常用分子克隆工具酶简介

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第二节 DNA 聚合酶和反转录酶
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DNA 聚合酶：在引物和模板的存在下， 把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链
DNA分子引物链的3′-OH 末端，催化 核苷酸的聚合作用。
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1 DNA polymerase分类
依赖于DNA的DNA聚合酶:
Ecoli DNA polymerase I
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1 外切核酸酶概念 2 分类
按照酶对底物二级结构的专一性，分为： 作用于单链的外切核酸酶 Biblioteka Baidu用于双链的外切核酸酶
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第五节 单链内切核酸酶
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1.1 S1核酸酶
特点： ss-DNA; ss-RNA; 双螺旋变性区 用途 1) 基因突变--缺失，常与外切酶，如ExoIII、
λ外切酶、Bal31连用 2) DNA定序分析 3) S1作图法 4) 基因结构分析 5) tRNA结构分析
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5'
S1核酸酶活性
常用工具酶简介
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第一节 DNA连接酶(DNA ligase)
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1 DNA Ligase 1.1 概念 1.2 分类
根据连接反应时所需能量辅助因子的不同： 依赖ATP的DNA ligase 依赖NAD+的DNA ligase
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按照来源分： T4噬菌体DNA ligase 大肠杆菌DNA ligase 热稳定DNA ligase
5’ 3’ 5’ 3’
DNaseI Pol I
5’ 3’
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1.2 Klenow片段 大肠杆菌DNA聚合酶I的枯草杆菌
蛋白酶水解产物。
活性：5’ 3’聚合酶
3’ 5’外切酶
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用途：
⑴ 3’-末端补平 ⑵ 3’-末端抹平 ⑶ cDNA第二链合成 ⑷ 双脱氧系统测序
DNA pol I DNA pol Ⅱ DNA pol Ⅲ
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DNA pol I特性： ⑴ 5‘-3’DNA聚合酶活性 ⑵ 3‘-5’外切酶活性 ⑶ 5‘-3’外切酶活性 （切口平移）
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DNase I 作用特点
Mn2+存在时
Mg2+存在时
DNaseI与 HO P Pol I 的 切口移位
外切酶活性 无dNTP
聚合酶活性 dNTP
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用途： ⑴补平反应 ⑵末端标记 ⑶抹平反应
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1.4 Taq DNA polymerase
特点：
分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应 温度75-80℃ 。
5’-3’聚合酶活性 5‘-3’外切酶活性
用途：
主要用于DNA的体外扩增
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5’ 3’
5’
5’ 3’ 3’
Taq Pol 和PCR
3’ 变性 5’
5’
3’
3’
5’
3’ 5’ 引物 3’
延伸 5’
5’
3’
3’ 引物 5’ 复性
3’ 5’ 3’ 5’
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1.5 反转录酶(reverse transcripase) 用途：
⑴ cDNA第一链的合成 ⑵补平反应 ⑶用于DNA测序
用途
1) 载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加 重组频率
2) 5’端 核酸末端标记
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碱性磷酸酶与T4 多聚核苷酸激酶活性
5’ P 3’HO
OH3’
I
P 5’
5’HO 3’HO
OH3’ OH5’
5’ P
II
3’HO
OH 3’ P 5’
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第四节 外切核酸酶
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因子
3.3 被连接的是dsDNA 3.4 只能封闭缺口
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4 影响DNA ligase 连接反应的因素
4.1 温度
黏性末端 4-15℃
平末端
10-20℃
4.2 连接酶浓度
平末端 1-2个单位
黏性末端 0.1个单位
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4.3 ATP浓度 4.4 DNA片段末端
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5’ ---------~~ 5’
3’
5’
热变性
3’ 3’
5’
随机引物 ~~~~~~ ~~~~~~ ~~~~~~ ~~~~~~
退火
3’ 3’
5’~~ 5’
-32PdNTP
Klenow 酶
3’ 3’
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5’ 5’~~-------
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1.3 T4 DNA polymerase
特点：
5’→3’聚合酶活性 3’→5’外切酶活性
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第三节 DNA修饰酶
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1.1 末端转移酶（TdT）
⑴ 反应特点
在酶的催化下将dNTP加到DNA分子的3‘OH末 端，催化作用不需要模板。
⑵ 用途
3’-加尾，便于两DNA分子重组 3’-末端标记
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1.2 T4 多聚核苷酸激酶 催化反应： 正向反应 催化5‘-OH末端的磷酸化
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2 DNA ligase简介 2.1 T4 DNA ligase
连接类型： DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA dsDNA的黏性末端和平末端
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2.2 大肠杆菌 DNA ligase
dsDNA的黏性末端和平末端
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3 DNA ligase 催化连接反应的特点 3.1 需要3-OH 和5-P 3.2 需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助因子和激活
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3’-末端补齐 3’-末端标记
5’-ACGTTGCAAACTG-3’ 3’-TGCAACGTTTGAC…..5’
cDNA第二链合成
mRNA 3’-UGCAACGUUUGAC…..5’ c DNA 5’-ACGTTGCAAACTG
GAC
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5’ 3’ 5’
5’ ~~ 5’
klenow片段 T4 phage DNA ploymerase T7 phage DNA ploymerase 耐热DNA聚合酶(Taq 酶) 依赖于RNA的DNA聚合酶: 反转录酶(reverse transcriptase)
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1.1 Ecoli DNA polymerase I 分类：
交换反应
5’ P 3’HO
OH 3’
[γ-32P]ATP
P 5’
5’ 32P 3’ HO
OH 3’
ATP
32P 5’
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1.2 T4 多聚核苷酸激酶
用途： 1) DNA或RNA的5’末端标记 2) 分子克隆过程中以获得5’-磷酸基末端，
便于连接酶反应
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1.3 碱性磷酸酶