它与载气分子量的平方根成反比，即同一组分在分子量较大的载气中有较小的D m(g)。
根据速率方程：（1）涡流扩散项与载气流速无关；（2）当载气流速u小时，分子扩散项对柱效的影响是主要的，因此选用分子量较大的载气，如N2、Ar，可使组分的扩散系数D m(g)较小，从而减小分子扩散的影响，提高柱效；（3）当载气流速u较大时，传质阻力项对柱效的影响起主导作用，因此选用分子量较小的气体，如H2、He作载气可以减小气相传质阻力，提高柱效。
2.载气流速（u）对柱效的影响：从速率方程可知，分子扩散项与流速成反比，传质阻力项与流速成正比，所以要使理论塔板高度H最小，柱效最高，必有一最佳流速。
对于选定的色谱柱，在不同载气流速下测定塔板高度，作H-u图。
由图可见，曲线上的最低点，塔板高度最小，柱效最高。
高效液相色谱方法手册
C23 序号
时间
A
B
C24
1
0
25
75
C25
2
50
90
10
C26
3
55
90
10
C27
4
57
25
75
C28
5
65
25
75
C29 炒白芍
14,86
25-35 芍药苷18.4
C30 炒槟榔
45，55
25-35 氢溴酸槟榔碱，19.2
C31 炒苍耳子（苍术苷） 100（17，83） 25-35 苍术苷二钾盐9.8
D19 地榆炭
100（5，95） 25-35 没食子酸，11.5
D20 独活
49,51
25-35 蛇床子素25.8；二氢欧芹醇当归酸酯34.1
D21 杜仲
25,75
25-35 松脂醇二葡萄糖苷22.4
E1 儿茶
45，8，2
35 儿茶素，10.7；表儿茶素15.0
F1 番泻叶
100
40 番泻苷B18.0；番泻苷A32.2
25-35 甘松新酮8.1
G10 甘遂
100（4:96）
25-35 大戟二烯醇，16.4
G11 干姜
40，5，55
25-35 6-姜辣素14.3
G12 高良姜
22.5,22.5,55 25-35 高良姜素48.4
G13 藁本
100 25-35 阿魏酸8.5
G14 葛根
25,75
25-35 葛根素20.2
53，47
25-35 欧前胡素52.1
B6 板蓝根
7，93
25-35 （R，S）-告依春，18.8
目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析
（3）梯度洗脱装置 是在分离过程中使两种或两种以上 不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间比例， 从而使流动相的强度、极性、pH或离子强度相应地 变化，以达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。
梯度洗脱装置分为两类： 一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合， 用高压泵输至柱系统，仅需一台泵即可。 另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增 压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱 系统。 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混 合样品中各组分的 k´ 值，使所有谱带都以最佳平均 k´值通过色 谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温。 所不同的是，在梯度洗脱中溶质 k´ 值的变化是通过洗脱液的极 性、pH值和离子强度变化来实现的，而不是借改变温度（温度 程序）来达到。
选择流动相基本原则： 极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低
极性的流动相。
15-3-4 应用
具有不同官能团• 异构体
邻间 硝硝 基基 苯苯 胺胺
例：几种取代位置不同的硝基苯胺
对
的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺 序：
硝 基 苯
胺
15-4 液液色谱法（LLC）
②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。 等，作为分析时选择余地大；而气相色谱可选择余地小的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于 色谱分离条件的选择。
（3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在 液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。
（4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。 但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂， 价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补 充的。
第3章+高效液相色谱分析
不同待测离子与反离子形成离子对的能力不同， 分配系数存在差异，导致在固定相中滞留时间不同， 从而实现色谱分离。
离子对的容量因子k可表示为：
VS 1 k DX K XY [Y ]水相 VM
则组分的保留时间：
L 1 t R (1 K XY [Y ]水相 ） u
分析实例：
§3-4 液相色谱的流动相
当固定相选定时，流动 相的种类、配比能显著地影 响分离效果，因此流动相的 选择很重要。
1.选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相（防止微量杂质长 期累积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加) 。 （2）避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度。 （4）溶剂的黏度小些为好。 （5）流动相同时还应满足检测器的要求。比如当使用 紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
子或反离子)，加到流动相中与溶质离子结合形成疏
水性离子对，从而控制溶质离子的保留行为。 阴离子分离：对离子常用烷基铵类，如氢氧化十 六烷基三甲铵。 阳离子分离：对离子常用烷基磺酸(己烷磺酸钠)。 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C18 柱)， 含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样
离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-。
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。小分子 可以扩散到凝胶空隙中通过，出 峰最慢；中等分子只能通过部分 凝胶空隙，中速通过；而大分子 被排斥在外，出峰最快；溶剂分 子小，故在最后出峰。 相对分子质量在100～105范围 内的化合物按质量分离。
空间排阻色谱固定相
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构。 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶。 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性 溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；如可控孔径玻璃微球，具有 恒定孔径和窄粒度分布。 化学稳定性，热稳定性好，机械强度大，流动相性质 影响小，可在较高流速下使用。
