水貂肠炎病毒SYBRGreen_荧光定量PCR检测方法的建立_于永乐
猪萨佩罗病毒VP1基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立
猪萨佩罗病毒VP1基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲
线的建立
刘熠凡;张静雯;王平利
【期刊名称】《河南畜牧兽医》
【年(卷),期】2024(45)3
【摘要】为建立用实时SYBRGreenI荧光定量PCR方法检测PSVVP1基因表达量的标准曲线,试验根据目的基因在NCBI上CDS区的序列设计合成引物,用T4连接酶将目的片段与pMD18-T载体连接,构建重组质粒,采用real-time RT-PCR的检测方法,建立了检测猪萨佩罗病毒VP1基因表达量的标准曲线。
试验结果显示,线性回归系数为0.9981,且熔解曲线只有一个峰值,表明由VP1目的基因所建立的标准曲线线性关系良好。
试验成功建立了用SYBRGreenI荧光定量RT-PCR方法检测猪萨佩罗病毒VP1基因表达量的标准曲线,为后续检测基因表达量的变化奠定了基础。
【总页数】4页(P7-9)
【作者】刘熠凡;张静雯;王平利
【作者单位】河南农业大学动物医学院
【正文语种】中文
【中图分类】S828
【相关文献】
1.猪Th1/Th2型细胞因子重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立
2.猪Th1／Th2型细胞因子重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的建立
3.猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型基因重组质粒实时荧光定量PCR标准曲线的构建
4.猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步临床应用
5.猪萨佩罗病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鸭圆环病毒实时定量PCR检测方法的建立及流行毒株全基因组遗传变异分析
鸭圆环病毒实时定量PCR检测方法的建立及流行毒株全基因
组遗传变异分析
赵韵笛;杨兴淼;李靖红;曹瑞兵
【期刊名称】《畜牧与兽医》
【年(卷),期】2022(54)12
【摘要】为了解近年来鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)的流行现状,本研究在DuCV的Rep基因保守区内设计一对特异性荧光定量引物,建立SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。
结果显示:该方法最低可检测到拷贝数为
3.46×10^(1)copies/μL的目的基因,比常规PCR灵敏;选取Ct值最低的阳性样品进行全基因组扩增及进化分析,成功扩增出1988 bp的病毒全基因,序列分析结果显示该病毒基因型为DuCV-1,亚型为1 b。
本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为DuCV的流行病学调查提供了有效的监测手段,同时通过分析不同基因型的遗传进化特点与Cap蛋白氨基酸位点突变特征,为DuCV感染的防控研究提供参考。
【总页数】8页(P98-105)
【作者】赵韵笛;杨兴淼;李靖红;曹瑞兵
【作者单位】南京农业大学动物医学院
【正文语种】中文
【中图分类】S852
【相关文献】
1.猪流行性腹泻病毒变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用
2.猪瘟病毒野毒株与疫苗株双重SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 检测方法的建立
3.鉴别非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒野毒株二重TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用
4.猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立
5.鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
荧光定量聚合酶链式反应
荧光定量聚合酶链式反应荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）是一种高灵敏度和高特异性的分子生物学技术，用于定量测量DNA的数量。
该技术基于PCR反应，通过引入荧光探针来实现定量分析。
本文将对qPCR技术进行详细介绍，并探讨其在基础研究和临床应用中的重要性。
qPCR技术简介qPCR技术是PCR技术的一种改进和扩展。
PCR是一种常用的DNA扩增技术，通过在反应体系中加入特定的引物和热稳定的DNA聚合酶（如Taq酶），从而扩增DNA的特定片段。
PCR反应一般包括三个步骤：变性、互补和扩增。
