以氧消耗速率指导的补料培养基优化提升糖化酶发酵水平
黑曲霉产糖化酶液态发酵条件研究
黑曲霉产糖化酶液态发酵条件研究孙继祥【摘要】The effects of additives,feeding time and feeding quantity on Saccharifying enzyme production by Aspergillus niger fermentation were investigated throug single factor test with the activity of Saccharifying enzyme as indicator.Then the effects of fermentation conditions on Saccharifying enzyme production were investigated by orthogonal experiments.The results suggested that the addition of（NH4） 2SO4 could enhance 17 % enzyme activity,the optimum feeding time was 48h,the best feeding quantity was 6 mL,feeding could prolong fermenting cycle from previous 96 h to 120 h,and the optimum fermentation conditions were 15 % inoculating quantity,50 mL liquid-filling in 250 mL triangle flask,and initial pH value as 4.5.%以糖化酶活力为指标,通过单因素实验,分别考察了添加物、补料时间和补料量对黑曲霉发酵产糖化酶的影响。
通过正交实验,考察了发酵条件对黑曲霉发酵产酶的影响。
培养基优化设计提升多拉菌素生物发酵水平
文章编号：1001-8689(2020)11-1121-12遗传育种与生物合成培养基优化设计提升多拉菌素生物发酵水平赵明霞1,2栗波1,2蔡子豪3薛佳韵3王泽建3梁剑光1,4,*(1 常熟理工学院生物与食品工程学院，常熟 215500；2 苏州大学医学部药学院，苏州 215123；3 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；4 常州大学制药与生命科学学院，常州 213164)摘要：运用响应面法优化了多拉菌素生产菌的发酵培养基。
首先通过单因素实验发现正效应因子；接着采用Plackett-Burman(P-B)设计确定了黄豆饼粉、麦芽糊精和MgSO是影响多拉菌素产量的显著因素；然后利用最陡爬坡试验分别找到3个因4的最佳浓度配比。
筛选并优化得到了最适素的合理浓度范围；并进一步利用中心组合设计优化了黄豆饼粉、麦芽糊精和MgSO41.50g/L，基于此，效价达到了589.43mg/L，验证实验结果与模的培养基浓度为黄豆饼粉17.30g/L，麦芽糊精77.30g/L，MgSO4型预测基本吻合，优化后的培养基工艺能够提升多拉菌素发酵单位20.37%。
5L反应罐上发酵过程生理代谢参数变化表明：优化的培养基能够加促菌体的比生长速率，维持较高的氧消耗速率和产物合成速率，大幅度提升了多拉菌素的发酵生产效率。
关键词：响应面；多拉菌素；培养基优化；发酵中图分类号：R978.1 文献标志码：AImproving the biosynthesis of doramectin production by mutant strain Streptomyces avermitilis 3D-5 by optimizing fermentation mediumZhao Ming-xia1,2, Li Bo1,2, Cai Zi-hao3, Xue Jia-yun3, Wang Ze-jian3 and Liang Jian-guang1,4(1 School of Biological and Food Engneering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500; 2 College of Pharmaceutical Science, Soochow University, Suzhou 215123; 3 