山核桃树枝水煎剂对S180荷瘤小鼠细胞因子及端粒酶、Cath-D表达的影响

浙江中医药大学学报２０１５年２月第３９卷第２期　山核桃树枝水煎剂对￥１　８０荷瘤小鼠细胞因子及　端粒酶、Ｃａｔｈ—Ｄ表达的影响　

于晓红’刘澜澜’丛珊　王静。颜培宇　１．黑龙江中医药大学哈尔滨１５００４０　２．齐齐哈尔医学院第二附属医院３．黑龙江省中医药科学院中药所　摘要：【目的】探讨山核桃树枝水煎剂（ＤＪＭ）对Ｓ１８０荷瘤小鼠的免疫调节及其对端粒酶、Ｃａｔｈ—Ｄ在肿瘤组织中表达的影响。【方法］将５Ｏ只清洁级　昆明种小鼠随机分为５组，即正常对照组、荷瘤对照组、实验组（ＤＪＭ）、环磷酰胺组（ＣＴＸ）￣联合用药组（ＤＪＭ＋ＣＴＸ），除正常对照组外其余每组小　鼠腋下接种ｓ１８０细胞混悬液０．２ｍＬ造模，于２４ｈ后给药连续１０ｄ后，应用ＥＬＩＳＡ方法测定血清中细胞因子ＩＦＮ一　ＩＬ一１０、端粒酶含量；应用免疫　组化方法测定肿瘤组织中Ｃａｔｈ—Ｄ蛋白表达水平。【结果】山核桃树枝水煎剂（ＤＪＭ）能够使ｓ１８Ｏ荷瘤小鼠血清ＩＦＮ一　水平升高，ＩＬ一１Ｏ水平下降，且　与模型组比较有显著统计学意义（尸　Ｏ．Ｏ５）；ＤＪＭ能够抑制Ｓ１８０荷瘤小鼠血清端粒酶活性，且与模型组比较有显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０５）；ＤＪＭ能使肿瘤　组织中Ｃａｔｈ—Ｄ蛋白表达下降。【结论】ＤＪＭ对Ｓ１８０荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用可能与调节机体的免疫抑制状态及抑制肿瘤侵袭和转移相关蛋白　Ｃａｔｈ—Ｄ表达的表达有关。　关键词：山核桃树枝水煎剂；ＩＦＮ一　；ＩＬ－ＩＯ；端粒酶；Ｃａｔｈ—Ｄ　中图分类号：Ｒ－２８５．５　文献标识码：Ａ　文章编号：１ｏｏ５—５５０９（２０１５）０２－０１３９—０５　

ＤＯＩ：１０．１６４６６／ｊ．ｉｓｓｎｌ０Ｏ５－５５０９．２０１５．０２．０１７　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｊｕ￣ａｎｓ　Ｍａｘｉｍ＂ｓ　Ｂｒａｎｃｈ　ｏｎ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ａｎｄ　Ｃａｔｈ－Ｄ　Ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　Ｓ１８０　Ｔｕｍｏｒ－Ｂｅａｒｉｎｇ　Ｍｉｃｅ　Ｙｕ　Ｘｉａｏｈｏｎｇ　，　Ｌｉｕ　Ｌａｎｌａｎ　，Ｃｏｎｇ　Ｓｈａｎ２，ｅｔ　ａｌ　１．Ｈｅｉｌｏｎ￣ｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈａｒｂｉｎ（１５００４ＤＪ－Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｑｉｑｉｈ￣Ｍｅｄ—　ｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｊｕｇｌａｎｓ　Ｍａｘｉｍ　Ｓ　ｂｒａｎｃｈ（ＤＪＭ）ｂｅｉｎｇ　ｔａｋｅｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｓ１８０　ｔｕｍｏｒ—ｂｅａｒｉｎｇ　ｍｉｃｅ，ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｈｏｗ　ｔｈｅ　ＤＪＭ　ａａｊｕｓｔｓ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ　ａｌｓｏ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗｈｅｎ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ａｎｄ　Ｃａｔｈ—Ｄ　ｅｘｉｓｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｔｉｓｓｕｅ．　【Ｍｅｔｈｏｄ］５０　ＫｕｎＭｉｎｇ　ｍｉｃｅ　ａｙｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　５　ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｎｏｒｍａｌ　ｇｒｏｕｐ，ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ，ＤＪＭ　ｇｒｏｕｐ，ＣＴＸ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ＤＪＭ＋ＣＴＸ　ｇｒｏｕｐ．Ｍｉｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｌｌ　ｇｒｏｕｐｓ　ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｎｏｍａｌ　ｏｎｅｓ　ａｒｅ　ｕｓｅｄ　Ｓ１８０　ｃｅｌｌ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　０．２ｍｌ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｘｔｅｒ．Ｉｔ　ｉｓ　ｃｏｎｔｉｎｕａｌｌｙ　ｔａｋｅｎ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｆｔｅｒ　２４　ｈｏｕｒｓ。ｗｈｉｃｈ　ｓｉｔｕａｔｉｏｎ　ｃｏｕｌｄ　ｌａｓｔ　１０　ｄａｙｓ．Ｔｏ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＩＦＮ一　，ＩＬ一１０　ａｎｄ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｉｎ　ｓｅｍｍ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　０ｆ　ＥＬＩＳＡ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　Ｃａｔｈ—Ｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｍｍ　ｉｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ．ｆＲｅｓｕｌｔ１　ＤＪＭ　ｅｎａｂｌｅｓ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＩＦＮ一　ｇｏ　ｕｐ　ｂｕｔ　ｂｏｔｈ　ｏｆ　ＩＬ一１０　ａｎｄ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｍａｋｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ。ｔｈｅｒｅ　ｉｓ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｆＰ＜０．０５）．ＤＪＭ　Ｃａｎ　ｃａｕｓｅ　ｔｈｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｔｈ—Ｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｔｉｓｓｕｅ．『Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ１　ＤＪＭ　ｈａｓ　ｅｆｆｅｃｔ　ｔｈａｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｔｈｅ　Ｓ１８０　ｔｕｍｏｒ—ｂｅａｒｉｎｇ　ｍｉｃｅ＇ｓ　ｔｕｍｏｒ，ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ　ｓｔａｔｅ．ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒ　ｉｎｖａｓｉｏｎ　ａｎｄ　ａｌＳＯ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｔｈ—Ｄ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｊｕｇｌａｎｓ　Ｍａｘｉｍ＇ｓ　ｂｒａｎｃｈ；Ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ；ＩＦＮ一　；ＩＬ一１０；ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ；Ｃａｔｈ—Ｄ　山核桃树枝又名胡桃楸，其性温，味甘，具有杀虫　

