蘸花转化拟南芥的原理
拟南芥实验报告
一、实验目的1. 了解拟南芥基因表达调控的基本原理和实验方法；2. 掌握利用RNA干扰技术（RNAi）研究基因表达调控的方法；3. 通过实验验证特定基因在拟南芥生长发育过程中的功能。
二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学研究的模式植物。
在植物生长发育过程中，基因表达调控起着至关重要的作用。
RNA干扰技术（RNAi）是一种利用双链RNA（dsRNA）降解特定mRNA，从而抑制目标基因表达的技术。
本实验通过构建特定基因的RNA干扰载体，导入拟南芥，观察目标基因表达受抑制后的表型变化，以研究该基因在拟南芥生长发育过程中的功能。
三、实验材料1. 拟南芥野生型植株；2. 目标基因cDNA克隆；3. 载体pCAMBIA1300；4. 实验试剂：DNA连接酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、pUC18载体、DNA分子量标准等；5. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、激光共聚焦显微镜等。
四、实验方法1. 目标基因cDNA克隆：利用PCR技术扩增目标基因cDNA，克隆到pUC18载体上，进行序列验证；2. RNA干扰载体构建：利用PCR和限制性内切酶技术，将目标基因cDNA克隆到载体pCAMBIA1300的RNAi表达框中，构建RNA干扰载体；3. 拟南芥转化：采用花序浸染法将RNA干扰载体导入拟南芥野生型植株；4. 表型观察：观察转化植株的生长发育状况，记录表型变化；5. 基因表达分析：采用RT-qPCR技术检测转化植株中目标基因mRNA表达水平的变化。
五、实验结果与分析1. 目标基因cDNA克隆：通过PCR和序列验证，成功克隆目标基因cDNA；2. RNA干扰载体构建：成功构建了RNA干扰载体，经测序验证无误；3. 拟南芥转化：成功转化拟南芥野生型植株，获得转化植株；4. 表型观察：转化植株在生长发育过程中出现表型变化，如叶片变小、生长缓慢等；5. 基因表达分析：RT-qPCR结果显示，转化植株中目标基因mRNA表达水平显著降低。
eha105 拟南芥原理
EHA105 拟南芥原理详解拟南芥简介拟南芥（学名：Arabidopsis thaliana）是一种小型的模式植物，属于十字花科，是研究植物生物学和遗传学的重要模式生物。
拟南芥的基因组相对简单，具有短的生命周期和快速的生长速度，使其成为研究植物基因功能和表达调控的理想模型。
拟南芥转化技术拟南芥转化技术是将外源基因导入拟南芥植株中，使其表达特定的基因或蛋白质。
其中，EHA105是一种常用的拟南芥转化介导体，通过农杆菌介导的转化方法将目标基因导入拟南芥。
拟南芥转化技术的基本原理如下：1.农杆菌介导的转化：农杆菌是一种常见的土壤细菌，具有天然的遗传转化能力。
利用农杆菌的特性，可以将目标基因导入拟南芥细胞中。
转化过程中，农杆菌通过寄生在植物细胞上的线粒体和质体，将外源基因导入植物细胞的染色体中。
2.构建转化载体：为了将目标基因导入拟南芥细胞中，需要构建一个转化载体，其中包含了目标基因的DNA序列。
转化载体一般由多个功能模块组成，包括选择标记基因、启动子、终止子等。
选择标记基因可以在转化后的拟南芥中表达，用于筛选转化成功的植株。
3.转化条件优化：转化过程中，需要优化一系列的条件，以提高转化效率。
包括农杆菌的培养条件、拟南芥的生长条件、转化载体的浓度和转化时间等。
通过优化这些条件，可以提高转化效率，增加转化成功的概率。
4.筛选转化植株：转化后的拟南芥植株需要经过筛选，以确定哪些植株成功地导入了目标基因。
常用的筛选方法是通过选择标记基因的表达来鉴定转化植株。
选择标记基因一般与目标基因共同构建在转化载体中，通过选择标记基因的表达来判断转化是否成功。
