西南大学基本科研业务费
铭文考辨两例
师簋 铭文 日： 今 敢 博 晕 段 ， 晕 工 吏 ， 赜 “ 反 弗 我柬圆。其 中“ 的解释是难点。马承源等先生 ” 段” 读 “ ” 薄 ” 读 “ 为 “ ” “ ” “ ” 句 义 博 为“ ， 段” 暇 ， 薄 义 迫 ， 为“ 迫使提供的奴隶们 闲下来 不事劳作” …枷。陈 佩芬先生亦读“ 为“ ， 段” 暇” 句义为“ 迫使 民众停止 劳动”２ 【缁。把 “ ” 为 “ ” 义 “ ” 以及 把 】 博 读 薄 ， 迫 ， “ 读为 “ ” 义 “ 段” 暇 ， 闲暇 ” 于 文 意 诘 诎 难 通 ， 隶 ， 奴 主统 治阶级 会强 迫 奴隶 闲暇 下 来 ， 停止 劳 作 。不 太 好理解 。 本 文认 为铭文应 该 断句 为 “ 敢 博 晕 ， ， 今 段 反 罩工吏 ， 弗踌我 柬 圆” 而 “ ” 表 示 语 气 的 叹词 ， ， 段 是 表示吃惊和不屑的语气 ， “ ” 且 博 当读为“ ， 搏” 其义 为“ 捕持 ” 。 这 可以从西 周铭 文 叙 述 征伐 东 夷 、 南夷 的三 淮
・
６ ・ ６
二 、 行气玉佩铭 ’ “ ’ 铭文一例
“ 行气 玉 佩铭 ” 一 篇 叙述 道 家 、 是 内家 拳 术 关 于 行气 养 生 的铭文 。它刻 写在 一个 十 二棱 的柱 形 玉器 上 。这件 玉 器外 部抛 光 ， 晶莹 光 滑 ， 了铭文 刻字 以 除
（ 师兑簋）“ Ｉ（ 、佼 ’杨簋）“ ’ 散盘） ’ 、 ’ （ 形。从甲 ∞
篇铭文得到印证。“ 王伐条子聪 ， ， 叔 罩反， 王降征
同的语句位置， 这并非偶然， 而是三字实际上表示的 是一个 词。“ ” 承 源 等先 生 认 为 是 叹词 ， 觳 马 与 “ 嗟” ， 可信， 那么“ 、 ” 段” “ 亦当是表示语气 的叹词。师寅 簋铭文和应侯见工簋中之 “ 非读 博”
基于微信公众平台的高校财务服务创新研究
图1财务信息服务示意图
根据图1，高校师生需要的财务信息各不相同，应提供多种多样的财务服务。
目前该问题传统的解决方法主要是通过电话、网络和现场服务等，但同一类问题的咨询大多有共性，财务工作人员需要重复解答，工作量大，也容易困乏，使得财务服务质量和师生的满意度不同程度地下降，而财量，填写相关支付信息并提交；
约时间，打印报销单；经部门负责人、
章后送至预约报账地点。
2.网约授权。
项目负责人登录门户首页后进入系统，行网约授权，也可以授权管理员。
管理员可以预约报账、。
甲骨文“对”考
贞王 春牛于夫６（４ 正） ９０ 勿乎良往夫。（００ 正） １３２
戊辰 卜 宾 贞， ， 乎自般取于夫。（８６ ８３ ） 于夫炫 雨。（０６） ３ｌ７
丁卯 卜贞 王田夫， 往来无 炎（７０ ７５ ）
丁亥 卜贞王迭于夫， 往来无燹（英 国所藏甲骨集）５８ 《 Ｚ５）
１ 甲骨 中“ ＂ 为动 词 对 应
“ 在甲骨中共现 ６ ，类纂》 对” 例 《 辑录 ５ ， 例由《 例 １ 总集》 补充 ： ［］ ・ 封…（ 甲骨文合集）８５ ） １． ． 《 １７５
［ ］． （０ ０ ） ２ ．封 ３６ ０ ・
［］ ３于夫西封大吉。（００ ） ３６０
［］ 卯王 …小 臣 …其 无 图…于束ｌ 王 占日吉 。（６ １） ４辛 封 ３４９
摘要 ：对” “ 的字形义解释众多 ， 多数 学者都认为它在 甲骨文中是个表 示地名的名词 ， 但从大量 文献 以及 方言用例来看 ，对 ” “
可以作动词 ，对” 配” “ 与“ 的核心义是“ ”而上古 “ “ 韵部相同 ， 一为端纽 ， 为滂纽 ， 合 ， 对”配” 声纽 一 并且从 文献 、 言以及 “ 方 对”
“ 在 甲骨文 中写 作 “ ”其 字形 义 未有定 论 ：从 手持 柴 ”“ 手持镫 ” “ 手持 有齿 之古 兵” ，以 对” ， “ ，从 ，象 “ 手持半树 之之形 ” 。各家 释字 形说 明“ ” 录的是 一种 动词行 为 ， 对 记 以手持 物 以会意 行某事 。差 异在 于所
第 ２ ０卷
第 ５ 期
茂名 学院学 报
Ｊ Ｒ Ｌ ＯＦ ＭｌＯ Ｎ ＮＩ ＥＲ ｎＹ ＯＵ ＮＡ Ａ Ｍ Ｇ Ｕ Ｖ Ｓ
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民国重庆霍乱疫情应对与控制模式初探——以1939年、1945年霍乱为例
民国重庆霍乱疫情应对与控制模式初探——以1939年、1945年霍乱为例李春晓，袁从秀（西南大学 历史文化学院 历史地理研究所，重庆 北碚 400715）摘 要：1939年、1945年四川省爆发了两次大规模霍乱，全川大受影响。
重庆作为当时国民政府的陪都亦受到霍乱的严重袭击。
霍乱在重庆爆发的原因，与日军1939年对重庆进行大规模战略轰炸密切相关。
日军陆空立体式的作战模式，以及无差别轰炸，造成重庆难民数量的急剧增加，人口的流动为大规模霍乱爆发提供了外部条件。
1945年疫情较1939年影响更大，卫生观念模糊、防疫知识匮乏成为该年霍乱传播主因。
重庆霍乱模式是战争行为的衍生物，抗战时期重庆霍乱疫情的解决方式大致是“战争－疫情－应对－卫生观念”，即从外在问题到近代卫生观念模式，并且以现代卫生观念的官方普及行为为最终表现。
关键词：霍乱；战争；迷信；卫生中图分类号：K29 文献标识码：A 文章编号：1003-1332（2018）02-0012-07基金项目：西南大学2017年度中央高校基本科研业务费专项资金项目“民国时期四川地区的传染病地理研究（1927-1949）”（SWU1709419）。
作者简介：李春晓（1990-），女，陕西米脂人，西南大学历史地理研究所2015级硕士研究生，研究方向：历史文化地理；袁从秀（1968-），女，四川通江人，西南大学历史文化学院副教授，硕士生导师，研究方向：历史文化地理。
高传染和高死亡的特性让霍乱吸引了医史学界和历史学界的共同关注。
在历史学界，对霍乱的关注主要来自于疾病社会医疗史领域和历史地视阈下，特别是疾病社会医疗史领域内。
余云岫先生在《霍乱沿革说略》[1]中对霍乱之来源、区分方法等问题作了介绍，为后世对霍乱的研究提供了珍贵的材料；程恺礼女士的《霍乱在中国（1820-1930）：传染病国际化的一面》[2]747-795的一文中对19世纪中期以来中国霍乱起源地的问题进行再次梳理并提出环境变化可以影响病菌变化的观点；李玉尚先生《霍乱在中国的流行（1817-1921）》[3]在嘉道霍乱研究的基础上进一步对1817-1921年的霍乱进行了研究与说明。
一种猪胃肠道内容物与粪便微生物梯度离心分离方法
动物营养学报２０１８，３０（５）：１８３７⁃１８４４ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ㊀ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６⁃２６７ｘ．２０１８．０５．０２６一种猪胃肠道内容物与粪便微生物梯度离心分离方法李金龙㊀王㊀瑶㊀马娅君㊀陈庆菊㊀卢昌文㊀唐志如∗（西南大学动物科技学院，生物饲料与分子营养实验室，重庆４００７１５）摘㊀要：本试验旨在探究一种猪胃肠道内容物与粪便微生物梯度分离方法㊂试验首先用分离缓冲液对猪胃肠道内容物及粪便样品进行稀释，寻找最佳稀释比例，再进行梯度离心得到胃肠道内容物及粪便样品中的微生物菌体㊂本方法得到胃㊁空肠和回肠内容物样品与分离缓冲液的最佳稀释比例范围为８．０％ １２．０％，样品的称取量范围为３．２ ４．８ｇ；盲肠㊁结肠内容物及粪便样品与分离缓冲液的最佳稀释比例范围为２．０％ ４．０％，样品的称取量范围为０．８ １．６ｇ㊂对饲喂３种饲粮蛋白质水平（１２．０％㊁１５．０％和１８．０％）３０ｋｇ的猪胃肠道内容物与粪便微生物进行分离，并对其回肠内容物和粪便中微生物氨基酸组成以及胃肠道内容物与粪便中微生物多样性进行检测㊂结果显示：回肠内容物和粪便中微生物菌体大部分氨基酸对饲粮不同蛋白质水平的营养模式响应效果显著（Ｐ＜０．０５），胃肠道内容物与粪便样品微生物的聚合酶链反应－变性梯度凝胶电泳（ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ）条带丰富和清晰㊂试验结果表明，该方法分离程度高，获取菌体干重多，同时还具有成本低廉㊁操作简单㊁重复性好等特点，可为更深层次的研究肠道微生物的生理功能提供方法㊂关键词：猪；胃肠道内容物；粪便；微生物；梯度离心中图分类号：Ｓ８２８㊀㊀㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号：１００６⁃２６７Ｘ（２０１８）０５⁃１８３７⁃０８收稿日期：２０１７－１１－０３基金项目：国家自然科学基金（３１７７２６１０）；西南大学基本科研业务费（ＸＤＪＫ２０１７Ｄ０３８）；重庆市留学人才创新计划重点项目（ｃｘ２０１７０２４）；重庆市自然科学基金（ｃｓｔｃ２０１６ｊｃｙｊＡ１４１４）；国家留学基金委西部计划（２０１５０８５０５１７０）；国家９７３重点基础研究发展计划项目（２０１３ＣＢ１２７３０３）作者简介：李金龙（１９９２ ），男，重庆巫山人，硕士研究生，从事分子营养学与生物饲料资源开发利用研究㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：８１２４５３０７２＠ｑｑ．ｃｏｍ∗通信作者：唐志如，研究员，硕士生导师，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｔａｎｇｚｈｉｒｕ２３２６＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ㊀㊀动物肠道内定植着种类繁多和数量庞大的微生物，其数量为１０１３ １０１４个［１］，构成了一个错综复杂的生态系统㊂肠道内的微生物对宿主能量代谢㊁营养物质吸收㊁机体生理和免疫功能的发挥等方面起着关键性的作用［２－３］㊂随着分子生物技术的蓬勃发展，众多研究肠道微生物的分子生物学技术不断涌现，如指纹图谱技术［聚合酶链反应－变性梯度凝胶电泳（ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ）］㊁荧光原位杂交技术㊁实时荧光定量ＰＣＲ等［４］㊂然而，如何高效地从动物胃肠道及粪便中将微生物进行分离，是运用生物学技术进行分析检测的前提基础，但目前国内外缺乏从胃肠道内容物和粪便中进行微生物分离的统一标准㊂因此，本试验旨在摸索猪胃肠道和粪便微生物与分离缓冲液的适宜比例，采用梯度离心法从猪胃肠道内容物和粪便中对微生物进行分离，以寻求胃肠道内容和粪便中微生物的最佳分离条件，为进一步深入研究肠道微生物氮营养素的代谢㊁内源性氮和氨基酸的组成㊁微生物区系以及粪便微生物氮和氨基酸排出情况等研究提供方法㊂㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷１㊀材料与方法１．