变性是将DNA双链变性为单链；互补是在引物的催化下，使单链DNA互补结合成双链DNA；扩增是将双链DNA在反应体系中通过PCR循环扩增。
与普通PCR技术不同的是，qPCR技术可以实现定量分析，是因为在反应体系中加入荧光探针。
这种荧光探针通常是由荧光染料和一段与引物互补的序列组成，能够与PCR扩增产物结合并发射荧光信号。
荧光信号的强度和PCR产物的数量成正比，从而实现定量分析。
qPCR技术主要有两种：SYBR Green qPCR和荧光探针qPCR。
SYBR Green qPCR是指在反应体系中加入SYBR Green染料，该染料具有荧光检测性能，能够结合双链DNA并发射荧光信号。
由于SYBR Green能够与任何PCR产物结合并发射荧光信号，因此SYBR Green qPCR 只适用于一个靶标的检测。
荧光探针qPCR则是在反应体系中加入荧光标记的探针，该探针只与特定靶标的PCR产物结合并发射荧光信号，具有更高的特异性。
qPCR技术在基础研究中的应用qPCR技术在基础研究中有着广泛的应用。
以分子进化为例，基因序列在分子进化研究中有非常重要的地位。
qPCR技术可以快速地克隆、扩增靶标基因，以便对比他们之间的差异，从而建立起演化的分支图谱。
此外，qPCR技术也可以用于生物或化学实验的快速筛选和检测。
在药物筛选中，qPCR 技术可以帮助鉴别药物对表观遗传学修饰的影响，而在基因表达分析中，qPCR技术可以检测所需基因的表达水平，以确定该基因在特定生理过程中的作用。
水质中大肠杆菌荧光定量PCR检测方法的建立及应用
水质中大肠杆菌荧光定量PCR检测方法的建立及应用作者：楼秋雯陈为为黄志广安紫珲朱振洪来源：《科技创新与应用》2019年第35期摘 ;要：[目的]建立迅速、特异的水质中大肠杆菌群荧光定量PCR检测方法。
[方法]根据Genbank中大肠杆菌保守的uida基因序列，设计特异性引物，扩增并构建重组质粒作为标准品。
同时设计荧光定量PCR引物，优化荧光定量PCR定量反应体系，建立水质中大肠杆菌的绝对定量方法。
[结果]成功地构建了含uida基因的重组质粒，利用标准质粒为参照，分别对不同来源的水质进行检测，成功检出每微升水质中大肠杆菌的基因拷贝数，且方法具有特异性好、重复性高的特点。
[结论]初步建立水质中大肠杆菌的荧光定量PCR检测方法，可为饮用水中大肠杆菌迅速检测，包括污染源头诊断的标准方法的确立提供依据。
关键词：水质;大肠杆菌;荧光定量PCR;检测方法中图分类号：TV697.3 ; ; ; 文献标志码：A ; ; ; ; ; ; ;文章编号：2095-2945（2019）35-0118-04Abstract： Objective： To establish a rapid and specific fluorescence quantitative PCR method for the detection of Escherichia coli in water quality. Methods： According to the conserved uida gene sequence of Escherichia coli in Genbank， specific primers were designed to amplify and construct the recombinant plasmid as the standard. At the same time， the fluorescence quantitative PCR primers were designed， the fluorescence quantitative PCR quantitative reaction system was optimized， and the absolute quantitative method of Escherichia coli in water quality was established. Results： The recombinant plasmid containing uida gene was successfully constructed. Using the standard plasmid as a reference， the water quality from different sources was detected， and the gene copy number of Escherichia coli in each microliter of water quality was successfully detected. And the method has the characteristics of good specificity and high repeatability. Conclusion： The preliminary establishment of a fluorescence quantitative PCR method for the detection of Escherichia coli in drinking water can provide