State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai Institute of Biomanufacturing Technology ＆ Collaborative Innovation Center, Shanghai 200237;4 College of Pharmaceutical and Life Sciences, Changzhou University, Changzhou 213164)Abstract Objective The fermentation medium compositions for doramectin production by mutant strain Streptomyces avermitilis 3D-5 was optimized through response surface methodology (RSM). Methods Firstly, positive effect factors on doramectin production were found by the one-factor-at-a-time method, and then, soybean cake powder, maltodextrin and MgSOwere screened as the significant factors for doramectin biosynthesis with the Plackett-4Burman (P-B) design. Furthermore, the steepest ascent path was applied to investigate the optimal range of the mediumwas determined composition. Finally, the optimal combination ratio of soybean cake powder, maltodextrin and MgSO4by the Central composite design (CCD). Results Results showed that the doramectin yield rose up to 589.43mg/L,1.50g/L. The under the achieved compositions of soybean cake powder 17.30g/L, maltodextrin 77.30g/L, and MgSO4 verification experiment showed the doramectin yield was consistent with the model prediction (589.43mg/L), which was 20.37% higher than that of the original medium condition. Conclusion The fermentation process physiological收稿日期：2019-12-08基金项目：国家重点研发计划项目(No. 2017ZX07402003)作者简介：赵明霞，女，生于1990年，在读硕士研究生，主要研究方向为微生物制药，E-mail:*********************通讯作者，E-mail:*****************多拉菌素(doramectin)是新一代大环内酯类抗寄生虫药，由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis )突变株在含有前体(环己甲酸(cyclohexanec arboxylic acid ，CHC))的条件下合成的抗生素[1]。
发酵生产中玉米淀粉糖化的优化
发酵生产中玉米淀粉糖化的优化玉米淀粉糖化是一种重要的发酵生产工艺，其优化对于提高生产效率和产品质量具有至关重要的意义。
本文将从玉米淀粉糖化的工艺流程、关键参数及优化策略等方面进行探讨，以期为相关研究和生产提供参考。
玉米淀粉糖化是将玉米淀粉通过特定的酶类和微生物发酵工艺转化成糖类产品的过程。
其主要工艺流程包括原料预处理、糖化发酵、糖液处理等环节。
1. 原料预处理：将玉米淀粉进行湿磨或干磨处理，以提高淀粉的可溶性和利用率，同时进行蒸煮和酶解等步骤，使淀粉得到部分水解和溶解。