１㊀样品来源㊀㊀试验按照完全随机设计将１８头健康的３０ｋｇ 杜ˑ长ˑ大 三元生长猪分为３组，每组６头猪㊂各组分别饲喂１２．０％㊁１５．０％和１８．０％３种蛋白质水平的玉米－豆粕型饲粮，饲养３０ｄ，单栏饲养，且自由采食和饮水㊂试验结束后，每组屠宰６头猪，采用无菌厌氧操作方法分别采集胃㊁空肠中段㊁回肠中段㊁盲肠和结肠中段内容物各５０ｇ，并且收集每组６头猪的肛门粪便，用于微生物菌体分离㊂１．２㊀缓冲液配制㊀㊀准确称取０．８５ｇ的ＮａＣｌ溶于１０００ｍＬ双蒸水中，待充分溶解后再加入１ｍＬ吐温－８０，然后置于１２１ħ高压灭菌锅内灭菌２０ｍｉｎ，备用㊂１．３㊀分离方法㊀㊀微生物分离流程如图１所示，具体流程如下：１）选取１头３０ｋｇ的猪屠宰后，无菌收集胃㊁空肠㊁回肠㊁盲肠㊁结肠内容物和粪便样品，于４ħ保存，待用㊂２）分别称取在称取量范围内的胃㊁空肠㊁回肠㊁盲肠㊁结肠内容物和粪便于无菌５０ｍＬ离心管ａ中，４ħ㊁１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清㊂３）向离心管ａ中加入４０ｍＬ分离缓冲液，漩涡混匀仪上剧烈摇匀２ ３ｍｉｎ，４ħ㊁１５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ㊂４）轻轻将离心管ａ取出（不能剧烈摇晃），将上清液倒入对应编号的无菌５０ｍＬ离心管ｂ中，将装有上清液的离心管ｂ置于离心机中，４ħ㊁１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清㊂５）取４０ｍＬ分离缓冲液，加入离心管ａ中，漩涡混匀仪上剧烈摇匀２ ３ｍｉｎ（需将沉淀彻底摇散悬浮），４ħ㊁１５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，将提取上清液倒入对应编号的无菌离心管ｂ中，将装有上清液的离心管ｂ置于离心机中，４ħ㊁１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清㊂６）重复步骤３）㊁５）各１次㊂７）倾倒上清液，将沉淀转入无菌２ｍＬ离心管中，－７０ħ保存，待各项指标测定㊂图１㊀微生物分离流程图Ｆｉｇ．１㊀Ｆｌｏｗ⁃ｄｉａｇｒａｍｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｅｐａｒａｔｉｏｎ１．４㊀微生物菌体氨基酸检测㊀㊀准确量取粪便和回肠内容物离心分离后的样品０．８ｍＬ于１５ｍｍˑ１５０ｍｍ试管中，向盛有样品的试管中加入０．８ｍＬ㊁６ｍｏｌ的盐酸，振荡混匀㊂用酒精喷灯将试管口下１／３处拉细至４ ６ｍｍ，抽真空１０ｍｉｎ后封管㊂再将试管置于（１１０ʃ１０）ħ恒温烘箱中沙浴水解２２ｈ，结束后取出冷却至室温，转移离心㊂取１ｍＬ滤液于５０ｍＬ烧杯中，用６０ħ恒温水浴蒸干滤液，再加入１ｍＬ㊁０．０２ｍｏｌ的盐酸，用０．２２μｍ滤膜过滤，然后置于全自动氨基酸分析仪上机分析，并记录测定结果㊂８３８１５期李金龙等：一种猪胃肠道内容物与粪便微生物梯度离心分离方法１．５㊀ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ检测㊀㊀取不同稀释比例下分离得到的胃肠道内容物及粪便样品微生物菌体，立即用于微生物ＤＮＡ提取㊂扩增的ＤＮＡ片段为细菌１６ＳｒＲＮＡ的Ｖ３可变区，引物采用３５７Ｆ⁃ＧＣ⁃ｃｌａｍｐ㊁３５７Ｆ和５１８Ｒ引物进行ＰＣＲ扩增和变性梯度凝胶电泳，其中ＧＣ夹子为：５ᶄ－ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣ－３ᶄ，３５７Ｆ引物序列为：５ᶄ－ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３ᶄ，５１８Ｒ引物序列为：５ᶄ－ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ－３ᶄ㊂电泳采用Ｄ⁃ｃｏｄｅ通用性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）系统（Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ），电泳缓冲液为１ˑＴＡＥ电泳缓冲液（ｐＨ８．０）㊂点样，升温电泳液至６０ħ，随后在１００Ｖ直流电压下电泳１９ｈ㊂电泳结束后，银染，拍照，保存图片㊂１．６㊀数据统计方法㊀㊀试验数据采用Ｅｘｃｅｌ２００７软件进行整理㊂采用ＳＡＳ９．１．３软件进行单因素方差分析，组间显著性分析采用Ｄｕｎｃａｎ氏法进行多重比较，结果以平均值和标准误（ＳＥＭ）表示㊂２㊀结果与分析２．１㊀不同肠道内容物与粪便样品的稀释比例和称取量及其分离程度和菌体干重含量㊀㊀不同肠道内容物与粪便样品的稀释比例和称取量及其分离程度和菌体干重含量如表１㊁表２和表３所示㊂当胃㊁空肠和回肠内容物样品的称取量分别为５．６㊁４．８㊁４．０㊁３．２ｇ时，稀释比例分别为１４％㊁１２％㊁１０％㊁８％，菌体干重含量和分离程度依次升高㊂在不同称取量和稀释比例下，胃内容物微生物分离程度均较高，达９９％以上，菌体干重含量可达到１．６３ｇ／ｋｇ以上；稀释比例为１２％及以下时，空肠㊁回肠内容物微生物分离程度较高，可达９８．０％ ９９．９％，菌体干重含量分别可达到２．００和２．５０ｇ／ｋｇ以上㊂当盲肠㊁结肠内容物和粪便的稀释比例由８％降至２％时，样品的称取量由３．２ｇ降至０．８ｇ，菌体干重含量和分离程度也依次升高㊂稀释比例在６％及以下时，盲肠微生物分离程度可达９７％以上，可获得的菌体干重含量可达７．０４ｇ／ｋｇ以上；稀释比例在６％及以下时，结肠微生物分离程度可达９５％以上，菌体干重含量可达１５．２９ｇ／ｋｇ以上；稀释比例在４％及以下时，粪便微生物分离程度可达９８％以上，菌体干重含量可达２０．３２ｇ／ｋｇ以上㊂表１㊀肠道内容物及粪便样品的稀释比例和称取量Ｔａｂｌｅ１㊀Ｄｉｌｕｔｉｏｎｒａｔｉｏａｎｄｗｅｉｇｈｔｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｆａｅｃｅｓｓａｍｐｌｅｓ项目Ｉｔｅｍｓ稀释比例Ｄｉｌｕｔｉｏｎｒａｔｉｏ／％１４１２１０８称取量Ｗｅｉｇｈｔ／ｇ胃Ｓｔｏｍａｃｈ５．６４．８４．０３．２空肠Ｊｅｊｕｎｕｍ５．６４．８４．０３．２回肠Ｉｌｅｕｍ５．６４．８４．０３．２稀释比例Ｄｉｌｕｔｉｏｎｒａｔｉｏ／％８６４２称取量Ｗｅｉｇｈｔ／ｇ盲肠Ｃａｅｃｕｍ３．２２．４１．６０．８结肠Ｃｏｌｏｎ３．２２．４１．６０．８粪便Ｆａｅｃｅｓ３．２２．４１．６０．８２．２㊀猪回肠内容物和粪便微生物菌体氨基酸组成检测结果㊀㊀猪回肠内容物和粪便微生物菌体氨基酸组成检测结果如表４和表５所示㊂结果显示，猪回肠内容物和粪便微生物菌体氨基酸共有１７种㊂其中，猪粪便中微生物菌体氨基酸组成中天冬氨酸（Ａｓｐ）㊁丝氨酸（Ｓｅｒ）㊁丙氨酸（Ａｌａ）㊁脯氨酸（Ｐｒｏ）㊁半胱氨酸（Ｃｙｓ）㊁缬氨酸（Ｖａｌ）㊁异亮氨酸９３８１㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷（Ｉｌｅ）㊁亮氨酸（Ｌｅｕ）㊁赖氨酸（Ｌｙｓ）㊁组氨酸（Ｈｉｓ）和精氨酸（Ａｒｇ）对饲粮不同蛋白质水平的营养模式响应效果显著（Ｐ＜０．０５），谷氨酸（Ｇｌｕ）㊁甘氨酸（Ｇｌｙ）㊁络氨酸（Ｔｙｒ）㊁苏氨酸（Ｔｈｒ）㊁甲硫氨酸（Ｍｅｔ）㊁苯丙氨酸（Ｐｈｅ）对饲粮不同蛋白质水平的营养模式响应效果不显著（Ｐ＞０．０５）㊂猪回肠内容物中微生物菌体氨基酸组成中Ａｓｐ㊁Ｓｅｒ㊁Ｇｌｕ㊁Ｇｌｙ㊁Ａｌａ㊁Ｐｒｏ㊁Ｔｈｒ㊁Ｃｙｓ㊁Ｖａｌ㊁Ｍｅｔ㊁Ｉｌｅ㊁Ｌｅｕ㊁Ｐｈｅ㊁Ｈｉｓ和Ａｒｇ对饲粮不同蛋白质水平的营养模式响应效果显著（Ｐ＜０．０５），仅Ｔｙｒ和Ｌｙｓ对饲粮不同蛋白质水平的营养模式响应效果不显著（Ｐ＞０．０５）㊂表２㊀不同稀释比例下胃㊁空肠和回肠内容物样品分离程度及菌体干重含量Ｔａｂｌｅ２㊀Ｄｅｇｒｅｅｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｅｎｔｏｆｄｒｙｃｅｌｌｗｅｉｇｈｔａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｉｌｕｔｉｏｎｒａｔｉｏｓｏｆｓｔｏｍａｃｈ，ｊｅｊｕｎｕｍａｎｄｉｌｅｕｍｃｏｎｔｅｎｔｓｓａｍｐｌｅｓ项目Ｉｔｅｍｓ稀释比例Ｄｉｌｕｔｉｏｎｒａｔｉｏ／％１４１２１０８分离程度Ｄｅｇｒｅｅｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎ／％胃－１Ｓｔｏｍａｃｈ⁃１９９．１９９．５９９．９９９．９胃－２Ｓｔｏｍａｃｈ⁃２９９．０９９．４９９．９９９．９空肠－１Ｊｅｊｕｎｕｍ⁃１９５．７９８．６９９．１９９．９空肠－２Ｊｅｊｕｎｕｍ⁃２９５．３９８．７９９．６９９．９回肠－１Ｉｌｅｕｍ⁃１９３．８９８．５９８．８９９．８回肠－２Ｉｌｅｕｍ⁃２９３．０９８．１９８．５９９．６菌体干重含量Ｃｏｎｔｅｎｔｏｆｄｒｙｃｅｌｌｗｅｉｇｈｔ／（ｇ／ｋｇ）胃－１Ｓｔｏｍａｃｈ⁃１１．６５１．７０１．７３１．７４胃－２Ｓｔｏｍａｃｈ⁃２１．６３１．６８１．７２１．７３空肠－１Ｊｅｊｕｎｕｍ⁃１２．０２２．２０２．４４２．４７空肠－２Ｊｅｊｕｎｕｍ⁃２２．００２．１７２．４１２．４３回肠－１Ｉｌｅｕｍ⁃１２．５３２．５８２．７９２．８８回肠－２Ｉｌｅｕｍ⁃２２．５０２．５５２．７６２．８４㊀㊀１㊁２代表同一个样品取的平行样㊂分离程度（％）＝１００ˑ（鲜样总菌数量－分离后总菌数量）／鲜样总菌数量㊂菌体干重含量（ｇ／ｋｇ）＝分离后的菌体干重（ｇ）／鲜样总重（ｋｇ）㊂表３同㊂㊀㊀１ａｎｄ２ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｐａｒａｌｌｅｌｓａｍｐｌｅｓｔａｋｉｎｇｆｒｏｍｔｈｅｓａｍｅｓａｍｐｌｅ．Ｄｅｇｒｅｅｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎ（％）＝（ｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｂａｃｔｅｒｉａｉｎｆｒｅｓｈｓａｍｐｌｅ－ｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｔｏｔａｌｂａｃｔｅｒｉａａｆｔｅｒｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）／ｔｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｂａｃｔｅｒｉａｉｎｆｒｅｓｈｓａｍｐｌｅ．Ｃｏｎｔｅｎｔｏｆｄｒｙｃｅｌｌｗｅｉｇｈｔ（ｇ／ｋｇ）＝ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｄｒｙｃｅｌｌｗｅｉｇｈｔａｆｔｅｒｓｅｐａｒａｔｉｏｎ（ｇ）／ｔｈｅｔｏｔａｌｗｅｉｇｈｔｏｆｆｒｅｓｈｓａｍｐｌｅ（ｋｇ）．