a basis for the rapid detection of Escherichia coli in drinking water， including the establishment of a standard method for the diagnosis of pollution sources.Keywords： water quality; Escherichia coli; fluorescence quantitative PCR; method大腸埃希氏菌（Escherichia coli）通常称大肠杆菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染，是人体内较为常见的食源性致病菌。
鲁氏耶尔森菌 qPCR 快速检测方法的建立和应用
中国水产科学 2017年11月, 24(6): 1254-1260 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2017-01-09; 修订日期: 2017-03-03.基金项目: 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资助项目(HSY201503); 新疆维吾尔自治区区域协同创新专项(2016E02052). 作者简介: 张枭(1989–), 男, 硕士研究生, 研究方向为水产动物医学. E-mail: zhangxiao0904@ 通信作者: 卢彤岩, 研究员. E-mail: lutongyan@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2017.17001鲁氏耶尔森菌qPCR 快速检测方法的建立和应用张枭1, 2, 李绍戊1, 王荻1, 曹永生1, 卢彤岩11. 中国水产科学研究院 黑龙江水产研究所, 黑龙江 哈尔滨 150070;2. 南京农业大学 无锡渔业学院, 江苏 无锡 214081摘要: 鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri )是导致虹鳟(Oncorhynchus mykiss )肠炎红嘴病的病原。
本研究以鲁氏耶尔森菌毒力因子rupA 基因为靶标设计1对特异性引物, 以含有rupA 基因部分序列的重组质粒为标准品构建标准曲线, 优化建立检测鲁氏耶尔森菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR 检测方法, 并对腹腔注射鲁氏耶尔森菌菌悬液的虹鳟肝、肾、脾、血液样品进行检测。
结果显示, 设计的引物具有良好的种间特异性, 标准曲线线性方程为y = –3.3766x +40.012(R ²=0.9958); 最低检测限为57 copy/μL, 较常规PCR 的灵敏度高出约100倍。
应用检测结果表明, 本方法可准确检测被鲁氏耶尔森菌感染的虹鳟样品。
研究表明, 所建立的qPCR 方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点, 可用于快速诊断虹鳟肠炎红嘴病早期病症及定量检测鲁氏耶尔森菌。
猪捷申病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用
Chinese Journai of Veterinaa Medicine中国兽医杂志2020年（第56卷）第11期37猪捷申病毒TaqMan定量RT-PCR 检测方法的建立和初步应用秦毅斌1,苏乾莲1,赵硕2,卢冰霞1，何颖1,周展宏1,2,李斌1,1,2,赵武1（1.兽医研究所广西兽医生物重验室，530001；2.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005）摘要:为建立猪捷申病毒(PTV)的TaqMan实时荧光定量RT-CR(RT-qPCR)检测方法，在PTV基因组序列保守区设计引物和TaqMan,重组为阳性标准品，通过优化反应,了PTV的RT-qPCR方法，并进行特异性、感性和重复性试验。
结果表明，该方法仅对PTV出现特异性扩增反应，与猪流行性腹泻、猪状、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒等常见猪病毒均无交叉反应。
该方法的标准曲线Ct值与4.6x108~4.6x102拷贝/$L的质粒浓度范围具有良好线性关系，标准曲线方程为C=-3.201xlog?+40.527,线性相关系数(*)为0.996，检测下为4.6x 101拷贝多L对不同浓度的pMD18-PTV进行组内与组间重复检测，每个浓度重复试验的C值的变异系数均小于4.0%，好的重现性。