2. 糖化发酵：在原料预处理后，需要添加酶类和微生物发酵剂，进行糖化反应。
这一步骤主要是通过酶类的作用将淀粉分解为葡萄糖和其他糖类，以及通过微生物的代谢作用产生一定的发酵产物，同时保持适宜的温度、pH和氧气供应。
3. 糖液处理：经过糖化发酵后的糖液需要进行脱色、脱盐、浓缩等处理，最终得到所需的糖类产品。
二、影响糖化生产的关键参数在玉米淀粉糖化的过程中，有许多关键参数会对糖化生产的效果产生重要影响，包括温度、pH值、酶活性、微生物选用等等。
1. 温度：糖化过程中的温度是影响酶类和微生物活性的重要因素。
合适的温度可以保证酶类和微生物的活性，促进反应速率，达到较高的糖化效率。
一般来说，糖化反应的温度控制在50-60摄氏度之间效果较佳。
2. pH值：酶类和微生物的活性和稳定性也受到pH值的影响。
不同的酶类和微生物对pH值的要求有所不同，但一般来说，控制在5.5-6.5的范围内可以满足绝大多数酶类和微生物的要求。
3. 酶活性：酶类的活性直接关系到糖化过程中淀粉的水解速率和糖类产物的质量。
需要根据不同酶类的特性和用量进行精确控制。
4. 微生物选用：选择合适的发酵菌种对于提高糖化效率和产物质量非常重要。
合适的发酵菌种在糖化过程中能够快速有效地完成淀粉的降解和转化。
三、玉米淀粉糖化的优化策略为了提高玉米淀粉糖化的效率和产物质量，可以从以下几个方面进行优化。
微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)发酵中试条件优化的研究
微生物谷氨酰胺转胺酶（MTG）发酵中试条件优化的研究在本文中,以10升生物反应器为研究基础,对影响微生物谷氨酰胺转胺酶（MTG）合成的操作条件如搅拌和转速以及发酵条件的影响因子如溶解氧和pH 值进行一定的研究,在此研究基础上进行了初步的葡萄糖补料和放大实验研究,最后根据本实验室的发酵体系,在优化好的条件基础上建立了一个包括三个数学方程的MTG分批发酵的动力学模型,其主要结果如下: 1.在摇瓶的基础上,用不同培养基来研究MTG分批发酵的动力学关系,研究表明,MTG分批发酵中细胞生长与产物合成是一种偶联与非偶联的复合模型,产物合成与底物（碳源）消耗是一种直接利用的关系,为进一步的实验研究提供了一定的理论参考。
2.在10升的生物反应器上,对搅拌转速和通气量进行了一定的研究,在本文中350rpm的搅拌转速对细胞生长和产物合成是比较有利的,1.0vvm左右的通气量对细胞生长和产物合成是比较有利的。
最后对通气量和搅拌转速进行了一定的混合,在10升的生物反应器上,在0h-8h前搅拌转速为250rpm,通气为0.6vvm左右,在8h-32h之间,搅拌转速为350rpm,通气为1.0vvm左右,在32h后,搅拌转速为250rpm,通气为0.7vvm左右。
MTG在47小时达到4.36(u.ml<sup>-1</sup>),生物得率系数为1.545(g.g<sup>-1</sup>)。
3.在对MTG自然分批发酵时溶解氧浓度的变化情况分析下,在本文中,在发酵前期高的溶解氧浓度（30%）对细胞的生长和产物的合成都是比较有利的,在发酵后期,低的溶解氧浓度（10%）对提高MTG的量和延长微生物细胞的代谢时间是有效的。
最后对整个发酵过程的溶解氧浓度进行一定的分阶段控制的策略,结果表明,把DO分阶段的控制（前32小时控制在30%左右,32小时后控制在10%左右）这一组合比较合适。
一种提高色氨酸发酵过程中糖酸转化率的方法
提高色氨酸发酵过程中糖酸转化率是发酵工程中的重要问题，对于提高色氨酸产量具有重要意义。
在色氨酸生产过程中，糖酸是一种重要的中间产物，其转化率直接影响到色氨酸的产量。
寻找一种有效的方法来提高色氨酸发酵过程中糖酸的转化率，对于色氨酸生产工艺的改进具有积极的意义。
一种提高色氨酸发酵过程中糖酸转化率的方法，可以通过以下几个方面进行探讨：一、优化发酵菌种1. 寻找高效发酵菌种在色氨酸发酵过程中，选择合适的发酵菌种是至关重要的。
可以通过筛选不同的微生物菌株，选取对糖酸转化率具有较高活性的菌种，比如重组菌株和高产色氨酸的野生菌株等。
2. 调控发酵菌种的生长环境发酵菌种在生长过程中所需的营养物质、温度、pH值等因素对于其代谢产物的形成具有直接的影响。
可以通过合理调控发酵菌种的生长环境，例如添加适量的氮源、磷源，控制发酵温度和维持合适的pH值等，来提高糖酸的转化率。
二、增加底物利用效率1. 优化培养基配方培养基中不同碳源和氮源的选择及其质量浓度比例，对糖酸转化率有着直接影响。