ＴｈｅｓａｍｅａｓＴａｂｌｅ３．表３㊀不同稀释比例下盲肠㊁结肠内容物和粪便样品的分离程度及菌体干重含量Ｔａｂｌｅ３㊀Ｄｅｇｒｅｅｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｅｎｔｏｆｄｒｙｃｅｌｌｗｅｉｇｈｔａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｉｌｕｔｉｏｎｒａｔｉｏｓｏｆｃａｅｃｕｍ，ｃｏｌｏｎｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｆａｅｃｅｓｓａｍｐｌｅｓ项目Ｉｔｅｍｓ稀释比例Ｄｉｌｕｔｉｏｎｒａｔｉｏ／％８６４２分离程度Ｄｅｇｒｅｅｏｆｓｅｐａｒａｔｉｏｎ／％盲肠－１Ｃａｅｃｕｍ⁃１８６．０９７．９９９．４９９．４盲肠－２Ｃａｅｃｕｍ⁃２８６．２９７．１９９．７９９．９结肠－１Ｃｏｌｏｎ⁃１８６．９９６．３９８．３９９．３结肠－２Ｃｏｌｏｎ⁃２８６．５９５．２９９．０９９．０粪便－１Ｆａｅｃｅｓ⁃１６４．１８６．１９８．５９８．９粪便－２Ｆａｅｃｅｓ⁃２６２．９８７．６９８．７９８．７菌体干重含量Ｃｏｎｔｅｎｔｏｆｄｒｙｃｅｌｌｗｅｉｇｈｔ／（ｇ／ｋｇ）盲肠－１Ｃａｅｃｕｍ⁃１５．４７７．０４７．００７．００盲肠－２Ｃａｅｃｕｍ⁃２５．４８７．０６７．０２７．０２０４８１５期李金龙等：一种猪胃肠道内容物与粪便微生物梯度离心分离方法续表３项目Ｉｔｅｍｓ稀释比例Ｄｉｌｕｔｉｏｎｒａｔｉｏ／％８６４２结肠－１Ｃｏｌｏｎ⁃１１３．２２１５．２９１８．４６１８．５５结肠－２Ｃｏｌｏｎ⁃２１３．２４１５．３２１８．４８１８．５８粪便－１Ｆａｅｃｅｓ⁃１１３．２５１６．００２０．３２２０．４１粪便－２Ｆａｅｃｅｓ⁃２１３．２８１６．０４２０．３６２０．４５表４㊀饲粮不同蛋白质水平对猪粪便微生物菌体氨基酸组成的影响Ｔａｂｌｅ４㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｅｔａｒｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｏｎｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｆａｅｃｅｓｏｆｓｗｉｎｅ％项目Ｉｔｅｍｓ天冬氨酸Ａｓｐ丝氨酸Ｓｅｒ谷氨酸Ｇｌｕ甘氨酸Ｇｌｙ丙氨酸Ａｌａ脯氨酸Ｐｒｏ络氨酸Ｔｙｒ苏氨酸Ｔｈｒ半胱氨酸Ｃｙｓ缬氨酸Ｖａｌ甲硫氨酸Ｍｅｔ异亮氨酸Ｉｌｅ亮氨酸Ｌｅｕ苯丙氨酸Ｐｈｅ赖氨酸Ｌｙｓ组氨酸Ｈｉｓ精氨酸Ａｒｇ总氨基酸ＴＡＡＬ⁃ＣＰ１１．００ｂ１．４９ｃ１２．５４７．８３１０．７０ａ５．８９ａ３．５９４．３６０．７６ｂ５．４４ｂ１．６４６．０６ａ１１．３０ａ４．６１４．０４ｂ２．３２ｂ６．４５ａ１００．００Ｍ⁃ＣＰ１０．９０ｂ２．２８ａ１２．１６７．６８１０．３０ａｂ５．７１ａ３．８３４．５１０．７７ｂ６．３９ａ１．８６６．３８ａ１０．１０ｂ４．６３４．０８ｂ２．４７ｂ５．９３ｂ１００．００Ｈ⁃ＣＰ１３．７０ａ１．８３ｂ１２．６４７．７０９．８０ｂ４．３９ｂ３．９１４．１３１．２０ａ５．５３ｂ１．８５４．３７ｂ１１．４０ａ４．７８４．５０ａ２．８３ａ５．４４ｃ１００．００ＳＥＭ０．１９０．０６０．３４０．１８０．２１０．１２０．１２０．１２０．０８０．１４０．０６０．１３０．２３０．１５０．１２０．０９０．１６０．００Ｐ值Ｐ⁃ｖａｌｕｅ＜０．０１＜０．０１０．５７０．８００．０３＜０．０１０．１１０．１２＜０．０１＜０．０１０．０４＜０．０１＜０．０１０．６６０．０３＜０．０１＜０．０１１．００㊀㊀Ｌ⁃ＣＰ：低蛋白质水平（１２％）；Ｍ⁃ＣＰ：中蛋白质水平（１５％）；Ｈ⁃ＣＰ：高蛋白质水平（１８％）㊂同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５），肩标相同小写字母表示差异不显著（Ｐ＞０．０５）㊂下表同㊂㊀㊀Ｌ⁃ＣＰ：ｌｏｗｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌ（１２％）；Ｍ⁃ＣＰ：ｍｉｄｄｌｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌ（１５％）；Ｈ⁃ＣＰ：ｈｉｇｈｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌ（１８％）．Ｖａｌｕｅｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｌｅｔｔｅｒｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔｓｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｌｅｗｉｔｈｓａｍｅｓｍａｌｌｌｅｔｔｅｒｓｕｐｅｒ⁃ｓｃｒｉｐｔｓｍｅａｎｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＞０．０５）．Ｔｈｅｓａｍｅａｓｂｅｌｏｗ．表５㊀饲粮不同蛋白质水平对猪回肠内容物微生物菌体氨基酸组成的影响Ｔａｂｌｅ５㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｅｔａｒｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｏｎｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌａｍｉｎｏａｃｉｄｉｎｉｌｅｕｍｃｏｎｔｅｎｔｏｆｓｗｉｎｅ％项目Ｉｔｅｍｓ天冬氨酸Ａｓｐ丝氨酸Ｓｅｒ谷氨酸Ｇｌｕ甘氨酸Ｇｌｙ丙氨酸Ａｌａ脯氨酸Ｐｒｏ络氨酸Ｔｙｒ苏氨酸Ｔｈｒ半胱氨酸Ｃｙｓ缬氨酸Ｖａｌ甲硫氨酸Ｍｅｔ异亮氨酸Ｉｌｅ亮氨酸Ｌｅｕ苯丙氨酸Ｐｈｅ赖氨酸Ｌｙｓ组氨酸Ｈｉｓ精氨酸Ａｒｇ总氨基酸ＴＡＡＬ⁃ＣＰ１１．８０ａ４．３６ａ９．０４０ｂ５．５９ｂ８．９６ａ６．３０ａ３．６４３．０１ａ１．５７ｂ６．８８ａ３．１４ｂ６．７５ａ１０．６０ｂ５．７７ｃ４．６７４．６１ａ３．２６ｃ１００．００Ｍ⁃ＣＰ８．８０ｂ４．０３ａ９．７４０ｂ６．５４ａ８．２８ｂ６．８０ａ３．９７２．２６ｂ１．３６ｃ６．９４ａ２．２４ｃ６．８０ａ１１．８０ａ６．９１ｂ４．８０３．７１ｂ５．００ａ１００．００Ｈ⁃ＣＰ１１．８０ａ３．２３ｂ１２．８０ａ４．９３ｃ６．００ｃ４．８５ｂ３．５０３．２６ａ２．５７ａ５．３１ｂ３．９５ａ５．２９ｂ１１．８０ａ７．７５ａ４．３０４．３８ａ４．２２ｂ１００．００ＳＥＭ０．２３０．１２０．２５０．１２０．１８０．１９０．１９０．１２０．０５０．１７０．１５０．２８０．２３０．１２０．３２０．１９０．１５０．００Ｐ值Ｐ⁃ｖａｌｕｅ＜０．０１＜０．０１＜０．０１＜０．０１＜０．０１＜０．０１０．２４＜０．０１＜０．０１＜０．０１＜０．０１＜０．０１＜０．０１＜０．０１０．５２０．０１＜０．０１１．００２．３㊀胃肠道内容物和粪便不同稀释比例ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ结果㊀㊀在不同稀释比例下，胃㊁空肠㊁回肠㊁盲肠㊁结肠内容物和粪便中的微生物组成ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ结果如图２所示㊂提取不同稀释比例后的胃㊁空肠㊁回肠㊁盲肠㊁结肠内容物和粪便中微生物基因组ＤＮＡ，再以细菌通用引物进行ＰＣＲ扩增和变性梯度凝胶电泳㊂结果显示，ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ电泳均能检测出胃㊁空肠㊁回肠㊁盲肠㊁结肠内容物和粪便不同稀释比例后的ＤＧＧＥ条带，并且条带较清晰和丰富，重复性好㊂１４８１㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷图２㊀胃肠道内容物和粪便不同稀释比例ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ结果Ｆｉｇ．２㊀ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲ⁃ＤＧＧＥｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｉｌｕｔｉｏｎｒａｔｉｏｓｏｆｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｆａｅｃｅｓ３㊀讨㊀论㊀㊀常规分离培养动物肠道微生物的方法是借助不同种类的培养基或培养液进行培养，再运用生物化学手段对其分离纯化得到微生物，然后用于分析肠道中微生物组成㊁数量及其特征㊂但该方法存在一定的局限性，例如肠道中有很多微生物难以培养㊁大多数厌氧微生物未被鉴定和描述㊁体外培养的微生物与其在体内生理特征存在差异以及分离技术操作步骤繁琐等因素都会导致无法获取胃肠道菌群的全面信息［５］㊂有学者通过测定不同稀释菌液的光密度（ＯＤ）值，再与平板计数结果和烘干称重结果相对应，建立菌液ＯＤ值与菌体干重之间的回归方程，以此来实时测定菌体干重［６－７］㊂虽然此方法与传统的方法（平板计数法或者比浊法）相比，提高了菌体干重结果准确性，同时也提高了工作效率和降低了生产成本，但胃肠道内容物及粪便中的微生物种类繁多，加之不同微生物分离培养的条件存在差异［５］，也局限了该方法的运用㊂本试验采用梯度离心分离方法对猪胃肠道内容物与粪便中的微生物进行分离㊂稀释比例在１２％及以下时，胃㊁空肠和回肠内容物的微生物分离程度均较高，达９８％以上；稀释比例在４％及以下时，盲肠㊁结肠内容物以及粪便中的微生物分离程度也可达９８％以上，并且在适宜的稀释比例范围下，胃肠道内容物和粪便样品中均可获得较理想的菌体干重㊂本试验还对分离得到的胃㊁空肠㊁回肠㊁盲肠㊁结肠内容物和粪便中的微生物进行ＤＧＧＥ分析，结果得到较清晰而丰富的胃肠道内容物中微生物的ＤＧＧＥ条带㊂此外，本试验选用吐温生理盐水试剂预先处理样品，再通过梯度离心来分离富集微生物，有效地减少了化学试剂的使用㊂有研究报道，首先将内容物或者粪便与微生物分离，不仅可以有效地排除动物肠道内容物及粪便中许多未消化的食物残渣㊁消化酶㊁黏液和多糖（草食动物）等物质对微生物细胞壁破除和高质量微生物总ＤＮＡ的提取的干扰［８－９］，而且也能减少因过多化学试剂的使用导致提取的ＤＮＡ中试剂残留过多等问题［１０］㊂㊀㊀本试验对分离得到的３种不同蛋白质水平下猪回肠内容物和粪便微生物的氨基酸组成进行了检测㊂结果显示，猪回肠内容物和粪便中微生物菌体氨基酸组成共有１７种，猪回肠内容物和粪便中微生物菌体氨基酸组成对饲粮不同蛋白质水平的营养模式响应效果存在差异性㊂其中，猪粪便微生物菌体氨基酸中Ａｓｐ㊁Ｓｅｒ㊁Ａｌａ㊁Ｐｒｏ㊁Ｃｙｓ㊁Ｖａｌ㊁Ｉｌｅ㊁Ｌｅｕ㊁Ｌｙｓ㊁Ｈｉｓ和Ａｒｇ对饲粮不同蛋白质水平的营养模式响应更显著㊂回肠微生物菌体氨基酸中Ａｓｐ㊁Ｓｅｒ㊁Ｇｌｕ㊁Ｇｌｙ㊁Ａｌａ㊁Ｐｒｏ㊁Ｔｈｒ㊁Ｃｙｓ㊁Ｖａｌ㊁Ｍｅｔ㊁Ｉｌｅ㊁Ｌｅｕ㊁Ｐｈｅ㊁Ｈｉｓ和Ａｒｇ对饲粮不同蛋白质水平的营养模式也响应显著㊂此外，本试验分离微生物的方法还能运用于测定猪肠道微生物菌体胞内酶活２４８１５期李金龙等：一种猪胃肠道内容物与粪便微生物梯度离心分离方法性和微生物脱羧酶活性［１１］㊂由此可见，运用本试验方法分离得到的微生物可用于多种相关指标的检测㊂４㊀结㊀论㊀㊀①本试验建立的一种猪胃肠道内容物与粪便微生物梯度离心分离方法不仅具有分离程度高，获取菌体干重含量多等优点，而且还具有成本低廉㊁重复性好㊁操作简单等特点㊂㊀㊀②本试验方法的建立，可为进一步研究胃肠道中微生物的功能作用提供有效快捷的研究手段㊂参考文献：［１］㊀ＰＯＷＥＲＳＥ，Ｏ ＴＯＯＬＥＰＷ，ＳＴＡＮＴＯＮＣ，ｅｔａｌ．