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3、分离系统-色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定 相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内 衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限， 故金属管用得较多。 一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱 内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm 以上 一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和 分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置 柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再 洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低 的化合物，它们仅占有机物总数的20％。 对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定 性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色 谱法进行分离和分析。 (2) 气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有 亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。 而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液 体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参 与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分 离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条 件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
Fra bibliotek高效液相色谱法分类 1.吸附色谱 用固体吸附剂为固定相，以不同极性溶剂为流动相，依据试样 各组分在吸附剂上吸附性能差异实现分离。 2.分配色谱 用涂渍或化学键合在载体基质上的固定液为固定相，以不同极 性溶剂为流动相，依据试样各组分在固定相中溶解、吸收或吸 着能力差异实现组分分离。 3.离子交换色谱 用含离子交换基团的固定相，以一定pH含离子的溶液为流动 相，基于离子型组分与固定相离子交换能力差异实现组分分离。 4.体积排阻色谱 用化学惰性的多孔凝胶或材料为固定相，按组分分子体积差异， 即分子在固定相孔穴中体积排阻作用差异实现组分分离。
第一节 概述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年 代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断 改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离 分析的重要手段。 它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理 论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、 操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱 法优越性，现从两方面进行比较：
第二节 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪的结构示意如图，一般可分为 以下几个主要部分：高压输液泵，色谱柱，进样器， 检测器，馏分收集器和处理系统。 其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动 相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出 口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液 器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后 依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信 号记录下来，由此得到液相色谱图。
1、高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力 很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。 对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定， 压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一 定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化 无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱 系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分 机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
根据固定相和流动相相对极性的差别，有正相色谱 和反相色谱两种色谱体系。 反相色谱和正相色谱主要区别是流动相和固定相的 相对极性。 反相色谱中固定相是非极性的，通常是烃类，流动 相是相对极性的水、甲醇、乙腈。 正相色谱中固定相是极性的，流动相是相对非极性 的正己烷、异丙醚。 正相色谱中极性最小的组分最先析出，反相色谱中 极性最大的组分最先析出。
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高 速、高效、高灵敏度、高自动化。 高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由 于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色 谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cm· min-1. 例如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。 对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径 0.9cm，流动相速度为30cm3· h-1，需用20多小时才能分 离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即 可完成。
2、进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～ 30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。 柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主 要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。 柱外展宽可分柱前和柱后展宽。 进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液 相色谱法中对进样技术要求较严。
柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填 料（＜20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填 料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入 装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。
4、 检测系统 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。 一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的 物理或化学特性有响应，属于这类检测器的 有紫外、荧光、电化学检测器等。 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总 的物理或化学性质有响应，属于这类检测器 的有示差折光，电导检测器等。
(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效 液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经 典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此 得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应 用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物 质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色 素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严 格，这是它的主要缺点。