5.遗传稳定性验证：转化后的拟南芥植株需要进一步验证其遗传稳定性。
通过后代分析，确定转化基因是否稳定地遗传给下一代。
通常，通过PCR、Southern blot等方法来检测目标基因的存在，并验证其在后代中的稳定性。
EHA105的特点和应用EHA105是一种常用的拟南芥转化介导体，具有以下特点和应用：1.高转化效率：EHA105具有较高的转化效率，可以在较短的时间内实现大量的拟南芥转化。
研究发现拟南芥表皮毛时序性发育的分子机理
- 46 -Vegetables 2019.4栽培技术目的是使植株生长营养均衡，防止徒长。
一般情况下，3～4穗果时进行掐尖，掐尖时最后一个花序上一定要留2、3片真叶，防止果实发生日灼病，设施条件好的温室可留5～8穗果。
当第1穗果停止生长开始转色时，应及时把下部叶子摘掉以利于植株通风透光和加快果实成熟，减少病害发生。
由于此茬口的开花坐果期处在低温季节，为保果必须采用蘸花措施。
可用果霉宁、保果宁、沈农二号等药剂蘸花，浓度要严格按说明书进行控制，过大易出现畸形果，过小会坐不住果。
蘸花时还可加入0.2%速克灵，防止灰霉病发生。
为提高产品商品率，应及时去掉畸形、病果，每穗留3～4个果。
2.5 病虫害防治以预防为主，综合防治为方针。
一般7～10 d 打药1次，发病时2～3 d打1次。
2.5.1 主要病害防治措施晚疫病，当田间发现中心病株时，要及时喷药。
施药后关闭棚内通风口，适量增加棚室温度可提高药效。
可采用40%乙磷铝150倍液、25%甲霜灵800倍液、64%杀毒矾400倍液或72.2%普力克800～1 000倍液等进行防治。
溃疡病，育苗时进行温汤浸种，采用52 ℃温水恒温浸种30 min，捞出晾干后催芽播种；发现病株立即拔掉销毁，并喷洒30%DT500倍液、50%可杀得800倍液、新植霉素、硫酸链霉素或农用链霉素等进行防治；也可采用可杀得800～1 000倍液进行灌根。
叶霉病，可用50%甲基托布津500倍液、50%甲基托布津＋50%多菌灵1 000倍液、50%扑海因1 000倍液等药液进行防治。
灰霉病，可用0.3%速克灵或扑海因蘸花，也可在花期喷洒速克灵、扑海因1 000倍液行防治。
果实膨大期每667 m2施用5%多霉灵或甲霜灵、灭克粉尘1 kg进行灰霉病的防治。
2.5.2 主要虫害防治措施白粉虱，育苗时培育无虫苗，在温室风口加设防虫网以控制外来虫源，室内挂黄板诱杀成虫。
可用25%的扑虱灵可湿性粉剂1 000～1 500倍液、2.5%天王星乳油2 000～3 000倍液或40%康福多水剂2 000～3 000倍液防治。
拟南芥花序侵染原理
拟南芥花序侵染原理
拟南芥花序侵染是由一种病毒引起的病害。
病毒侵入拟南芥细胞后，利用植物细胞内的生化物质繁殖，随着时间的推移，病毒逐渐扩散到整个花序中，从而引起花序均匀发生病害的现象。
具体来说，拟南芥病毒先通过病媒介物（如蚜虫）进入植物体内，然后侵入植物细胞，并释放其遗传物质，包括RNA和蛋
白质等，进而干扰植物细胞的正常代谢机制，引发一系列病理反应。
在拟南芥病毒的感染过程中，病毒蛋白质可以与植物蛋白质相互作用，形成蛋白质复合物，从而干扰植物信号传递、蛋白合成、细胞壁合成等正常生长发育过程。
此外，病毒RNA还可
以通过特定的机制进入植物细胞核，干扰基因表达和染色质结构。
总之，拟南芥花序侵染是由一系列病理反应引起的，包括病毒复制、蛋白质相互作用、RNA干扰等，最终导致花序发生病害。
这一过程涉及到许多复杂的生物学机制，目前仍需进一步探究。
实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥课件
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实验总结
实验收获与体会
掌握了农杆菌转化法的基本 原理和操作流程。
了解了烟草和拟南芥作为实 验材料的优缺点。