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ，ｄｉｅｔａｎｄｈｅａｌｔｈ［Ｊ］．ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒ⁃ｎａｌｏｆＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１４，１１１（３）：３８７－４０２．［２］㊀ＪＥＲＮＢＥＲＧＣ，ＬÖＦＭＡＲＬＳ，ＥＤＬＵＮＤＣ，ｅｔａｌ．Ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍｅｃｏｌｏｇｉｃａｌｉｍｐａｃｔｓｏｆａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａｄｍｉｎｉｓｔｒａ⁃ｔｉｏｎｏｎｔｈｅｈｕｍａｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ［Ｊ］．ＩＳＭＥＪｏｕｒｎａｌ，２０１３，７（２）：４５６．［３］㊀ＤＡＩＺＬ，ＷＵＧ，ＺＨＵＷＹ．Ａｍｉｎｏａｃｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｃｔｅｒｉａ：ｌｉｎｋｓｂｅｔｗｅｅｎｇｕｔｅｃｏｌｏｇｙａｎｄｈｏｓｔｈｅａｌｔｈ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１，１６（１）：１７６８－１７８６．［４］㊀王保军，刘双江．环境微生物培养新技术的研究进展［Ｊ］．微生物学通报，２０１３，４０（１）：６－１７．［５］㊀凌泽春，郭立辉，任素芳，等．猪胃肠道微生物菌群的研究现状及调控技术进展［Ｊ］．家畜生态学报，２０１１，３２（５）：５－９．［６］㊀李学贵，袁生．微生物转化过程中利用ＯＤ值实时监测细菌生物量变化的研究［Ｊ］．南京师大学报（自然科学版），２００３，２６（４）：９０－９３．［７］㊀马勇，樊永军．用ＯＤ值监测产油酵母培养过程中的菌体生物量变化［Ｊ］．安徽农业科学，２０１１，３９（１２）：７３４２－７３４３，７３４６．［８］㊀ＴＡＮＧＪＮ，ＺＥＮＧＺＧ，ＷＡＮＧＨＮ，ｅｔａｌ．Ａｎｅｆｆｅｃ⁃ｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｆｒｏｍｐｉｇｆａｅｃｅｓａｎｄｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｆｉｖｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，２００８，７５（３）：４３２－４３６．［９］㊀赵健元，李进华．对影响哺乳动物粪便ＤＮＡ提取相关因素的探讨［Ｊ］．生物学杂志，２００８，２５（３）：５－８．［１０］㊀吴敏娜，武亚琦，屈艳，等．四种小鼠肠道微生物ＤＮＡ提取方法比较［Ｊ］．生态学杂志，２０１５，３４（４）：１１８３－１１８８．［１１］㊀赖星，石宝石，刘金艳，等．日粮蛋白水平对生长育肥猪肠道微生物酶活性的影响［Ｊ］．中国兽医学报，２０１７，３７（２）：３２７－３３４．３４８１㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报３０卷∗Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｔａｎｇｚｈｉｒｕ２３２６＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ（责任编辑㊀武海龙）ＡＧｒａｄｉｅｎｔＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｆｏｒＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｉｎＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌＣｏｎｔｅｎｔｓａｎｄＦａｅｃｅｓｏｆＳｗｉｎｅＬＩＪｉｎｌｏｎｇ㊀ＷＡＮＧＹａｏ㊀ＭＡＯＹａｊｕｎ㊀ＣＨＥＮＱｉｎｇｊｕ㊀ＬＵＣｈａｎｇｗｅｎ㊀ＴＡＮＧＺｈｉｒｕ∗（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＢｉｏ⁃ＦｅｅｄａｎｄＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４００７１５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅａｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｓｅｐａｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｍｉｃｒｏ⁃ｏｒｇａｎｉｓｍｓｉｎｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｆａｅｃｅｓｏｆｓｗｉｎｅ．Ｆｉｒｓｔ，ｄｉｌｕｔｅｔｈｅｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｆａｅｃｅｓｗｉｔｈｓｅｐａｒａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒｔｏｆｉｎｄｔｈｅｆｉｔｔｅｓｔｄｉｌｕｔｉｏｎｒａｔｉｏ．Ｔｈｅｎｇｒａｄｉｅｎｔｌｙｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅａｎｄａｃｑｕｉｒｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｂａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｆａｅｃｅｓｓａｍｐｌｅｓ．Ｂｙｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｂｅｓｔｄｉｌｕｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｇａｓｔｒｏ，ｊｅｊｕｎｕｍａｎｄｉｌｅｕｍｃｏｎｔｅｎｔｓｔｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ８．０％ｔｏ１２．０％，ａｎｄｔｈｅｗｅｉｇｈｔｏｆｓａｍｐｌｅｓｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ３．２ｔｏ４．８ｇ．Ｔｈｅｂｅｓｔｄｉｌｕｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｃｅｃｕｍ，ｃｏｌｏｎｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｆａｅｃｅｓｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ２．０％ｔｏ８．０％，ａｎｄｔｈｅｗｅｉｇｈｔｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ０．８ｔｏ１．６ｇ．Ｗｅｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｉｎｉｌｅｕｍａｎｄｆａｅｃｅｓａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｉｎｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｆａｅｃｅｓｏｆｗｅｉｇｈｅｄａｔ３０ｋｇｐｉｇｓｆｅｄｗｉｔｈｔｈｒｅｅｋｉｎｄｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｄｉｅｔｓ（１２．０％，１５．０％ａｎｄ１８．０％）．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｏｓｔａｍｉｎｏａｃｉｄｓｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｂｅｓｉｎｉｌｅｕｍｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｆａｅｃｅｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｍｏｄｅｌ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅｂａｎｄｓｉｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ⁃ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＣＲ⁃ＤＧＧＥ）ｆｉｇｕｒｅｗｅｒｅｒｉｃｈａｎｄｌｅｇｉｂｌｅｗｉｔｈｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｓｅｐａｒａｔｅｄｆｒｏｍｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｃｏｎｔｅｎｔｓａｎｄｆａｅｃｅｓ．Ｔｈｅｓｔｕｄｙｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓｔｈａｔｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｈａｓｈｉｇｈｓｅｐａｒａｔｉｏｎｄｅｇｒｅｅａｎｄｏｂｔａｉｎｓｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｄｒｙｃｅｌｌｗｅｉｇｈｔ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅｉｔｏｗｎｓａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｌｅｓｓｃｏｓｔ，ｅａｓｙｏｐｅｒａｔｉｏｎａｎｄｇｏｏｄｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ，ｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｓａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｉｃｒｏｂｅｓｄｅｅｐｌｙ．［ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１８，３０（５）：１８３７⁃１８４４］Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｗｉｎｅ；ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｃｏｎｔｅｎｔｓ；ｆａｅｃｅｓ；ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ；ｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ４４８１。
生姜二倍体与四倍体 RAPD ISSR 分析
第35卷第2期西南大学学报(自然科学版)2013年2月V o l.35 N o.2J o u r n a l o f S o u t h w e s tU n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c eE d i t i o n)F e b. 2013文章编号:16739868(2013)02001505生姜二倍体与四倍体基因组D N A的R A P D和I S S R分析①王志敏,牛义,汤青林,宋明西南大学园艺园林学院,南方山地园艺学教育部重点实验室,重庆市蔬菜学重点实验室,重庆400716摘要:利用R A P D和I S S R标记对生姜二倍体和四倍体的遗传差异进行研究,结果表明:71个R A P D引物和14个I S S R引物对生姜二倍体和四倍体都扩增出了条带,其中有25个R A P D引物和7个I S S R引物在二倍体与四倍体之间扩增出了差异带,并且86%的I S S R引物序列为(G A)或(A G)的简单重复序列.表明在用一定浓度秋水仙素诱导生姜体细胞染色体加倍过程中,会引起基因组D N A的核苷酸碱基序列的改变,并以腺嘌呤和鸟嘌呤组合的简单序列重复区间易形成新的结合位点.关键词:生姜;四倍体;R A P D;I S S R;遗传差异中图分类号:S632.5;Q784文献标志码:A生姜(Z i n g i b e r o f f i c i n a l e R o s c.)为姜科姜属多年生草本植物,在我国多作一年生栽培.生姜供食用的部分为根状茎,不仅可药食两用,同时还是化工上提取香精㊁姜油酮的原料,在国内外市场上有很大的开发价值[1].常规的生姜栽培主要采用老熟根茎无性繁殖,因而易导致病害的发生.由于多倍体植株具有器官巨大㊁抗病抗逆性强㊁产量高等优势,因此在生姜脱毒[2]㊁脱菌[3]㊁离体快繁[4-6]等研究的基础上,对生姜多倍体的诱导[7-9]㊁形态特征[10]㊁主要生物活性成分变化[11]等方面也开展了一些研究,而对于多倍体生姜基因组D N A特性的研究则鲜有报道.本研究通过R A P D(随机扩增多态性D N A)和I S S R(简单重复序列区间)分子标记对人工诱导的生姜多倍体基因组D N A进行分析,探索在分子水平同源多倍体基因组的变化规律,为多倍体人工诱导体系的完善提供可行的参考,从而为生姜的倍性育种㊁新品种的改良和创新提供科学的依据.1材料与方法1.1试验材料以重庆本地红爪姜为材料,经过茎尖脱菌㊁快繁以及秋水仙素离体诱导(0.2%,8d液体培养基处理),经根尖染色体鉴定为二倍体㊁同源四倍体㊁嵌合体和混倍体的植株[10].1.2D N A的提取采用改良C T A B法[12]提取不同倍性生姜叶片基因组D N A,去R N A后1%琼脂糖凝胶电泳检测其降解情况,用紫外分光光度计测定其吸光度(A),根据A260和A280计算其D N A的浓度和纯度,置于-80ħ冰①收稿日期:20120910基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金项目(X D J K2009C126);教育部博士点基金项目(20090182120003);西南大学博士基金项目(S WU B2007064)资助.作者简介:王志敏(1976),女,山西太原人,博士,副教授,主要从事蔬菜遗传育种与生物技术研究.通信作者:宋明,教授.箱备用.1.3 R A P D -P C R 扩增分析R A P D 引物设计参照高德民的方法[13],共选取107条随机引物.经过优化25μL 反应体系中最佳扩增条件为:2.5μL10ˑP C R R e a c t i o nB u f f e r (200m m o l /L T r i s -H C l ㊁100mm o l /L (N H 4)2S O 4㊁100mm o l /L K C l ㊁20mm o l /L M g C l 2㊁1%T r i t o nX -100,p H 为8.8),0.4mm o l /Ld N T P s ,10p m o l /μL 引物,20n g D N A 模板,1U T a g DN A 聚合酶,超纯水补至25μL .扩增程序为:94ħ预变性1m i n ,36ħ退火2m i n ,72ħ延伸2m i n ,5个循环;94ħ30s ,36ħ1m i n ,72ħ2m i n ,40个循环;72ħ延伸5m i n ,4ħ保存.扩增产物在1.4%琼脂糖凝胶(内含1μg /m LE B )110V 电压下电泳检测,U V 成像系统照相保存.1.4 I S S R -P C R 扩增分析引物设计参照加拿大哥伦比亚大学设计的一套#9系列引物[14].25μL 反应体系中最佳扩增条件为:2.5μL10ˑP C R R e a c t i o nB u f f e r ㊁0.4mm o l /Ld N T P s ㊁10p m o l /μL 引物㊁20n g D N A 模板㊁1U T a g D N A 聚合酶㊁0.5μL 甲酰胺,超纯水补至25μL .P C R 扩增程序为:94ħ5m i n ,94ħ45s ,50~55ħ1.5m i n ,72ħ延伸1.5m i n ,35个循环;72ħ延伸7m i n ,4ħ保存.扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,U V 成像系统观察照相.所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,其它试剂均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司.M :L a m b d aD N A ∕E c o R I +H i n d Ⅲ;D :二倍体;T :四倍体;M I :混倍体;S:嵌合体.图1 不同倍性生姜基因组D N A2 结果与分析2.1 D N A 的检测采用改良C T A B 法提取的生姜基因组D N A 如图1所示,每个样品的基因组D N A 条带清晰㊁完整性好㊁无拖尾㊁无降解㊁纯度较高.吸光度检测A 260/A 280比值为1.82,说明基本上没有蛋白质㊁多糖和R N A 的污染,完全满足后续实验的要求.2.2 基因组D N A 的R A P D 分析选用的107条R A P D 随机引物中有71条在生姜二倍体和同源四倍体中都扩增出了条带,共计461条(大小约100~3000b p ),每个引物平均扩增6.51条;其中有46条引物在二倍体和四倍体中扩增条带相同(图2-A ),25条引物(表1)扩增出了差异条带(图2-B ),占全部引物的23%.表1 扩增出差异带的R A P D 引物序列引物编号序列(5 t o 3)引物编号序列(5 t o 3)S 29G G G T A A C G C C S 117C A C T C T C C T CS 61T T C G A G C C A G S 119C T G A C C A G C CS 65G A T G A C C G C CS 140G G T C T A G A G G S 82G G C A C T G A G G S 143C C A G A T G C A C S 84A G C G T G T C T GS 144G T G A C A T G C C S 85C T G A G A C G G A S 146A A G A C C C C T C S 93C T C T C C G C C A S 149C T T C A C C C G AS 95A C T G G G A C T C S 150C A C C A G G T G A S 96A G C G T C C T C C S 154T G C G G C T G A G S 97A C G A C C G A C A S 157C T A C T G C C G T S 103A G A C G T C C A CS 159A C G G C G T A T GS 105A G T C G T C C C C S 164C C G C C T A G T CS 109T G T A G C T G G G2西南大学学报(自然科学版) h t t p ://x b b jb .s w u .c n 第35卷M :G e n e R u l e r T M 100b pD N AL a d d e rP l u s ;D :二倍体;T :四倍体.图2 生姜二倍体与四倍体R A P D 扩增结果对不同倍性生姜进行R A P D 扩增后发现,经引物S 95扩增后四倍体的条带与嵌合体和混倍体相同而与二倍体有差异;引物S 85㊁S 84扩增后二倍体的条带与嵌合体㊁混倍体相同而与四倍体有差异;而引物S 79㊁S 61扩增后二倍体㊁四倍体㊁嵌合体和混倍体之间扩增的D N A 条带都不完全相同(图3).说明在用秋水仙素诱导体细胞加倍时,由于细胞状态不同造成染色体加倍非同步化,同时可能存在染色体的断裂㊁易位等情况,因此在R A P D 扩增时出现二倍体㊁四倍体与嵌合体㊁混倍体既有相同的结合位点也有各自不同的结合位点.D :二倍体;S :嵌合体;M I :混倍体;T :四倍体.