解毒抗肿瘤的功效。民间食管癌高发区常用其煮水　饮用，亦有用其与鸡蛋同煮作为验方治疗胃癌、宫颈　癌等，具有一定的疗效。本实验室前期工作表明，山　核桃树枝水煎剂（Ｄｅｃｏｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｊｕｇｌａｎｓ　Ｍａｘｉｍ　Ｓ　ｂｒａｎｃｈ，ＤＪＭ）对Ｓ１８０荷瘤小鼠具有抑制作用，其抑　瘤率达３５．５０％，且与环磷酰胺合用抑瘤率为　５３．５２％，并对接受环磷酰胺治疗的小鼠有明显的增　效减毒作用【１１。本文在此基础上，研究了ＤＪＭ对Ｓ１８０　荷瘤小鼠血清免疫相关细胞因子的水平、端粒酶浓　度、Ｃａｔｈ—Ｄ的表达，旨在进一步探讨ＤＪＭ对荷瘤机　体的免疫调节及其对端粒酶、Ｃａｔｈ—Ｄ在肿瘤组织中　表达的影响，为其临床应用提供新的理论依据。　１材料　１．１实验动物清洁级昆明种（ＫＭ）健康小鼠５０　只，体重２０＿２ｇ，６～８周龄，雌雄兼用，购置于黑龙江中　医药大学实验动物中心。（许可证号：黑医实验动物单　项准第６ｌ号。）　１．２药物　山核桃树枝原药材采自黑龙江省林区山　核桃树的嫩枝，切成小段，备用。　

