乌骨藤中五环三萜类化合物的分离鉴定_张慧

乌骨藤中五环三萜类化合物的分离鉴定

张慧

1,2

　翟延君2　初正云2　韩炜3　裴志东

2

才凤1　张雪莹2　李玉新

*1

1

(东北师范大学国家教育部农业与医药基因工程研究中心,长春130024)

2

(辽宁中医药大学药学院,大连116600) 3(国家食品药品监督管理局药品审评中心,北京100038)

摘　要　利用硅胶柱色谱法、Sephadex LH -20凝胶柱色谱法及半制备高效液相色谱法,从乌骨藤的正丁醇萃取物中分离得到4种五环三萜类化合物。利用核磁共振谱、质谱、红外光谱等分析方法对化合物结构进行了分析和表征,确定了4种化合物分别为β-香树脂醇(β-a m yrin )、白桦酯醇(betulin )、白桦酯酸(be t u linic ac i d )和羽扇豆醇(l upeo l ),它们为首次在牛奶菜属植物中发现,其中后3种化合物具有抗肿瘤活性。关键词　乌骨藤,五环三萜,分离,鉴定,抗肿瘤活性

　2007-01-09收稿;2007-04-02接受本文系国家自然科学基金(N o .30670220,30472169)和吉林省科技发展计划(No .20060904)重点资助项目*E -m ail :s yyycs 2000@si na .co m

1　引　言

中药乌骨藤为萝藦科牛奶菜属植物通关藤M ars deni a tenocissi m a (Roxb )W igh t etA rn 的干燥藤茎,始载于《颠南本草》,主产于云南、贵州地区,具有清热解毒,止咳平喘、散结止痛等功效。现代药理已证实具有调节免疫功能、抗肿瘤等作用。目前临床上作为治疗肿瘤一线药物用于治疗胃癌、肝癌、宫颈癌

等[1]

。本研究利用硅胶柱色谱法、Sephadex L H -20凝胶柱色谱法及半制备高效液相色谱法,从乌骨藤正丁醇萃取物中分离得到4种五环三萜类单体化合物。有关中药乌骨藤化学成分研究多集中在甾体皂苷和多糖类成分,五环三萜类化学成分研究报道少见。本研究利用核磁共振谱、质谱、红外光谱等分析方法鉴定了4种化合物,即:β-香树脂醇Ⅰ、白桦酯醇Ⅱ、白桦酯酸Ⅲ、羽扇豆醇Ⅳ。它们为首次在中药乌骨藤和牛奶菜属植物中发现,其中后3种化合物具有抗肿瘤活性

[2,3]

。

2　实验部分

2.1　仪器与试剂

YANOCO MP -S 3型显微熔点测定仪(日本芝山制作所);B ruker -ARX -300型核磁共振仪(T M S 内标,瑞士Bruke r 公司);1100系列SL 离子阱质谱仪(美国安捷伦公司);Q -TofM icr o 高分辨质谱仪(英国M icr o m ass Inc .,M anchester );Bruke r I FS -55型傅立叶变换红外分光光度计(瑞士B ruke r 公司);W aters

半制备高效液相色谱仪(美国W aters 公司);1100分析型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。薄层层析硅胶GF 254、柱层析硅胶(青岛海洋化工厂);Sephadex L H -20凝胶(Pha r m ac ia 公司);甲醇为色谱纯(美国迪马公司);其它试剂为分析纯。

乌骨藤购于安国市杏林药材有限公司,经辽宁中医药大学中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为M ars -denia te nocissi m a (Roxb )W ight etA rn 的干燥藤茎。

2.2　样品的提取

取乌骨藤干燥药材50kg ,粉碎,分别用70%乙醇8倍、6倍量回流提取2次,每次2h ,合并2次提取液,减压浓缩至浸膏,加水溶解,依次用石油醚、乙酸乙酯、水孢和正丁醇萃取3次,合并正丁醇萃取液,减压回收正丁醇并浓缩得浸膏392g 。2.3　样品的分离

2.3.1　硅胶柱和凝胶柱色谱分离　取上述正丁醇萃取后的浸膏114g ,经硅胶柱层析色谱分离,依次以

第35卷

2007年9月 分析化学(FENX I HUAXU E )　研究简报Chine se Journal o fA na l y tica lChe m istry

第9期

1377～1380

氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱,分段接收,共得到26个流分。其中流分2再经硅胶柱层析色谱分离,分别以石油醚-乙酸乙酯溶剂系统梯度洗脱,收集体积比为100∶6和100∶18洗脱部分;流分4再经硅胶柱层析色谱分离,分别以氯仿-乙酸乙酯溶剂系统梯度洗脱,收集体积比为100∶2和100∶15洗脱部分,其中体积比为100∶2的洗脱部分在氯仿中反复重结晶得化合物Ⅰ16.4m g 。体积比为100∶15洗脱部分再经Sephadex L H -20凝胶柱色谱分离,收集氯仿-甲醇混合溶剂(1∶2)洗脱部分。取上述3个洗脱部分,经TLC 检识,成分有所交叉,故将三者合并,甲醇超声溶解,备用。