图3 不同倍性生姜R A P D 扩增结果2.3 基因组D N A 的I S S R 分析选用的14条I S S R 引物中有7条(表2)在生姜二倍体和同源四倍体中扩增出了差异带,每个引物扩增的D N A 条带数在3~10条之间,共计97条(大小约200~2500b p),每个引物平均扩增6.93条(图4).这7条引物中有86%的引物序列为(G A )或(A G )的简单重复序列,说明生姜体细胞在经秋水仙素诱导时,以腺嘌呤和鸟嘌呤组合的简单序列重复区间易形成新的结合位点.用产生多态性的引物对二倍体㊁四倍体㊁嵌合体和混倍体进行扩增,引物811扩增后二倍体的扩增条带与嵌合体的相同,而混倍体与四倍体的相同;引物840扩增后,四倍体与嵌合体㊁混倍体的扩增条带相同,而与二倍体的差异明显;而引物841扩增后二倍体㊁四倍体㊁嵌合体和混倍体的扩增条带都不完全相同(图5).表2 扩增出差异带的I S S R 引物序列引物编号引物序列(5 t o 3)引物编号引物序列(5 t o 3)811G A G A G A G A G A G A G A G A C841G A G A G A G A G A G A G A G A Y C834A G A G A G A G A G A G A G A G Y T 836A G A G A G A G A G A G A G A G Y A 835A G A G A G A G A G A G A G A G Y C824T C TC T CT C TC T CT C TC g840G A G A G A G A G A G A G A G A Y T 3第2期 王志敏,等:生姜二倍体与四倍体基因组D N A 的R A P D 和I S S R 分析M :G e n e R u l e r T M 100b p DN AL a d d e rP l u s ;D :二倍体;T :四倍体.图4 生姜二倍体与四倍体I S S R扩增结果M :G e n e R u l e r T M 100b p DN AL a d d e rP l u s ;D :二倍体;T :四倍体;M I :混倍体;S:嵌合体.图5 不同倍性生姜I S S R 扩增结果3 讨论与结论对于无性繁殖植物,多倍体育种是实现优质高产育种的重要途径之一.生姜作为重要的药食两用作物,由于不能利用有性繁殖进行育种,只能靠少数品种长期无性繁殖,因此研究者试图通过多倍体诱导获得生姜新种质.通过采用化学诱导剂秋水仙素处理获得了一些同源四倍体生姜材料[7-10],其中秋水仙素浓度和时间的筛选是诱变成功的关键.本研究前期得到0.2%秋水仙素处理8d 的组合获得了较高的四倍体诱导率和成活率[10].但在辣椒多倍体诱导中发现秋水仙素不仅会促使细胞内染色体数目增加,还会引起染色体结构的变异[15].王卓伟㊁刘文革等通过A F L P 分析发现,经秋水仙素诱变得到的同源4x 与2x 相比,在D N A 分子遗传结构上产生了一定程度的改变[16-17].金鱼草二倍体和同源四倍体的R A P D 分析也表明D N A 差异表现在图谱的消失或增加上[18].本研究通过R A P D 和I S S R 标记分析,得到的生姜四倍体与二倍体在D N A 水平也表现出了一定的差异,说明在诱导生姜体细胞染色体加倍时,可能引起了基因组D N A 核苷酸碱基序列的改变,I S S R 分析发现,以腺嘌呤和鸟嘌呤组合的重复序列区间较易形成新的结合位点.试验中两种分子标记比较,R A P D 标记操作简单,无需专门设计引物,但易受反应条件的影响,重复性差,而I S S R 标记由于引物长度在17~24b p ,退火温度较高,与模板结合的强度提高,实验结果的可重复性高,并且在理论上检测区域可覆盖整个基因组,扩增的结果能较全面反映群体的变异,因此较适用于对倍性育种中基因组D N A的检测及诱导体系的评价.彭海等认为人工诱变中使用的秋水仙素以及加倍后组织培养与植株再生过程都难免在基因组上引入突变,这些变异可在D N A 结构和基因表达等方面表现出来,从而干扰倍性效应研究的准确性[19],H a n 等研究发现组织培养可激活逆转座子T o s 17[20].对于生姜离体诱导获得的四倍体和二倍体基因组D N A 的多态性是D N A 核苷酸碱基序列的位点改变造成的,还是离体培养条件下其他因素引起,以及如何减少变异完善多倍体诱导体系,还在进一步研究中.参考文献:[1]王志敏,牛 义,汤青林,等.多效唑对生姜试管苗生理特性的影响[J ].西南大学学报:自然科学版,2009,31(10):39-42.[2] 高山林,卞云云,陈柏君.生姜组织培养脱病毒㊁快繁和高产栽培[J ].中国蔬菜,1999(3):40-41.[3] 郭启高,宋 明,梁国鲁.生姜脱菌及离体快繁研究[J ].西南农业大学学报,1999,21(2):137-139.[4] HO S O K IT ,S A G AWA Y.C l o n a lP r o p a g a t i o no fG i n g e r (Z i n g i b e r o f f i c i n a l e R o s c o e )T h r o u g h T i s s u eC u l t u r e [J ].H o r t S c i e n c e ,1977(12):451-452.[5] I N D E N H ,A S A H I R A T ,H I R A N O A.M i c r o p r o p a g a t i o no fG i n ge r [J ].A c t aH o r t ,1988(230):177-184.[6] S HA R MA T R ,S I N G H B M.H i g h -F r e q u e n c y i n V i t r o M u l t i p l i c a t i o no fD i s e a s e -F r e e Z i n g i b e r o f f i c i n a l e R o s c [J ].4西南大学学报(自然科学版) h t t p ://x b b jb .s w u .c n 第35卷P l a n tC e l lR e po r t s ,1997(17):68-72.[7] 郭启高,张钟灵,周 虹,等.秋水仙碱诱导生姜多倍体的研究[J ].西南农业大学学报,2000,22(5):400-402.[8] A D A N I Y AS ,S H I R A ID.I nV i t r o I n d u c t i o no fT e t r a p l o i dG i n g e r (Z i n g i b e r o f f i c i n a l e R o s c o e )a n d I t sP o l l e nF e r t i l i t y a n dG e r m i n a b i l i t y [J ].S c i e n t i aH o r t i c u l t u r e ,2001,88(4):277-287.[9] 曾 杨,高山林,王 蔚,等.脱病毒生姜同源四倍体的诱导和鉴定[J ].药物生物技术,2006,13(5):338-342.[10]王志敏,牛 义,宋 明,等.姜四倍体离体诱导及其形态学分析[J ].中国蔬菜,2010(4):41-46.[11]S A NWA LSK ,R A IN ,S I N G HJ ,e t a l .A n t i o x i d a n tP h y t o c h e m i c a l sa n dG i n g e r o lC o n t e n t i nD i p l o i da n dT e t r a p l o i d C l o n e s o fG i n g e r (Z i n g i b e r o f fi c i n a l e R o s c o e )[J ].S c i e n t i aH o r t i c u l t u r a e ,2010,124(2):280-285.[12]刘桂风.遗传学实验原理与技术[M ].哈尔滨:东北林业大学出版社,2004:24-41.[13]高德民,刘振伟,樊守金,等.姜品种遗传多样性的R A P D 分析[J ].农业生物技术学报,2006,14(2):245-249.[14]周延清.D N A 分子标记技术在植物研究中的应用[M ].北京:化学工业出版社,2005:143-156.[15]陈锦华,周 力,高和平,等.秋水仙素诱导辣椒染色体结构变异初探[J ].湖北农业科学,1995,6:53-55.[16]王卓伟,余茂德,鲁 成.桑树二倍体及人工诱导的同源四倍体遗传差异的A F L P 分析[J ].植物学通报,2002,19(2):194-200.[17]刘文革,王 鸣,阎志红.西瓜二倍体及同源多倍体遗传差异的A F L P 分析[J ].果树学报,2004,21(1):46-49.[18]吴福川,胡 秀,郑思乡.不同倍性金鱼草基因组D N A 随机扩增多态性研究[J ].云南农业大学学报,2005,20(4):482-485.[19]彭 海,张 静,吴先军.植物基因表达中的倍性效应:研究进展㊁问题与展望[J ].中国科学C 辑(生命科学),2008,38(1):1-7.