可以通过优化培养基配方，使得底物的利用效率得到提高，从而提高糖酸的转化率。
2. 提高底物的有效利用通过改进底物的预处理工艺，提高底物的有效利用率，比如利用生物转化来增加底物的利用效率，通过改进葡萄糖转化酶活性和特异性从而增加色氨酸的产生。
三、调控相关代谢途径1. 基因改造利用基因工程手段，对关键酶基因进行改造，使得有利于糖酸转化的酶活性得到增强，从而提高糖酸的转化率。
2. 代谢工程通过代谢工程手段，调控相关代谢途径，使得碳通量向有利于色氨酸合成的途径进行导向，从而提高色氨酸的产量。
提高色氨酸发酵过程中糖酸转化率的方法可以从优化发酵菌种、增加底物利用效率以及调控相关代谢途径等多个方面进行探讨。
通过上述多种手段的综合应用，可以有效提高色氨酸发酵过程中糖酸的转化率，从而提高色氨酸的产量，为色氨酸生产工艺的改进提供了重要的理论和实践基础。
希望通过全体科研工作者的不懈努力，可以为色氨酸产业的发展做出更大的贡献。
甘蔗糖化过程中发酵剂选择的研究与优化
甘蔗糖化过程中发酵剂选择的研究与优化甘蔗糖化过程是蔗糖转变为乙醇的关键步骤之一，而发酵剂的选择在这一过程中起着重要的作用。
本文将探讨甘蔗糖化过程中发酵剂选择的研究与优化。
糖化是将甘蔗中的蔗糖分解为葡萄糖的过程。
发酵则是将葡萄糖转化为乙醇的过程。
因此，在甘蔗糖化过程中，发酵剂的选择至关重要。
一个好的发酵剂能够高效地将葡萄糖转化为乙醇，并且具有良好的生长和发酵特性。
研究和优化发酵剂的选择将有助于提高甘蔗糖化过程的效率和产量。
首先，选择发酵剂的种类是研究的重点之一。
目前，常用的发酵剂包括酿酒酵母、乳酸菌和乙酰酸菌等。
酿酒酵母是最常用的发酵剂之一，它具有较高的葡萄糖转化率和产乙醇能力。
乳酸菌和乙酰酸菌则可以将葡萄糖转化为乳酸和乙酸等有机酸。
在选择发酵剂种类时，需要考虑到发酵的最终产品以及产量需求。
其次，优化发酵条件也是至关重要的。
发酵的条件包括温度、pH值、氧气供应和营养物质等因素。
温度对发酵剂的生长和代谢活性有着重要影响。
一般来说，酿酒酵母适宜的温度范围为25-30摄氏度，而乳酸菌和乙酸菌适宜的温度范围则较低。
pH值是另一个决定发酵条件的重要因素。
不同的发酵剂对pH值的适应性各不相同，因此在选择发酵剂时，需要考虑到所需的pH范围。
此外，适当的氧气供应和充足的营养物质也是发酵过程中必不可少的条件。
此外，还可以通过发酵剂的固定化和重组技术来优化甘蔗糖化过程。
固定化技术是将发酵剂固定在固定化载体上，以提高发酵剂的稳定性和重复使用性。
通过固定化技术，可以降低发酵剂的使用量和提高发酵的效率。
此外，通过重组技术，可以改良发酵剂的性能和功能。
例如，通过重组技术，可以改变发酵剂对不同底物的反应特性，从而提高底物的利用率和产物的选择性。
最后，对于甘蔗糖化过程中发酵剂选择的研究与优化，还可以利用传统的试验方法和现代的计算模拟方法相结合。
传统的试验方法可以获得发酵剂在不同条件下的生长和发酵特性数据。
而计算模拟方法可以基于这些数据，进行发酵过程的模拟和优化。
7发酵工艺控制(3)
种子质量
种子的质和量影响： 发酵期间菌种生长的快慢 产物合成的多寡
一般，种龄是对数生长期的后期。 太年轻的种子… 过老的种子… 不同品种、不同工艺条件的发酵，最适种龄也不尽相 同，要经多次试验而定。
种龄
常用接种量为5％～10％。
接种量是由菌的生长繁殖速度决定的。
大接种量…
接种量过大…
接种量
温度对发酵的影响
组分体现的。有些带巯基的酶对高浓度的氧敏感。
三、溶氧作为发酵异常的指示
(1)、有些操作故障或事故引起的发酵异常现象能从溶 氧的变化中得到反映。 例 1：停搅拌，未及时开搅拌或搅拌发生故障，空气 未能与液体充分混合均匀等都会使溶氧比平常低许多。
(2)、中间补料是否得当可以从溶氧的变化看出。 例如：赤霉素发酵，有时会出现‘发酸’现象。这时，
(7-35)
dc／dt为单位时间内发酵液溶氧浓度的变化，mmol02／(L· h)；
cL为发酵液中的溶氧浓度，mmol／L。
凡是使KLa和c*增加的因素都能使发酵供氧改善。
增加c*的办法 ①、提高氧分压：在通气中掺入纯氧或富氧； ②、提高罐压：但同时也会增加溶解C02的浓度，因它 的溶解度比氧高30倍，这会影响pH和菌的生理代谢，
pH的控制
首先从基础培养基的配方考虑，然后通过加酸碱或中间补 料来控制。 如在基础培养基中加适量的 CaCO3 ；常用 NaOH 或 Ca(OH)2调节pH，也需注意培养基离子强度和产物可溶性。