基金项目：黑龙江省自然基金资助项目（Ｄ２０１１５６）　Ｆｕｎｄ　ｐｒｏｊｅｃｔ：Ｉｔｅｍ　ｓｕｐｐｏｓｅｄ　ｂｙ　Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｄ２０１　１５６）　通讯作者：颜培宇，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｐｙｗｒｌｏｋ＠１６３．ｃｏｍ　１．３　ＤＪＭ的制备取切段山核桃树枝５００ｇ，加入５　倍量的清水，冰箱浸泡２４ｈ，将浸泡液与药材一起用　ｌＯ０％￣Ｄ热３０ｍｉｎ，过滤，得药液，将药渣再加入５倍　量的水，加热１００％３０ｍｉｎ，过滤去药渣得药液，并将　两次药液混合加热浓缩至ｌＯＯｍＬ，使生药含量为５　ｇ・ｍＬ～。　１．４瘤株Ｓ　１　８０肉瘤瘤株购置于黑龙江省肿瘤研究　所。　１．５主要试剂及药品小鼠ＩＦＮ一￣／ＥＬＩＳＡ检测试剂　盒、小鼠血清ＩＬ一１０　ＥＬＩＳＡ检测试剂盒、端粒酶　ＥＬＩＳＡ检测试剂盒购于（美国Ｒ＆Ｄ公司）；Ｃａｔｈ—Ｄ试　剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；环磷酰胺　注射液（ＣＴＸ）由江苏恒瑞医药股份有限公司生产，生　产批号为Ｈ３２０２０８５７。　２方法　２．１小鼠模型制备、分组及给药将５０只小鼠随机　分为５组，除正常对照组外，其余４组每只小鼠腋下　接种Ｓ１８０细胞混悬液０．２ｍＬ（无菌取第８ｄＳ１８０腹　水，计活细胞大于９５％，用Ｈａｎｋ　Ｓ液调细胞浓度至　１ｘ１０９／Ｌ），分别为荷瘤对照组、实验组（ＤＪＭ）、环磷酰　胺组（ＣＴＸ）及联合用药组（ＤＪＭ＋ＣＴＸ）。２４ｈ后各组按　０．４ｍＬ／（２０ｇ・ｄ）开始给药，正常对照组：生理盐水灌胃　０．４ｍｌＺ（２０ｇ・ｄ１；荷瘤对照组：生理盐水灌胃０．４ｍＬ／　（２０ｇ・ｄ）；ＤＪＭ组：ＤＪＭ灌胃０．４ｍＬ／（２０ｇ・ｄ）；ＣＴＸ组：生　理盐水灌胃０．４ｍＩ￣２０ｇ・ｄ），腹腔注射ＣＴＸ３０ｍｇ／（２０ｇ・　ｄ）；ＤＪＭ＋ＣＴＸ组：ＤＪＭ灌胃０．４ｍＩｄ２０ｇ・ｄ），腹腔注射　ＣＴＸ３０ｍｇ／［２０ｇ・ｄ），１次／ｄ，连续ｌＯｄ。禁食１２ｈ后，摘眼　球取血后颈椎脱臼处死，剥离瘤组织　。　２．２测定方法　２．２．１小鼠血清中ＩＦＮ一＾ｙ和ＩＬ一１０含量的测定具　体步骤按照所购试剂盒说明书操作，分离各组小鼠　浙江中医药大学学报２０１５年２月第３９卷第２期　血清，应用ＥＬＩＳＡ方法检测各组血清中ＩＦＮ　和ＩＬ一　１０的含量，结果用ＳＰＳＳ１６．０软件进行统计学分析，两　组间比较用ｔ检验。取Ｐ＜０．０５作为差异有统计学意义。　２．２．２小鼠血清中端粒酶含量及肿瘤组织中Ｃａｔｈ—Ｄ　蛋白表达的测定血清中端粒酶含量的测定方法与　ＩＦＮ一　含量测定方法相同。Ｃａｔｈ—Ｄ蛋白表达测定应　用免疫组化法，先分离肿瘤组织，通过常规脱水、固　定、浸蜡、包埋、切片获得石蜡切片，然后进行常规　ＨＥ染色，最后采用ＳＡＢＣ免疫组化染色法，按Ｃａｔｈ—　Ｄ检测试剂盒说明书进行操作，运用多媒体彩色病理　图象分析系统分析。结果用ＳＰＳＳ１６．０软件进行统计　学分析，两组间比较采用ｔ检验。取Ｐ＜０．０５作为差异　有统计学意义。　３结果　３．１本实验ＤＪＭ对Ｓ１８０荷瘤小鼠血清中ＩＦＮ一＾ｙ和　ＩＬ一１Ｏ含量的影响结果显示：荷瘤小鼠血清中　ＩＦＮ一＾ｙ含量明显低于正常对照组（　Ｏ．０５），而ＩＬ—ｌ０　含量明显高于正常对照组（尸　．０５）；使用ＤＪＭ治疗后，　小鼠血清中ＩＦＮ叫含量则高于荷瘤对照组（ｐ　．０５），　而ＩＬ－１０含量明显低于荷瘤对照组（Ｐ　．０５）；使用ＣＴＸ　治疗后，小鼠血清中ＩＦＮ一　含量低于正常对照组（Ｐ＜　Ｏ．０５）、高于荷瘤对照组（Ｐ＜０．０５），但与ＤＪＭ组相比回　升趋势较小，提示ＣＴＸ在发挥其抗肿瘤活性的同时　对ＩＦＮ一＾ｙ含量的提升能力略低于ＤＪＭ；而ＣＴＸ组小　鼠血清中ＩＬ一１Ｏ含量远高于正常对照组，提示ＣＴＸ　无明显的调节免疫抑制的功能；ＤＪＭ与ＣＴＸ合用后，　与荷瘤对照组对比可以明显改善这种抑制作用，提　高ＩＦＮ叫水平（Ｐ＜０．０５），降低ＩＬ一１０的含量（Ｐ＜０．０５），　提示联合用药可以缓解荷瘤机体的免疫异常状态。　见表１。　３．２　ＤＪＭ对小鼠血清中端粒酶含量及肿瘤组织中