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学会了如何进行抗性筛选和 分子检测验证转基因植株。
培养了实验操作技能和团队 合作精神。
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等方法进行评估。
表型分析对于筛选具有优良性状的转基 因植株具有重要意义。
转化细胞的遗传稳定性分析
转化细胞的遗传稳定性分析是评估转 基因植物遗传物质稳定性的重要步骤 。
一般情况下，经过多次繁殖后，转化 细胞或转基因植株仍能保持稳定的遗 传特性，则认为遗传稳定性较好。
通过连续繁殖转化细胞或转基因植株 ，并定期进行PCR检测和表型分析， 可以观察遗传物质的变化情况。
其他试剂
如抗生素、质粒 DNA等。
农杆菌转化烟草和拟南芥
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将外源基因克隆到农杆菌的质 粒载体上。
将重组质粒转化到农杆菌中。
将农杆菌接种到植物受体材料 上。
在培养条件下培养植物受体材 料，使农杆菌与植物细胞相互
作用并导入外源基因。
基因枪法转化植物细胞
胞，促 进其再生和表达外源 基因。
实验原理
植物基因工程简介
植物基因工程是通过改变植物 的遗传物质来改良植物性状的 一门科学。
它利用基因工程技术将外源基 因导入植物细胞，并在植物细 胞内表达，从而获得具有优良 性状的转基因植物。
植物基因工程的应用范围广泛 ，包括抗虫、抗病、抗除草剂 、提高产量、改良品质等。
农杆菌的特性
农杆菌是一种土壤细菌，属于根瘤菌科。
上海市宝山区2024届高三下学期二模试题 生物含答案
2023学年宝山区第二学期期中高三年级生物学科等级考质量监测试卷考生注意：1．试卷满分100分，考试时间60分钟。
2．所有答案必须填涂或填写在答题纸上，做在试卷上一律不得分。
3．单选题有一个正确答案，多选题有两个及以上正确答案，编号选填题有一个或多个正确答案。
4．答题前，在答题纸上填写姓名、班级、学校和准考证号。
一、珊瑚礁生态系统（20分）珊瑚礁生态系统因其生物多样性被誉为“海洋中的热带雨林”，珊瑚礁主要由珊瑚虫的分泌物堆积而成，许多珊瑚虫聚合生长构成珊瑚，珊瑚虫内胚层细胞中生活着可进行光合作用的虫黄藻、自身产生的色蛋白等使得珊瑚呈现各种颜色。
图1为珊瑚礁中部分生物关系图。
1.（2分）若要构成一个完整的生态系统，还需在图1的基础上增加（多选）。
A. 生产者B. 消费者C. 分解者D. 无机环境2.（2分）当海水温度升高或盐度下降时，长棘海星幼体成活率将明显上升，一段时间后虫黄藻和珊瑚虫的种群密度将会发生的变化是（单选）。
A. 前者增加，后者减少 B. 二者都减少C. 前者减少，后者增加D. 二者都增加3.（2分）很多珊瑚虫具有绿色荧光蛋白，在一定条件下可发出绿光，用以招募附近水域浮游的虫黄藻进入其体内，该现象主要体现了生态系统的运行需。
（单选）A. 一定的结构B. 能量的流动C. 物质的循环D.信息的传递虫黄藻2浮游生物图1长棘海星4.（2分）虫黄藻能进入珊瑚虫内胚层细胞，可能与内胚层细胞的下列结构或生理现象直接相关（编号选填）。
① 质膜的载体蛋白② 细胞识别③ 质膜的流动性④ 细胞分裂珊瑚对环境变化及为敏感，海水表层温度（SST ）的升高或除草剂污染就可能对其生长造成巨大影响，导致珊瑚虫体内虫黄藻减少或虫黄藻失去颜色，从而出现白化现象，若一段时间内影响因子消除，颜色可得到恢复，长时间胁迫则珊瑚虫死亡，白化不可逆。
5.（3分）较短时间的SST 升高，白化珊瑚能得以恢复的原因可能有（多选）。
A. 胁迫期珊瑚虫体内还有少量的虫黄藻为其提供物质和能量B. 胁迫期珊瑚虫尽量增加对浮游生物的摄取C. SST 恢复后珊瑚虫继续招募和吸纳虫黄藻D. 胁迫期珊瑚虫充分利用自身储存的营养物质6.（3分）科研人员预实验测得虫黄藻细胞密度和吸光度关系曲线如图2，将一定数量的离体虫黄藻在25℃进行培养，连续8天定时取样测定吸光度结果如图3。