[20]HA NFP ,L I UZL ,T A N M ,e t a l .M o b i l i z e dR e t r o t r a n s p o s o nT o s 17o fR i c e b y A l i e nD N AI n t r o g r e s s i o nT r a n s po s e s I n t oG e n e sa n d C a u s e sS t r u c t u r a la n d M e t h y l a t i o n A l t e r a t i o n so faF l a n k i n g G e n o m i c R e g i o n [J ].H e r e d i t y,2004,141(3):243-251.R A P Da n d I S S RA n a l ys e s o fG e n o m i cD N Ao f D i p l o i d a n dA u t o t e t r a pl o i d Z i n g i b e r o f f i c i n a l e R o s c o e WA N GZ h i -m i n , N I U Y i , T A N G Q i n g -l i n , S O N G M i n g S c h o o l o f H o r t i c u l t u r ea n dL a n d s c a p eA r c h i t e c t u r e ,K e y L a b o r a t o r y o f H o r t i c u l t u r eS c i e n c e f o r S o u t h e r nM o u n t a i n o u sR e g i o n s ,M i n i s t r y o f E d u c a t i o n ,K e y L a b i nO l e r i c u l t u r eo f C h o n g q i n g ,S o u t h w e s t U n i v e r s i t y ,C h o n g q i n g 400716,C h i n a A b s t r a c t :R A P D (r a n d o m l y a m p l i f i e d p o l y m o r p h i cD N A )a n d I S S R (i n t e r -s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t s )m o l e c -u l a rm a r k e r sw e r eu s e d t o a n a l y z e t h e g e n o m i cD N Ao f d i p l o i d a n d a u t o t e t r a p l o i d g i n g e r (Z i n g i b e r o f f i c i -n a l e R o s c o e )i n d u c e db y c o l c h i c i n e s .O f t h e 10710-b a s i c p r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y ,71a m pl i f i e db a n d s o f d i p l o i da n d a u t o t e t r a p l o i d g i n g e r ,25R A P D p r i m e r s a n d 7I S S R p r i m e r s a m p l i f i e d d i f f e r e n t b a n d s b e t w e e n d i p l o i da n d a u t o t e t r a p l o i d g i n g e r ,a n d 86p e r c e n t o f I S S R p r i m e r sw e r e s i m p l e s e q u e n c e r e pe a t s o fG Aa n d A G.T h e a b o v e r e s u l t s s h o w e dt h a t i nt h e p r o c e s sof c h r o m o s o m ed o u b l i ng o f g i n ge r s o m a t i cc e l l sw i t h c o l c h i c i n e s ,D N A m o l e c u l a r s t r u c t u r e ,i .e .t h en u c l e o t i d e s e q u e n c eof i t sg e n o m i cD N A ,m i gh t c h a n g e ,a n d si m p l e s e q u e n c e r e p e a t s a b o u n d e dw i t hc o m b i n a t i o no f a d e n i n e a n d g u a n i n ew e r em o r e l i k e l y t o f o r m n e wc r o s s -l o c a t i o n s .K e y wo r d s :Z i n g i b e r o f f i c i n a l e R o s c o e ;a u t o t e t r a p l o i d ;r a n d o m l y a m p l i f i e d p o l y m o r p h i cD N A (R A P D );i n t e r -s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t (I S S R );g e n e t i c d i f f e r e n c e 责任编辑 欧 宾5第2期 王志敏,等:生姜二倍体与四倍体基因组D N A 的R A P D 和I S S R 分析6西南大学学报(自然科学版)h t t p://x b b j b.s w u.c n第35卷。
晋末南朝灵宝派经教仪式与天文历算关系新论_杨子路
教科仪、提升道教组织素质的活动虽属信仰行为，但实际上增强了传统数学与天文学传播发展的社会基础。
关键词： 灵宝派； 斋醮仪式； 天文历算； 信仰与理性
中图分类号： N09
文献标识码： A
文章编号： 1674 － 7062（ 2015） 03 － 0091 － 05
据《真诰》记载，东晋末，葛巢甫“造构《灵宝》， 风教大行 ”［1］，具 备 松 散 组 织 形 态 的 经 教 派 别——— 灵宝派遂得以成立。随着灵宝经的增衍和传播，灵 宝派得到迅速的发展。至刘宋元嘉十四年（ 437 年） 陆修静编《灵宝经目》时，称灵宝经法“期运既至，大 法方隆”，“虽玄蕴未 倾，然 法 轮 已 遍 于 八 方”［2］52 。 可见其时灵宝派声势之盛。尽管对佛教名相、思想 多有吸收，灵 宝 派 仍“保 存 着 更 为 深 厚 的 本 土 道 教 传统和本土 文 化 传 统 ”［3］，重 视 天 文 历 算 就 是 其 中 重要的一个方面。而在晋宋之际灵宝派传播之初， 中国传统 数 学、天 文 历 算 学 也 取 得 重 要 进 展［4］，并 出现了祖冲 之 、祖 暅 父 子 等 大 家 以 及《孙 子 算 经 》 《夏侯阳算经》《张邱建算经》等传世要籍。灵宝派 亦受时代氛 围 熏 染，继 承 了 道 教 重 视 数 学 与 天 文 历算学的 传 统。近 年 来，国 内 外 学 术 界 在 探 讨 灵 宝系经典的 造 作 上 取 得 突 破，然 而 尚 未 就 灵 宝 派 与传统天文历算的交涉问题进行专门研究。本文 拟结合相关 文 献 试 作 考 辨，以 求 推 进 道 教 与 古 代 科学关系的研究。
学技术等； 盖建民（ 1964 － ） ，男，山东莱阳人，四川大学道教与宗教文化研究所教授，研究方向为中国道教。
_性灵_诗说与清代中后期词学演进_夏志颖
二 不伴人愁，三更先下楼”（ 《菩萨蛮》） 、“不是梦中浑不觉，如此春寒”（ 《浪淘沙》） 之类的句子，这
〇 一
也正是袁枚所欣赏的“尖新”，但袁通词至卷二《柳雪词》就发生了明显的变化，长调占了绝大部
三 年
分，最常见的词调是《高阳台》，如《高阳台·湖上，用玉田生韵》（ 山远窥窗） ，该词步张炎《高阳台
· 社
致态横出，原 夫 南 唐 乐 府，最 工 小 令，北 宋 诸 体，并 擅 清 辞。花 光 本 取 其 温 柔，蝶 意 无 妨 于 轻
会 科
薄。”③对于《春影词》而言，这样的概括堪称恰当，但嘉庆元年，袁通还只有十八岁，不过是秦淮河
学 ︶
畔的一个风流少年而已，难免有“为赋新词强说愁”的时候，这一卷词以巧思写闺情，留下了“月
并无地位可言，对于《随园诗话》中记载的词人词作，也应作如是观。统观袁枚的整个文学生涯，
他都没有直接参与乾嘉词坛的建设，关于这一点，也可以通过对其子袁通之词的考察予以佐证。
袁通（ 1778 － ？） 字达夫，号兰村，著有《捧月楼词》八卷。他在嘉庆年间颇有些名气，时人对
其词的评论，多绕不开他那有名的父亲：
有关。
先看袁枚对厉鹗的批评。厉鹗是浙派诗与浙派词的共同领袖，厉鹗本人的诗词作品在内容
的审美趣味相近，至于跋文中的见解又都是些老生常谈的话头。由此我们不难推断，袁枚对词学
批评并不在行。
至于词体创作，他曾在《随园诗话》卷十一中声明： “余不耐学词，嫌其必依谱而填故也，然爱
人有佳作。”②就在这一卷中，他记下了自己平生仅有的词作《满江红》，该词记录了他买妾不成的
经历，是一首彻头彻尾的纪事词，就袁枚而言，这也许是他情生于心的有感而作，但此词除了告诉
樊榭之词，登之著录。先生之意固未尝薄词也。”袁枚对以厉鹗为首的浙派诗很是不满，《随园词
欧林工学院教学改革对我国高校农机专业发展的启示
农业工程Agricultural Engineering第10卷第11期2020年11月Vol. 10 No. 11Nov. 2020欧林工学院教学改革对我国高校农机专业发展的启示李明生，叶进，曾百功，柳剑（西南大学工程技术学院，重庆400715）摘要：我国农机产业的快速发展需要大量的卓越创新人才。
高校农机专业传统的人才培养模式难以满足学生的成长需求和农机行业对教育供给的诉求。
美国欧林工学院从人的需求、价值观和痛点等方面出发，进行教学改革，培养出 大量杰出的工程创新者，成为享誉全美乃至全球的工程教育后起之秀。
欧林工学院的教学理念、课程体系等，对我国高校农机专业发展具有重要的借鉴意义。
