HPLC法测定人血浆中5—氟尿嘧啶的浓度

HPLC法测定人血浆中5—氟尿嘧啶的浓度

目的探讨快速测定人血浆中5-氟尿嘧啶浓度的方法。方法对血浆使用乙酸乙酯两次提取处理后，采用HPLC法加以测定。结果在0.48～61.4μg·mL-1范围内5-氟尿嘧啶血药浓度线性关系良好，日内RSD为5.12%～9.98%，日间RSD 为5.26-10.96%（n=5），且3种浓度的方法回收率均超过85%。样品在室温条件、冻存条件、反复冻融条件下稳定性良好。结论采用此方法测定人血浆中5-氟尿嘧啶的浓度操作简便，稳定性高，同时还可用于5-氟尿嘧啶的药代动力学的研究。

标签：HPLC；5-氟尿嘧啶；浓度；测定

5-氟尿嘧啶是尿嘧啶的类似物，常被用于肿瘤的治疗。但5-氟尿嘧啶在体内的半衰期短，而且毒副反应比较大，吸收不规则。如果药物在体内浓度过高，还会使人发生毒副反应，对人体正常组织也将产生一定的毒性作用。因此，对人血浆中5-氟尿嘧啶的浓度进行测定对于药动力学研究具有重要意义。

1 仪器与试剂

仪器包括高效液相色谱仪、XW-80涡旋混合器、B160A型医用低速离心机、5417R小型台式高速离心机、真空离心浓缩仪。试剂为sigma公司生产的5-氟尿嘧啶对照品，水为自制去离子水，其余为分析纯。

2 测定方法

2.1 色谱条件色谱柱：Ultimate C18色谱柱（250mm×4.5mm，5μm）。流动相：10mmol·L-1KH2PO4。柱温：40℃。流速：1.0mL·min-1。检测波长：265nm。进样量：20μL。

2.2 对照品溶液配制称取5-氟尿嘧啶对照品30.7mg，放置在25mL量瓶中，然后放入1mL盐酸，使用蒸馏水定容到刻度，制得对照品溶液。

2.3 血浆样品处理对符合要求的患者取血浆100μL，放置在5mL的玻璃试管，再放入2mL乙酸乙酯，震荡2min后，在离心机上3200r·min-1离心5min，将上层析液放置在另一玻璃试管。然后加入2mL乙酸乙酯，开始第二次提取，震荡两分钟后，在离心机上3200r·min-1离心5min，再次提取上层析液。将两次提取的析液合并，离心浓缩挥干，然后加入100μL流动相，混合均匀，放置在EP管中，进行10000r·min-1离心7min，取上清液20μL进样。

2.4 专属性考察按照上述方法取空白血浆200μL后，取上清液20μL加以分析，制得空白血浆色谱图，对空白血浆的干扰情况进行判断。取5-氟尿嘧啶的对照品20μL加以分析，得到5-氟尿嘧啶对照品的色谱图，并判断5-氟尿嘧啶在此方法下的出峰情况。然后将空白血浆与5-氟尿嘧啶对照品混合，同样按照上述方法，取上清液20μL加以分析，得出血浆+5-氟尿嘧啶对照品色谱图。

2.5 线性关系考察取8份空白血浆，分别加入5-氟尿嘧啶对照品与蒸馏水配置的系列标准液，混合均匀，使血浆药物浓度分别为0.48、0.96、1.92、

3.84、7.68、15.35、30.7、61.4μg·mL-1，按照上述方法对血浆进行处理，分别取20μL 进样，采用HPLC法分析，得到5-氟尿嘧啶不同浓度的峰面积，进行回归分析，得到回归方程为Y=0.5422X-0.0918（r=0.9998，n=8）。结果表明5-氟尿嘧啶在人血浆中的药物浓度在0.48～61.4μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.6 回收率試验配置5-氟尿嘧啶3种不同浓度的含药标准血浆，对每个浓度进行5样本分析，连续3d分别处理和测定。将得出的峰面积代入标准曲线，计算RSD，求得回收率。

2.7 稳定性试验配置3组含5-氟尿嘧啶1.92、7.68、30.7mg·L-1的样品共15个，分别考察在室温、长期冻存、冻融条件下的稳定性。室温放置1、2、3d，冻存条件为-20℃10、20、30d，反复冻融1、2、3次。测得RSD均小于10%。

2.8 样品质量控制分别配置浓度为1.92、7.68、30.1 mg·L-1的血浆样品各12份，放置在-20℃条件下备用。检验血样时需同时检验3种浓度的样品。如果相对回收率在85%～115%，检验结果为正常。

3 讨论

5-氟尿嘧啶是临床中常用的抗肿瘤药物，另外还可用于介入治疗胸腹水。测定患者所用药物的代谢状况是5-氟尿嘧啶个体化用药的切入点[1]。5-氟尿嘧啶水溶性强，以往研究显示，若5-氟尿嘧啶浓度过大，会导致细胞大量死亡，使可供测定的细胞数量减少；若5-氟尿嘧啶浓度过小，会导致细胞内药物浓度过低，无法准确测出[2]。所以采用有机溶剂提取后浓缩更方便提高检测的灵敏度。

本次实验显示，5-氟尿嘧啶的血药浓度在0.48～61.4μg·mL-1内线性关系良好，日内RSD为5.12～9.98%，日间RSD为5.26%～10.96%（n=5），且不同浓度的方法回收率均能够大于85%，在室温、冻存、反复冻融条件下亦能保持很好的稳定性，说明此方法测定5-氟尿嘧啶的血药浓度操作简便，准确性和稳定性高。

参考文献：

[1]秦志红，秦志凤，赵丽，等. HPLC法测定血浆中5-氟尿嘧啶水平[J].山西职工医学院学报，2008，18（04）.

[2]黄灿，许杜娟，夏泉，等.HPLC法测定肿瘤细胞中5-氟尿嘧啶的浓度[J].安徽医药，2012，16（02）.