拟南芥的遗传转化技术
拟南芥的遗传转化技术1种子消毒处理用70%的乙醇浸泡2分钟，用15% （体积比）NaClO溶液旋转洗涤10分钟，无菌水漂洗5次。
2播种和移栽用无菌水重悬浮消毒处理的种子，均匀分散到1/2MS固体培养基表面上，培养皿倒置，4°C春化两天，25°C正置暗培养一天，再置于22°C的组织培养室中正常培养。
待苗长至四片叶子时，将其移栽到营养土中，置于22°C恒温环境中，16h光照/8h黑暗培养，初期可适当绕些营养液。
3拟南芥幼苗修剪植株长出顶生花序时，去除其顶生花序，以刺激腋生花序的生长，注意避免伤及腋生花序。
准备侵染前，剪除角果以及开放过的花朵。
4拟南芥的遗传转化4.1农杆菌感受态细胞的制备及转化(1)取-80℃超低温冰箱中保存的农杆菌菌株GV3101，在（含50mg/LRif和100mg/L Kan)的YEB培养基平板上划线，28℃培养约36-48 h。
（单菌落）(2)挑取单菌落GV3101接种于5ml LB液体培养基（含50mg/LRif和100mg/L Kan)中，28℃200rmp/min振荡培养过夜；（活化）(3)取2ml菌液转入100ml LB液体培养基(含50mg/LRif和100mg/LKan)中继续培养至OD600=0.5；（增殖培养）(4)转入50ml无菌离心管中，冰浴30min，4℃，4000r/min离心10min，弃上清；(5)加入10ml预冷的150mmol/L NaCl重悬菌体；(6)4℃，4000rmp/min 离心10min，弃上清；(7)加入1/10体积预冷的50 mmol/L CaC12重悬菌体；(8)分装于无菌l.5ml离心管中，100ul/管，4℃保存备用；取1ug提取纯化的重组质粒DNA，加入200u1感受态细胞中，混匀；(9)冰浴10min，转入液氮冷冻5min，迅速置于37℃水浴，热激5min；(10)加入500ul LB液体培养基，28°C，200rmp/min振荡培养2-3h；(11)5000r/min 离心2min，弃上清；(12)剩余菌液(残留100ul左右)用移液器反复抽吸悬浮，然后均匀涂布于LB平板(含50mg/L Rif，100mg/LKan)表面，28℃培养2-3d。
拟南芥培养及遗传转化
拟南芥待转化植株培养及遗传转化一实验目的：获得待转化拟南芥植株并进行花序浸润转化植株。
二实验材料：拟南芥种子（拟南芥的生态型最好是Col-0或者Ws-O，Nd-O，No-O），25cm3花盆，15ml离心管，10ml吸管，Agar，乙醇，次氯酸钠，利福平，Silwet L-77，营养液配方所需试剂，营养土，蛭石，塑料薄膜，托盘等。
三实验步骤：1 待转化植株培养⑴种子消毒：20μl种子装入1.5ml离心管内，加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 1%次氯酸钠，震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；均匀撒播于MS培养基平板上，注意每次洗脱用V ortxe充分混匀。
⑵春化作用：将MS培养基放到4℃冰箱中放置2天。
⑶将MS培养基放置在23 0 C/20 0 C光照培养箱16h/8h培养，在有3~5片成熟叶片后，移栽生长良好的拟南芥幼苗至用营养液浇灌过的营养土和蛭石（4:6）中生长，营养土和蛭石分装在25cm3的小培养皿中，保湿7天左右，湿度为60%~80%。
在生长期间适当浇灌营养液，按需要没3-4周一次（或者时间更长）。
⑷为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花序形成后剪去第一个花序，解除顶端优势，促使多个次生花序的同步出现。
当大多数花序约1~10cm高（剪主序后4~8d）时准备浸润。