应所的方法对235份临床猪腹泻进行，PTV阳性32份，性为13.62%$本试验的RT-qPCR方法为PTV实验及研究分析提供了可靠的$关键词：猪捷申病毒；荧光定量RT-PCR;TaqMan探针中图分类号：S852.65T文献标志码：A文章编号：0529-6005(2020)11—0037—06Development and Preliminary Application of a Real-time TaqMan Fluorescent Quantitative RTPCR Assay for Detection of Porcine TeschovirucQU Yi-bin1，SU Qian-lian1，ZHAO Shuv2，LU Bing-xia1，HE Ying1，ZHOU Zhan-hong1，YUAN Ting-ting2，LI Bin1，DUAN Qun-peng1，OUYANG Kang2，ZHAO Wu1(1.Guangpi Veterinaa Research N s/NN，Guangxi Key Laboatoa of Veterinary Biotechnology，Nanning530001，China；2.Colleae of Anival Science and Technolog，Guangxi Universith，Nanning530005，China)Abstract:To establish a real-time TaqMan fuorescent quantitative RT-PCR(RT-qPCR)assay for the detection of porcine te-schovRus(PTV)，p/mem and TaqMan fluorescent probe were desianed according tr the conserved reaion of PTV genome sequence.A recombinant plasmid was constructed as the positive standard sample，and RT-qPCR was developed by optimization of reacting conditions./urthermoro，the specificity，sensitivity and repeatabilith of the established RT-qPCR were tested.Results showed that there was no cross-reaction with conventionai porcine viruses，such as porcine epidemic diarrhea virus，porcine tansmissible gastroenteritis，porcine deeacoanavRus，porcine rotavirus group A，and et ai.The assay was lineas for the template plasmin pMD18-TTV in the range from4.6x108copies/$L te4.6x102copies/$L，the standard equation was C=-3.201x log?+40.527，coeelation coefficient was*=0.996，and detection limit was low te4.6x101copies/$L.Also，the assay showed the good reproducibility with the coefficient of variation(CV)less than4%both in intra-5ssay and inter-5ssay.ThRty-two of the235clinicai fecai samples collected from dVferent areas in Guangi were positive for PTV tested by the developed assay.In conclusion，the development of this assay provides a convenient，specific and sensitive diagnostic method for the PTV detection and epidemiologicai investigation.Key words:porcine teschovRus；real-Cme TaqMan Iuorescent quantitative PCR；TaqMan Iuorescenco probeCorressonding author：ZHAO Wu，E-maii:zhaowul68866@收稿日期：2020—05—10基金项目:广西创新驱动发展专项资金项目（桂科AA17204057）；广西基本科研业务费专项（桂科专项202/19-2）；广西自然科学基金项目（2017GXNSFBA198092）；广西兽医生物技术重点实雌开放基金课题（16A?0A5氨A/17A59A6氨A）；广西柳州市科技计划（2018BH20501）作者简介:秦毅斌（1983-）,男，高级兽医师，硕士，研究方向为动物传染病病原与分子生物学,E-mel：qmymm51??