链霉素的发酵：采用过程通NH3控制pH，也补充了 N 源。但在通氨过程中监测溶氧浓度的变化防止 菌中毒。
养基、中间补水、添加表面活性剂等。
可明显提高产胶量约20％。
例2：四环素发酵的温度控制：0～30h，稍高温度促进生长， 缩短发酵周期；30～150h稍低温度维持较长生产期。 例3：青霉素发酵的变温控制：0~5h ，30℃； 5~40h，25℃；40~125h，20℃；125~165h ，25℃。
微生物发酵培养基的优化方法
微生物发酵培养基的优化方法微生物发酵培养基是指为微生物提供合适的生长环境、碳源、氮源以及其他必需营养物质的复杂液体或固体介质。
优化培养基是通过调整培养基成分来提高微生物的生长速度和产物产量，保证产物质量和生产效率。
本文将介绍一些优化微生物发酵培养基的方法。
1.确定微生物的需求不同的微生物对培养基的成分有着不同的要求，包括碳源、氮源、矿物质以及其他生长因子等。
因此，首先需要明确所需微生物对营养物质的需求，有助于指导后续优化工作。
2.碳源优化3.氮源优化氮源对微生物生长和代谢至关重要，可以通过改变氮源种类和浓度来优化培养基。
常用的氮源包括氨基酸、尿素、硝酸盐等。
可以试验不同的氮源和浓度，根据微生物生长状况和产物产量来确定最佳氮源。
4.矿物质优化5.添加生长因子一些微生物需要特定的生长因子才能生长和产生产物，如一些维生素、辅酶等。
了解微生物所需的生长因子并添加到培养基中，可以提高微生物的生长速度和产物产量。
6.调整pH值和温度微生物对pH值和温度的要求较为敏感，因此需要优化培养基的pH值和温度来提供最适宜的生长条件。
通过试验不同pH值和温度对微生物的影响，选择最佳的pH值和温度来优化培养基。
7.添加表面活性剂表面活性剂可以增强微生物与培养基之间的接触，促进培养基中的气液传质。
添加适量的表面活性剂，可以提高微生物的生长速率和产物产量。
8.优化培养条件除了调整培养基的成分外，优化微生物发酵培养基还需要考虑一些培养条件，如培养基的搅拌速度、培养温度、空气进气率等。
通过优化这些培养条件，可以提高微生物的生长速度和产物产量。
综上所述，优化微生物发酵培养基是一个复杂而繁琐的过程，需要根据具体微生物的要求和反应机制来选择合适的调整方法。
通过调整培养基成分、添加生长因子、调整pH值和温度、添加表面活性剂以及优化培养条件等方法，可以提高微生物的生长速率和产物产量，保证产品质量和生产效率。
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以氧消耗速率指导的补料培养基优化提升糖化酶发酵水平张士杨;王泽建;王兴吉;郭美锦;储炬;庄英萍;张嗣良【摘要】黑曲霉产糖化酶发酵过程数据显示,发酵中后期产酶速率的下降与采集的生理代谢参数氧消耗速率(oxygen uptake rate,OUR)的降低有着重要相关性,OUR 的降低与某些营养元素控制的菌体生长和代谢有关.该文利用Design Expert软件,通过单因素筛选实验、Plackett-Burman设计和中心组合设计对黑曲霉产糖化酶发酵过程中的补料培养基进行优化,确定了流加培养基:棉籽蛋白4.19 g/L,糖蜜9.01 g/L,硫酸铜0.015 g/L,由此明显改变了后期OUR快速下降和产物合成速率降低的问题.50 L反应器中的发酵验证实验表明,添加了优化的补料培养基的糖化酶酶活比未添加的罐批提升了11.35％以上,可明显提升糖化酶生产效率.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2016(042)004【总页数】7页(P17-23)【关键词】氧消耗速率(OUR);黑曲霉;糖化酶;补料培养基;优化;Plackett-Burman 设计;中心组合设计【作者】张士杨;王泽建;王兴吉;郭美锦;储炬;庄英萍;张嗣良【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;山东隆大生物工程有限公司,山东临沂,276410;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237【正文语种】中文糖化酶(葡萄糖淀粉酶)，又称为γ-淀粉酶或淀粉葡萄糖苷酶，是食品工业中一种需求量很高的商业生物催化剂，近年来已经变成工业酶的第二大市场[1]。
随着我国淀粉糖业的快速发展，糖化酶的需求量日益增加，同时随着能源和生产原材料价格的增加，市场竞争力和利润空间越来越小，提高糖化酶的生产能力，降低生产成本，是提升该产业市场竞争力的关键。