关键词：欧林工学院；农机专业；项目制；教学改革中图分类号：G642. 0 文献标识码：A 文章编号：2095-1795（2020）11-0093-04Enlightenment of Teaching Reform of Olin College of Engineering on Development of Agricultural Machinery Specialty in China's UniversitiesLI Mingsheng , YE Jin , ZENG Baigong , LIU Jian(College of Engineering and Technology , Southwest University y Chongqing 400715 , China)Abstract ： Rapid development of China's agricultural machinery industry needs a large number of outstanding innovative talents.Traditional talent training mode of agricultural machinery specialty in colleges and universities is difficult to meet growth needs of students and demand of agricultural machinery industry for education supply. Starting from the needs , values and pain points ofhuman beings , Olin College of Engineering has carried out teaching reform and cultivated a large number of outstanding engineer ing innovators. It has become a rising star of engineering education in the United States and even the world. Teaching concept and curriculum system of Olin College of Engineering have important reference significance for development of agricultural ma chinery specialty in colleges and universities in China.Keywords : Olin College of Engineering, agricultural machinery specialty , project system , teaching reform0引言农业的根本出路在于机械化，农业机械化极大促 进了农业农村社会经济的发展"切。
西南大学地理科学学院
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大学生创新训练项目申请书
项目编号
项目名称
项目主持人联系电话
学号专业班级
指导教师
E-m a i l
申请日期
起止年月
西南大学地理科学学院
填写说明
1、本申请书所列各项内容均须实事求是，认真填写，表达明确严谨，简明扼要
2、首页只填主持人，需为参加项目的学生。
“项目编号”一栏不填。
3、本申请书为大16开本（A4），左侧装订成册。
可网上下载、自行复印或加页，但格式、内容、大小均须与原件一致。
一、基本情况
二、立项依据
三、经费预算
四、指导教师意见
五、地理科学学院学委会意见
六、地理科学学院意见。
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西南大学基本科研业务费
专项资金项目
计划任务书
资助类别：
重点项目
项目名称：
申 请 者：
单 位：
联系电话：
起止年月： 2019年1月 至 年 月
填报日期： 2018年10月 日
西南大学科学技术处制
2018.10
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基本信息
申
请
者
信
息
姓名 性别 出生年月
学位 职称 研究领域
电话 手机
Email
单位
项目
基本
信息
项目名称
学科及代码 国民行业代码
科技活动
类型
起止时间 2019年1月 至20 年 月 申请金额
20 万元
项
目
摘
要
项目研究
意义
(限100
字)
主要研究
内容
(限200
字)
1 / 1
预期目标和成果
（请在所选择的目标后打√，至少选择两项）
本表格所涉及
的定级请参照
《西南大学自
然科学研究项
目、成果及平
台分类与认定
办法》【西校
（2015）620
号】
指标类型 最低完成数
选
择
A.科技项目 B级或以上1项
B.论文类成果
国内A1或以上(国外A3或以上）
1
篇
C.著作类成果 B级或以上1项
D.知识产权类成果
C级或以上2项（其中至少1项为B
级或以上）
E.产品类成果 B级或以上1项
F.奖励与表彰类成果 C级或以上1项
G.应用类成果 C级或以上1项
H.创意设计类成果 A2或以上1项
I.科技平台 B级或以上1项
关键词（最多5
个，用分号隔开）
1 / 1
项目组主要成员
编号 姓名 出生年月 性别 职称 学位 所在单位 联系电话 项目分工 每年工作时间（月） 签字
1
2
3
4
5
6
7
8
9
总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生
1 / 1
项目经费预算 单位：万元
序号 预算科目名称 申请金额 预算依据
1 1、设备费
2 （1）购置设备费
3 （2）试制设备费
4 （3）设备改造与租赁费
5 2、材料费
6 3、测试化验加工费
7 4、差旅费/会议费/国际合作与交流费
8 5、出版/文献/信息传播/知识产权事务费
9 6、劳务费
10 7、专家咨询费
11 合计
（请认真阅读后页预算说明！！！打印时可以不打）
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一、预算科目说明
1. 设备费：请说明购置或试制单台价值1
万元以上设备与研究任务的关系和必要性、现有同样设备的利用情况、设备用途、设备与现有设备的配
套情况、设备使用率、设备拟安置单位、购置设备的开放共享方案、试制设备的方案和成本构成等等；当单价1万元以下设备的购置或试制总
量较大时，需提供说明。若新进人员确需购买电脑、打印机等设备，需单独进行说明并由学院认可，且金额不超过项目总经费10%。（项目执
行期内若需对此科目进行预算调整，只能在原预算基础上调减）
2.
材料费：请说明购置的各种材料与研究任务的关系和必要性、所需数量的测算依据，并详细列示各种材料的名称、购买单价、购买数量以及总
金额。（项目执行期内若需对此科目进行预算调整，在原预算基础上可调增也可调减。）
3.
测试化验加工费：请说明预算的各种测试化验与加工项目与研究任务的相关性和必要性、测试化验加工次数的测算依据以及委托该单位的理由
等。（项目执行期内若需对此科目进行预算调整，在原预算基础上可调增也可调减。）
4.
差旅费：请说明预算的各项出差任务与研究任务的关系和必要性，以及出差次数、出差标准的预算依据。（项目执行期内若需对此科目进行预
算调整，只能在原预算基础上调减。具体规定请参照《西南大学国内差旅费管理办法》【西校（2016）505号】，详见财务处主页。）
会议费：请说明预算的各种会议与研究任务的关系和必要性，以及预算的会议次数、会议标准的预算依据。（项目执行期内若需对此科目进行
预算调整，只能在原预算基础上调减。具体规定请参照《西南大学会议费管理办法》【西校（2016）506号】，详见财务处主页）
国际合作与交流费：请说明预算的各项国际合作与交流与研究任务的关系和必要性，并详细列示出访或邀请来华专家的国家或地区名称、机构
名称、人数、天数、标准的预算依据。（项目执行期内若需对此科目进行预算调整，只能在原预算基础上调减；具体规定请参照《西南大学因
公临时出国经费管理办法（修订）》【西校（2016）775号】，详见财务处主页。）
5. 出版/文献/信息传播/
知识产权事务费：请说明各项预算与研究任务的关系和必要性，以及数量、单价的预算依据。（项目执行期内若需对此科
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目进行预算调整，在原预算基础上可调增也可调减。）
6.
劳务费：请说明各种聘用人员在任务研究中承担的任务，以及聘用人数、支付标准的预算依据。（项目执行期内若需对此科目进行预算调整，
只能在原预算基础上调减；具体参照《西南大学关于规范劳务费发放的通知》，详见财务处主页。）
7.
专家咨询费：请说明预算的咨询专家与研究任务的关系和必要性，以及咨询专家人次数、支付标准的预算依据。（项目执行期内若需对此科目
进行预算调整，只能在原预算基础上调减）
二、关于预算使用进度的说明
高校基本业务费资助的项目需按预算进度使用，此处所指的“预算进度”是全校基本业务费的“总进度”，具体为：在当年6月30
日前需使用超
过50%，在9月30日前需使用超过75%，在11月20日前需使用完毕。“使用完毕”指实际开支完毕，不含借款未冲账的经费。
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报告正文
编写提纲（请申请人参照以下提纲撰写，要求内容翔实、层次分明、格式清
晰、字体大小适中、标题突出。斜体字部分在撰写后删除，使版面简洁、易于
阅读。）
一、立项依据与研究内容：
1、项目的立项依据
（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考
文献目录。）（
基础研究需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；应用
研究需结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其
应用前景。）
2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。
3、拟采取的研究方案及可行性分析。
（包括有关方法、技术路线、
实验手段、关键技术等说明）
4、本项目的特色与创新之处。
5、年度研究计划、预期研究结果及成果提供形式。
二、研究基础与工作条件
1、工作基础与条件
（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作
成绩）
2、申请人简介
（包括申请者的学历和研究工作简历，近期已发表与本项
目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务，申请者
和正在承担的科研项目情况，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年
月、负责的内容等。）
三、经费预算说明
（要求对经费的特殊使用情况进行详尽说明，没有则不
填）
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四、申请者承诺
我保证申请书内容的真实性。如果获得专项资金资助，我将履行项目负责人
职责，严格遵守有关规定，认真开展工作，按时报送有关材料。同时保证在本项
目执行期内按要求申报国家自然科学基金项目（限项除外）。若填报失实和违
反规定，本人将承担全部责任。
签字：
日期：
五、学院（所、中心）审查意见
已按有关规定和申报通知要求对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申
请项目如获资助，我单位保证对研究实施所需的人力、物力和工作时间等条件给
予保障，督促项目负责人认真开展研究工作，及时报送有关材料。
负责人（签字）： 单位公章
日期：
六、学校领导小组意见
建议资助金额 万元
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建
议
立
项
意
见
年 月 日