@163•com通讯作者:赵武,E-maii:zhaowu168866@163-com38中国兽医杂志2020年(第56卷)第11期Chinese Journai of Veterinao Medicine猪捷申病(Porcina teschen disease,PTD)，又称塔尔凡病或脑脊髓炎，是由猪捷申病毒(Porcine tv-schovirus,PTV)感染引起的一种猪病毒性传染病$该病首次于1929年在捷克斯洛伐克的捷申地区发现，故命名为“捷申病”，随后传播至北美%非洲、澳大利亚和日本等国家，目前已散布于世界各养猪国家(1猪群感染PTV后，主要表现为腹泻、脑脊髓灰质炎⑵、肺炎、心包炎、心肌炎、皮肤损坏等症状,母猪还可导致繁殖障碍［3］,感染发病猪具有较高的病死率,给养猪业带来了较大经济损失$PTV属于小RNA病毒科(PRomavibdae)捷申病毒属(Teschovirus)成员，病毒粒子呈球形,外层包裹衣壳，无脂蛋白，病毒基因组为单股正链RNA,长约7.2kb,仅含有1个完整的编码1个多聚蛋白的开放阅读框!0RF)，该多聚蛋白被蛋白水解酶裂解为非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D和结构蛋白L、VP1、VP2、VP3%VP4(45)$PTV至少有11个血清型［6］,并且还不断出现新的血清型PTV12(7)、PTV13［8］$研究表明，我国猪群PTV感染较为普遍。
动物荧光定量PCR检测方法
动物组织基因组ＤＮＡ提取试剂盒一、实验前准备（一）、分装反应液（以鸡鸭源为例）１、将反应液（GA）与Bst聚合酶离心15s，取出，在反应液中加入Bst聚合酶全部加入到反应液（GA）中离心15s，将其分装小管中，每个管分23µL。
一般分到24-26个。
2、分装完毕，取密封液加入每个小管中各一滴（所取密封液的枪一定要竖直加入）。
3、全部完毕后将其和试剂盒放到-20℃冰箱中保存。
:注：①每一种试剂盒中，出来反应液与对应的阳性对照不可混用外，其他三种均可通用。
②每一试剂盒中都有反应液、Bst聚合酶、密封液、阴阳对照五种试剂。
（二）、试验中试剂的准备1、Proteinase K：加入600µL Protease Dissolve Buffer至Proteinase K管子中，颠倒混匀使蛋白酶K充分溶解，保存于-20℃。
2、Buffer GW1：加入14mL无水乙醇。
3、Buffer GW2：加入40mL无水乙醇。
注：每一种试剂盒上都有相应的说明。
Buffer GW1和Buffer GW2加入无水乙醇的量按说明书操作。
二、动物组织DNA提取1、取30-100µL Buffer AE（这是一个样品的量，具体量取决于自己做的实验样品的个数），于70℃中预热，备用。
2、取1-20mg的样品，将其剪切成尽量小的碎片，转移到1.5mL的离心管中。
加入230µL Buffer MTL和20µL Proteinase K，涡旋混匀。
55℃水浴1-3h（具体时间看样品的消化情况）。
水浴期间要时常将样品涡旋混匀。
注意：取样量不可以太多，过多会降低产量与纯度。
脾脏、肝脏、肾脏等组织样品富含DNA，不宜超过10mg。
肌肉和皮肤可相应增加到30mg。
3、加入5µL RNase Solution（RNA裂解酶）（枪身不要碰着RNase Solution）至消化液中，涡旋混匀。
猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用
猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用于长青;林树伯;刘乐荣;王庆博;李继良【摘要】用RT-PCR方法扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因片段,并克隆到PUC-T载体中,构建含有PEDV M基因片段的重组质粒.以系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR Green Ⅰ进行PEDV检测的实时荧光定量PCR扩增.结果显示,扩增效率为100.4％,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测520拷贝/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3％.用所建立方法对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率显著(P＜0.05)高于常规PCR方法.研究结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测PEDV的SYBRGreen Ⅰ实时荧光定量PCR方法,可用于PEDV的定量检测和猪流行性腹泻的早期快速诊断.【期刊名称】《北京农学院学报》【年(卷),期】2015(030)003【总页数】4页(P44-47)【关键词】猪流行性腹泻病毒;SYBR Green Ⅰ;荧光定量PCR;早期快速诊断【作者】于长青;林树伯;刘乐荣;王庆博;李继良【作者单位】天津市宁河原种猪场,天津301504;天津市宁河原种猪场,天津301504;天津市宁河原种猪场,天津301504;天津市宁河原种猪场,天津301504;天津市宁河原种猪场,天津301504【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是猪流行性腹泻（PED）的病原，PED是一种急性接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻、脱水消瘦为临床特征，不同年龄大小的猪都容易感染和发病，尤以哺乳仔猪（1周龄内）受害最为严重［1］。