2.3.2　半制备液相色谱分离　取上述溶液,用0.45μm 微孔滤膜滤过,注入半制备液相色谱仪。色谱条件为色谱柱:Pheno m enex K r o m asil C 18(250mm ×10mm .i d .,5μm );流动相:甲醇-水(98∶2,V /V );进样浓度:5g /L ;进样量:600μL ,流速:4m L /m i n ;柱温:25℃;检测波长:210nm 。根据色谱峰出峰时间接受流分,分离得到化合物Ⅱ23.6m g 、化合物Ⅲ30.1m g 和化合物Ⅳ27.1m g ,纯度>96%。2.4　样品结构的测试

取上述4种化合物分别进行核磁共振谱(NMR )、质谱(MS )、红外(I R )光谱的测试。NM R 测试条件:化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ以CDC l 3为溶剂,化合物Ⅲ以C 5D 5N 为溶剂,T M S 为内标;I R 测试条件:KB r 压片;HRMS 测试条件:离子源为API -ES ,正离子或负离子方式检测,去溶剂化气为N 2;低分辨ES I -M S 测试条件:离子源为ESI ,正离子和负离子方式检测,去溶剂化气为H e 。

3　结果与讨论

3.1　半制备液相色谱分离条件的优化

硅胶柱等分离得到的样品采用半制备液相色谱进行分离纯化。本实验对制备液相的色谱柱、流动相比例、进样浓度、进样体积及流速等进行了优化。选用了Zor bax C 18和Nuc leosil C 18、K r o m asilC 183种型号的色谱柱进行分离

[7]

,结果显示,K r o m asilC 18柱分离效果良好。分别选用了甲醇-水、甲醇-0.1%磷

酸和乙睛-水等不同比例流动相系统,结果显示:以甲醇-水(98∶2,V /V )为流动相分离效果良好。实验中发现,需制备分离的样品溶解度低,样品浓度过大,放置1h 即有沉淀析出。为此,进样浓度确定为5g /L 。实验对不同的进样体积进行优选,结果显示:进样体积大于600μL 时,柱子超载,化合物Ⅳ出现　图1　化合物Ⅱ～Ⅳ制备液相色谱图

F ig .1　P repa ra tive reversed phase li quid ch ro -

m atogra m o f compound Ⅱ-Ⅳ肩峰,故最终选用了600μL ;分离色谱图见图1。3.2　纯度的检测

制备分离所得的化合物Ⅱ～Ⅳ,采用分析型RPLC ,在203n m 、210n m 两个检测波长下测定纯度,结果显示:3种化合物在两个波长下均为单一色谱峰,纯度均高于96%。同时采用TLC 法,选用氯仿与甲醇的不同体积比例的展开剂对化合物Ⅰ进行纯度分析,结果化合物Ⅰ为单一斑点,证明4种化合物纯度满足进行结构光谱测试的要求。3.3　化合物结构鉴定

化合物Ⅰ:白色粉末,m p 197.0～198.0℃,Lieber m ann -Burchar d 反应呈阳性,TLC 板展开后,喷以10%硫酸乙醇溶液,105℃加热显紫红色。HRMS 测定值[M +Na ]

+

m /z 449.3754(C 30H 50ON a ,计算值449.3759),ESI -M S 给出准分子离子峰m /z 449.4[M +Na ]+

,427.4[M +H ]+

,结合1

H NMR 、13

C NMR 确定其分子式为

C 30H 50O 。I R (KB r )c m -1:3394(OH ),2922,2852,1469,1383(C H 3)。1

H NMR 谱中(CDC l 3),δ0.81、0.85、0.89(×2)、0.95、0.98、1.02、1.15(各3H ,s ),分别为8个甲基质子信号,δ3.24(1H ,dd ,J =5.2,10.9H z ,H -3),δ5.20(1H ,br .s ,H -12)。13

C NM R 谱中(CDC l 3),共给出30个碳信号,其中δ145.2和δ121.7为一对双键碳信号,δ79.0为连氧次甲基碳信号,δ15.0～56.0有27个SP 3

杂化的碳信号,13

C NM R 数据及归属见表1,结构式见图2。1

H NMR 及13

C NM R 波谱化学位移值与文献报道一致[4]

,故

鉴定该化合物为β-香树脂醇(β-a my ri n )。

1378

分析化学第35卷