众多研究报道显示，初始培养基的优化[2-5]、不同发酵容器的优化、分批培养连续培养的应用[6-8]，以及培养条件如含水率、温度、pH、溶氧、搅拌的优化[9-10]等均可以较好地提高糖化酶的生产水平。
但在工业生产过程中仍然面临发酵中后期酶增加缓慢，转化率低的普遍现象，在线生理代谢参数及相关性分析的缺乏已成为进一步优化生产控制工艺，提升发酵水平的关键。
本文结合糖化酶发酵过程生理代谢参数的采集系统，利用多参数相关分析找到了氧消耗速率(oxygen uptake rate，OUR)控制与产物合成的相关性，并通过单因素筛选实验、Plackett-Burman设计和中心组合设计考察了补料培养基与生理代谢参数的变化，证明了结合统计学方法和生理代谢参数OUR进行补料培养基的优化，进而提高糖化酶在反应器水平上的产量的可行性，为进行下一步相关优化实验提供了理论基础。
1.1 材料1.1.1 菌株产葡萄糖淀粉酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger LDM3，由山东隆大生物工程有限公司提供。
1.1.2 培养基种子培养基(g/L)：玉米淀粉80，玉米浆12，豆饼粉8。
发酵培养基(g/L)：玉米淀粉200，玉米粉50，豆饼粉12，玉米浆18，KH2PO4 10，(HN4)2SO4 2，CaCl2 0.3。
补料培养基(g/L)：1水葡萄糖500，CaCl2 0.375。
1.2 实验方法1.2.1 种子培养将茄子瓶于34 ℃的恒温培养箱中培养5 d后刮下菌苔接种于装液量为400 mL的2 L摇瓶中，然后放置于34 ℃的摇床间260 r/min培养72 h。
之后接种于15 L 种子罐中，通过调节转速和通气使溶氧不低于30%，待残糖质量浓度降至50 mg/mL时移种于50 L罐。
1.2.2 50 L罐培养本研究采用50 L搅拌式生物反应器(上海国强生化装备有限公司)，初始装液量为25 L，接种量为5 L，33 ℃，发酵过程中通过流加氨水控制pH为4.5～4.6。
前期通过调节通气和搅拌控制溶氧不低于40%，直至达到最大转速(550 r/min)和最大通气量(5 500 L/min)都无法改变的氧限制阶段。
分别通过溶氧电极和pH电极(梅特勒-托利多，瑞士)在线监测溶氧(DO)和pH。
当发酵液中残糖浓度降至50 mg/mL时开始补料，并且在之后的发酵过程中控制DE值在35～45 mg/L。
当菌体分化结束后(即溶氧回升阶段之后)将一部分发酵液转移至摇瓶中继续培养。
1.2.3 摇瓶培养本研究采用500 mL摇瓶，装液量为40 mL，在接受50 L罐转移的发酵液之后放置于34 ℃的摇床间190 r/min进行培养。
1.3 分析方法菌体浓度(以PMV表示)的测定：取发酵液10 mL于离心管中，4 000 r/min离心10 min后,沉淀物占10 mL发酵液的体积百分比即为菌体浓度。
残糖浓度的测定：按照萨氏法进行测定[11]。
NH2-N浓度测定：按照甲醛氧化法进行测定[12]。
糖化酶酶活的测定：酶活使用淀粉葡萄糖苷酶(AGI)表示。
1个AGI单位定义为：在pH 4.3和温度60 ℃条件下每分钟从可溶性淀粉水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。
50 mg糖化酶标品对应大约2 500 AGI。
糖化酶酶活量测量：230 μL p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(AGIsub)试剂(37 ℃预热5 min)与20 μL发酵上清液混合，37 ℃反应20 min后加100 μL AGIsub试剂，在405 nm下测量混合液体吸光度来定量糖化酶。
尾气测定：发酵过程中的摄氧率(OUR)由过程尾气质谱仪(MAX300-LG，Extrel，USA)测得的氧气含量经软件Biostar计算得到[13]。
1.4 实验设计黑曲霉产糖化酶发酵过程OUR、溶氧及酶活变化曲线如图1。
由图1可明显看出，71 h左右溶氧开始回升，OUR亦快速增加，此时菌体开始分化。
当OUR达到峰值，溶氧重新回到氧限制阶段后菌体分化结束。
结合酶活变化曲线可知，在菌体分化阶段，产酶速率稍有减慢(75～91 h)，分化结束后OUR开始下降，产酶速率随之降低，110～130 h期间OUR下降幅度较91～110 h有所减小，产酶速率较前一阶段亦有所增加，130 h后OUR再次急剧下降，产酶速率再次变慢，由此得知中后期产酶速率的下降与OUR有着密切联系。
