血红蛋白的分离和提纯

专题五 DNA和蛋白质技术

课题三血红蛋白的提取和分离

一、学习目标

1、会说出凝胶色谱法和电泳法分离生物大分子的原理。（学习重点、难点）

2、能写出血红蛋白提取和分离的步骤。（学习重点）

二、学法指导

通过图片模型理解凝胶色谱法分离蛋白质的原理；通过观看视频来理解血红蛋白提取和分离的过程

三、课前热身

一、基础知识

1．凝胶色谱法

(1)概念：凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据____________的大小分离蛋白质的有效方法。

(2)原理：大多数凝胶是一些微小的________球体，内部有许多贯穿的通道，当____________不同的蛋白质通过凝胶时，________________的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程________，移动速度较慢；而______________的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程________，移动速度较快。____________不同的蛋白质因此得以分离。

2．缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能抵制外界的________对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：通常由1～2种________溶解于水中配制而成。调节________的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

3．电泳

(1)概念：是指_______粒子在电场的作用下发生_______的过程。

(2)原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的________下，这些基团会带上____________。在电场的作用下，这些________分子会向着与其所带电荷________的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子________的差异以及________的大小、________不同，使带电分子产生不同的________，从而实现样品中各种分子的分离。

(3)常用的电泳方法：琼脂糖凝胶电泳和______________电泳。

二、实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：________、粗分离、纯化和纯度鉴定。1．样品处理和粗分离

(1)红细胞的洗涤：采集血样，____________离心，吸取血浆后加________洗涤，再低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色。目的是除去________，以利于后续步骤的分离纯化。

(2)血红蛋白的释放：将洗涤好的红细胞依次加入蒸馏水至______体积，再加40%体积的______，置于____________上搅拌10 min，使红细胞吸水涨破，血红蛋白释放出来。

(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2 000 r/min的速度离心10 min。离心后试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的________，第2层为白色薄层固体，是____________的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是________的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去____________层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

(4)透析：取1 mL的血红蛋白溶液装入________中，将________放入盛有300 mL 的物质的量浓度为__________mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h(以除去样品中________________的杂质)。

2．纯化——凝胶色谱操作

(1)凝胶色谱柱的制作：准备材料→加工________→安装色谱柱。

(2)凝胶色谱柱的装填。因为干的凝胶和________________的凝胶的体积差别很大，因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。本实验使用的是交联葡聚糖凝胶(Sephadex G—75)。“G”表示凝胶的________，膨胀程度及分离范围，75表示________值，凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成________悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙管打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻________色谱柱，使凝胶装填均匀。注意色谱柱内不能有________存在。

(3)样品的加入和________。

3．纯度鉴定

判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。在鉴定的方法中，使用最多的是__________________________电泳。

三、操作提示

1．红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；________离心。

2．凝胶的预处理：沸水浴法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的________和空气。

3．色谱柱的装填：装填尽量________，降低颗粒间隙；无________；洗脱液不能断流。

4．色谱柱成功的标志：红色区带________地移动。

四、课堂探究

（一）自主学习（独立完成，记录疑问）

聚焦目标一：凝胶色谱法和电泳法分离生物大分子的原理

问题一：凝胶色谱法使用的凝胶有哪些？凝胶有什么特点？

问题二：为什么相对分子质量较大的蛋白质会先从色谱柱中洗脱出来？

问题三：凝胶色谱法分离蛋白质时通过一次洗脱能否将所需蛋白质与其他杂质彻底分离？

问题四：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？

聚焦目标二：血红蛋白提取和分离的步骤

问题一：与其他真核细胞相比，哺乳动物成熟红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？

问题二：洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？洗涤红细胞的目的是什么？你如何知道红细胞已洗涤干净？

问题三：在血红蛋白释放过程中，蒸馏水和甲苯的作用分别是什么？

问题四：血红蛋白释放后的混合液经离心后分为哪几层？如何获得血红蛋白溶液？

问题五：将收集的血红蛋白溶液放在透析袋中进行透析，透析的目的是什么？

问题六：在制作凝胶色谱柱时，凝胶色谱柱的高度不足或直径过大对洗脱效果分别有何影响？

问题七：试从凝胶色谱的分离原理分析，凝胶的装填为什么要紧密、均匀？

（二）合作探究（组内讨论，突破疑难）

（三）展示讲解（班内讨论，教师补充）

五、课堂小结（构建思维导图，归纳总结）