2010年以来，PED在中国多个省份局部暴发，造成新生仔猪大量死亡，给养猪业造成了惨重损失［2－3］。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
兽类学报，2015，35（1）：102－109ActaTheriologicaSinica
基金项目：科技基础性工作专项：畜禽重要疫病流行病学调查（2012FY111000）；公益性行业（农业）科研专项：宠物疫病快速诊断与疫苗研究与示范（201303042）；山东省农业重大应用技术创新项目：水貂犬瘟热、细小病毒防制技术研究作者简介：于永乐（1988－），男，硕士研究生，主要从事动物传染病防治与生物制品学研究.收稿日期：2014－06－11；修回日期：2014－12－04*通讯作者，Correspondingauthors，E-mail：zhangchuanmei100@163.com；shanhu67@163.com
水貂肠炎病毒SYBＲGreenI荧光定量PCＲ检测方法的建立
于永乐张传美*杨海燕杨瑞梅张洪亮单虎*（青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室，青岛266109）摘要：根据GenBank登录的水貂肠炎病毒（MEV）VP2蛋白基因的保守序列设计了1对特异性引物，经PCＲ扩增出146bp的目的片段，并克隆到pMD18－T载体上，提取重组质粒经PCＲ及测序鉴定正确后，以10倍梯度稀释质粒作为阳性标准品，绘制荧光定量标准曲线，以此建立一种基于SYBＲGreen荧光染料的定量PCＲ特异性检测水貂肠炎病毒的方法。结果表明：该方法对MEV有很好的特异性，检测灵敏度为34拷贝/μL，且重复性试验变异系数均小于2%。临床检测中，在80份样品中检测到30份阳性样品，高于普通PCＲ和电镜观察方法的检出率。该方法的建立实现了对MEV临床早期快速诊断和定量分析，为毛皮动物MEV的防控提供了可靠的检测方法。关键词：水貂肠炎病毒；SYBＲGreenI；荧光定量PCＲ中图分类号：Q16文献标识码：A文章编号：1000－1050（2015）01－0102－08
DevelopmentofaSYBＲGreenIreal-timequantitativePCＲassayforthedetectionofMinkenteritisvirusYUYongle，ZHANGChuanmei*，YANGHaiyan，YANGＲuimei，ZHANGHongliang，SHANHu*（ShandongKeyLaboratoryofPreventiveVeterinaryMedicine，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China）
Abstract：AquantitativePCＲassaywasdevelopedforspecificandsensitivedetectionofminkenteritisvirus.Theprimerpairtargetinga146bpfragmentoftheconservedVP2genewasselectedbasedonalignmentofviralsequencesavailableatGenBank.Theanalyticsensibilityofthisassaywas34copiesofplasmidDNA，andithadhighrepeatabilitywithCV＜2%．Theassaywasevaluatedbytesting80fecalsamplescollectedfromsuspiciouscases.Theresultsshowedthat30sam-pleswerefoundpositiveforthevirusinfection，whichwashigherthanthatofroutinePCＲandelectronmicroscopy.There-forethenewassayprovidesausefulmethodfortherapiddiagnosisofminkenteritisandthepreventionandcontrolofthedisease.Keywords：FluorescencequantitativePCＲ；Minkenteritisvirus；SYBＲGreenI
水貂病毒性肠炎是由水貂肠炎细小病毒（Minkenteritisvirus，MEV）引起的一种腹泻、血便等肠炎症状的烈性传染病，与水貂犬瘟热、阿留申病并称为水貂养殖业三大疫病（高云等，1984）。Schofield（1949）首次发现本病，Wills（1952）分离鉴定了病原，并命名为水貂肠炎病毒。姜廷秀等（1981）首先报道了我国发生水貂细小病毒性肠炎。目前，MEV引起的水貂病毒性肠炎仍广泛流行，严重阻碍毛皮动物养殖业的健康发展，特别是给水貂养殖业带来巨大的经济损失（闫喜军等，2008）。MEV属于细小病毒科（Parvoviridae）细小病