而OUR的降低与某些营养元素控制的菌体生长和代谢有关，后期补料又仅有糖和氯化钙两种，所以本文希望通过优化补料培养基来改变中后期OUR下降的不利状况，进而提高产酶速率。
1.4.1 单因素筛选实验根据文献及先前实验经验总结，共挑选出19个不同因素(棉籽蛋白、甜菜碱、糖蜜、硝酸钠、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氯化锌、硫酸铜、氯化钴、硫酸亚铁、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、乙酸钠和甘油)进行单因素补料培养基优化实验，其中棉籽蛋白来源于中棉紫光生物科技有限公司，糖蜜来源于沈阳糖蜜科技有限公司。
1.4.2 筛选实验设计——Plackett-Burman设计经单因素筛选实验后，选出8个主要因素应用Design Expert软件(Stat-Ease Inc, Minmeapolis, USA)进行Plackeet-Burman 设计(表1)。
对补料培养基优化的8个主要因素进行筛选还需要外加3个虚拟变量，每个变量分别确定(+1)和(-1)两个水平，共进行12次实验。
每次实验都重复3次并且将酶活的平均值作为最终结果。
Plackeet-Burman实验设计中，因素筛选应用了线性函数，忽略交互作用，一阶线性模型方程式如公式(1)：Y=β0+∑βiXi式中：Y为响应值，即酶活差值(酶活差值=摇瓶培养测得酶活-初始离罐测得酶活)；β0是模型截距；Xi 是考察因素；βi是线性回归系数，反应Xi的影响程度。
1.4.3 优化实验设计——中心复合设计(CCD)为了确定由Plackeet-Burman筛选出的最主要因素的最优浓度，本文又进行了中心复合设计Central Composite Design(CCD)实验。
CCD是一种常用的响应面设计方法，能在进行最少的实验次数来拟合响应面模型。
该模型的每个因素通常有5个水平(-1.68, -1, 0, +1,+1.68)，如表3。
根据Design Expert软件的实验设计，共进行20次实验，并得到一个二阶线性回归方程，如式(2)。
式中：Y代表响应值(酶活差值)；X1、X2和X3代表独立变量；β0代表在中心点的回归系数；β1，β2和β3代表线性系数；β12，β13和β23代表二阶交互作用系数；β11，β22和β33代表二次项系数。
1.4.4 50 L罐优化实验将15 L种子罐的种子液各接5 L于2个50 L罐中，保持发酵过程中操作参数的一致性。
在补料阶段，一个反应器补入原配方补料，另一反应器除补入原配方补料外，在菌体分化后(96 h)再补入最优补料培养基，分多次补入，观察OUR和酶活的差异变化。
2.1 单因素筛选实验结果与分析单因素实验结果如表3。
由表3可知，经14 h的摇瓶培养后一部分影响因素对应的酶活得到提升，其中酵母膏和硫酸亚铁两因素提升幅度最大，达到了15%以上。
而另一部分影响因素(主要为氮源)对应酶活均有明显下降，但培养35 h后，这部分因素中某些因子对应的酶活提高了近10%，这可能是因为在初始培养阶段，营养元素先用来合成菌体，之后才开始大量合成糖化酶。
而培养35 h后各因素对应酶活相对培养14 h后的酶活增长速率，即在14 h后各因素对应酶活在每小时的增量，则表明各因素在14 h后对酶活的贡献大小，对考查各因素在较长时间培养过程中对产酶的影响有较大帮助。
综合3组数据，筛选出棉籽蛋白、甜菜碱、糖蜜、硝酸钠、硫酸铵、磷酸二氢钠、硫酸铜和硫酸亚铁8个因素进行下一步的优化实验。
2.2 Plackett-Burman实验设计结果与分析运用Design Expert软件进行Plackett-Burman设计并进行实验，得到的结果如表4。
利用Design Expert软件对表4中的酶活差值进行计算分析后得到每个影响因素的回归系数及其显著性，如表5。
由表5可知，标准误差为0.29，影响水平的值有正有负，正值表示正效应，负值表示负效应。
以X1为例，其影响水平为-1 005.29，为负效应，即随着棉籽蛋白浓度的增加，酶活差值呈下降趋势，故在后续的因素优化实验中应减少其浓度。
另由表5可明显看出，因素X1、X2 及X8的影响率分别为20.98 %、30.56 %和23.94 %，较之其他因素明显增高，所以显著性分析结果为重要，即X1(棉籽蛋白)、X2 (糖蜜)及X8(硫酸铜)为主要影响因子。