表1 MS培养基注意事项：①溶化琼脂：用粗天平分别称取琼脂5.5g、蔗糖20 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入750 mL蒸馏水，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。
然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1000 mL，搅拌均匀。
②调节PH至5.7~5.8。
表2 营养液配方（无需调节PH）成分含量（mol/L）Ca(NO3)2·4H2O 1.01×10-3NH4H2PO4 1.30×10-4KNO3 5.10×10-3MgSO4·7H2O 4.98×10-4NaOH 3.13×10-5Fe-EDTA 2.24×10-5H3BO39.68×10-6Mncl2·4H2O 2.03×10-6CuSO4·5H2O 2.1×10-7MoO3 1.39×10-7Co（NO3）2·6H2O 8.59×10-8NH4NO3 2.93×10-52 农杆菌的培养取出保种的农杆菌菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接入10mL无菌LB液体培养基中（一般含75mg/ L利福平、100mg/ L链霉素和100mg/ L卡那霉素），28℃恒温下250r/ min 振摇过夜培养。
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蘸花转化拟南芥的原理
蘸花转化是一种传统的植物遗传转化方法，被广泛应用于拟南芥（Arabidopsis thaliana）等模式植物的遗传研究中。
它通过利用植物细胞壁在休眠状态中具有可渗透性的特点，将外源DNA导入细胞内，并通过细胞再生和再定植的过程实现外源DNA在植物基因组中的稳定转化。
蘸花转化的基本原理是将植物花序浸入含有外源DNA的溶液中，使DNA进入受精卵或胚囊细胞的细胞质中，然后通过植物的自然生长和发育过程，使外源DNA在植物体中表达和传递。
具体来说，蘸花转化可以分为以下几个步骤：
1. 制备转化介质：首先，需要制备含有外源DNA的转化介质。
常见的转化介质可以使用含有目的基因的载体质粒DNA，将其溶解在含有适量干燥剂（例如琼脂糖或聚乙烯醇）的水溶液中。
2. 选择适宜的生长条件：接下来，为了促进花朵的生长和发育，需要为植物提供适宜的生长条件，例如适当的光照、温度和湿度。
3. 耐心观察花朵发育：在花朵开始开放之前，需要持续观察花朵的生长过程。
一般来说，在花朵刚开始放大之后的1-2天进行转化最为理想。
4. 浸泡花序：当花朵开始开放并从花蕾中伸出雄蕊和子房时，将花序浸入含有转化介质的容器中。
整个花序都应被浸泡在介质中，以确保足够多的花朵受到转化。
5. 转化时间控制：浸泡时间是影响蘸花转化效率的重要因素之一。
通常，转化时间在几秒钟到几分钟之间，特定的时间取决于具体的实验条件和被转化植物的品种。
6. 转化后的处理：结束浸泡后，取出花朵，用纸巾轻轻吸去多余的水分，然后将花朵进行适量的清洗，以去除附着在外表面的转化介质。
7. 果实收获和种子处理：完成浸泡转化后，让花和果实自然生长和发育。
当果实成熟时，采收并将其分为单独的果穗，去除果实外层，将剩余的种子保存起来。
8. 筛选转基因后代：将收获的种子进行无菌处理，即表面消毒，然后进行播种和培养。
通过对转基因后代的耐草丹（选择抗性）等遗传标记进行筛选，最终得到含有目的基因的拟南芥植株。
蘸花转化方法的优势在于简便、经济且高效。
但同时，该方法也有一些限制，例如具体实现的效率依赖于目标基因的选择、植物的品种和生长条件等因素。
因此，在实际操作中，需要根据具体的实验需求和条件，选择适合的转化方法来完成拟南
芥等模式植物的遗传转化研究。