毒属（Parovirus），它是目前动物病毒中形态最小、结构最简单的单链线状病毒之一（Parrish，1994）。该病毒对外界环境变化具有极高的耐受性，在粪便中可存活数年之久，易造成貂场的持续感染。目前针对MEV的鉴定和检测已经有许多方法，如电镜观察、血凝及血凝抑制试验、荧光抗体染色技术、1期于永乐等：水貂肠炎病毒SYBＲGreenI荧光定量PCＲ检测方法的建立
酶联免疫吸附试验、LAMP试验以及PCＲ技术等（王建科等，2008；庄金秋等，2011；Wangetal.，2013），但是这些检测方法所需时间长、操作繁琐、不能进行定量分析且灵敏性不高。荧光定量技术具有特异性强、灵敏度高、省时省力等优点，已经成为当前病毒核酸快速高效检测的主要方法（李安等，2009）。本研究以MEVVP2基因为靶基因，所建立的SYBＲGreenI荧光定量PCＲ方法可用于MEV的快速诊断与监测。1研究方法1.1病毒、细胞及临床样品MEV毒株、犬瘟热病毒（CDV3）、阿留申病毒（ADV）、犬腺病毒（CAV）、E.coliDH5α感受态细胞均由青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室保存。80份来自山东各地毛皮动物养殖场送检的疑似水貂病毒性肠炎病料，采病变严重的水貂的肠道粪便进行检测。1.2病毒DNA的提取按照DNAisoＲegent（Takara，中国大连）说明书提取病毒DNA。1.3引物设计与合成根据GenBank上发表的MEV基因组VP2基因序列，选择保守区设计一对引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上游：5’－ATGCTTGGGGAGTTTGGT－3’，下游：5’－CTTTAGTTGGTGGCTGAGTAG－3’，扩增片段长度为146bp。1.4常规PCＲ扩增采用25μL反应体系，10×PCＲBuffer2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，rTaq（5U/μL）0.5μL（Takara，中国大连），MEVDNA2μL，灭菌ddH2O补足25μL。PCＲ反应条件：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s共35个循环；72℃终延伸10min。应用S1000TMThermalCyclerPCＲ仪（BIO－ＲAD，美国）进行目的基因的扩增。反应结束后，取5μLPCＲ产物于1.5%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。1.5质粒标准品构建将PCＲ产物进行胶回收和纯化，回收片段与pMD18－T载体（Takara，中国大连）连接，并转化DH5α感受态细胞，挑选转化长出的菌落进行培养，质粒提取试剂盒（天根，中国）进行质粒提取，并将经PCＲ鉴定阳性的质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。用紫外分光光度计（Eppendorf，德国）测定质粒浓度并计算拷贝数，并根据得到的结果将质粒稀释成1×10－2－1×10－10浓度梯度作为标准样品以备制作标
准曲线。1.6SYBＲGreenI荧光定量PCＲ反应体系和条件
反应体系为20μL，10μLLightCycler○Ｒ480
SYBＲGreenIMaster（Ｒoche，德国），上、下游引
物（10μmol/L）各0.4μL，不同稀释倍数的DNA标准模板1μL，灭菌ddH2O补足体系。
阴性对照
组中模板改用1μL灭菌ddH2O。反应条件：95℃
预变性10min；95℃5s，60℃20s，72℃10s，45个循环。熔解曲线分析条件为：95℃10s，65℃30s，95℃continue。应用LightCycler○Ｒ480荧
光定量PCＲ仪（Ｒoche，德国）进行荧光定量PCＲ反应。1.7标准曲线的绘制
将制备的质粒进行10倍倍比稀释，按10－3、
10－4、10－5、10－6、10－75个浓度梯度作标准品，进行实时荧光定量PCＲ反应生成标准曲线。1.8特异性试验
提取CDV、CAV和ADV病毒的DNA（其中CDV为提取病毒ＲNA后经反转录为cDNA），按照
优化的条件进行荧光定量PCＲ，检测该方法的特异性。1.9敏感性试验
将制备的标准样品10倍倍比稀释后，选取10－2－10－109个梯度进行荧光定量PCＲ检测，测
定该方法的敏感性。同时取倍比稀释的质粒作常规PCＲ，比较两者的敏感度。1.10重复性试验
将重组质粒标准品按10倍系列稀释，选择高、中、低浓度的质粒样本，每个稀释度一次进行3个重复，将结果进行统计分析确定其可重复性。1.11临床样品检测
采取临床送检的80份病料用常规PCＲ和SYBＲGreenI荧光定量PCＲ方法进行检测。
2结果
2.1PCＲ扩增及质粒拷贝数测定
301