蛋白质一级结构的测定方法

蛋白质一级结构的测定

1.测定蛋白质分子中多肽链的数目：N-末端和C-末端残基的摩尔数和蛋白质的相对分子质量

2.拆分蛋白质分子的多肽链

非共价相互作用缔合的寡聚蛋白：用变性剂尿素盐酸胍

共价二硫桥：氧化剂或还原剂

3.断开多肽链内的二硫桥

过甲酸氧化法常用试剂过甲酸

巯基化合物还原法：过量的巯基乙醇处理，ph8-9室温，系统中放尿素和盐酸胍，烷基化试剂保护常用试剂β巯基乙醇，巯基乙酸

4.分析每一多肽链的氨基酸组成：完全水解

酸水解：常用hcl,水解后除去

碱水解：用于测定色氨酸含量。很多氨基酸遭到破坏，色氨酸定量回收。

5.鉴定多肽链的N-末端和C-末端

N-末端分析：

①二硝基氟苯DNFB

②丹磺酰氯DNS：强烈荧光，灵敏度高

③苯异硫氰酸酯PITC:多肽或蛋白质的末端氨基和氨基酸的α氨基一样与PITC反应生成PTC-多肽，在酸性有机溶剂中加热，N-末端的PTC-氨基酸发生环化

④氨肽酶：肽链外切酶/外肽酶，从多肽链的N-末端逐个向里切。常用亮氨酸氨肽酶（水解以Leu为N-末端的肽链速度为最大）

C-末端分析：

①肼解法：蛋白质多肽与无水肼加热发生肼解。反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其他氨基酸都转变为相应的氨基酸酰肼化物。肼解中，Gln,Asn,Cys被破坏不易测出，C末端的Arg转变成鸟氨酸

②还原法：硼氢化锂还原成α-氨基醇

③羧肽酶法：肽链外切酶，专一地从肽链C末端逐个降解。羧肽酶A能释放除Pro,Arg和Lys之外的所有C-末端残基的肽键，B只能释放精氨酸和赖氨酸，AB的混合物能释放除Pro 外任一C末端残基的肽键。Y可以作用于任何一个C末端残基

6.裂解多肽链成较小的片段：用几种不同的断裂方法将每条多肽样品降解成几套

①酶裂解法：肽链内切酶。胰蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶

胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键

胰凝乳蛋白酶能断裂赖氨酸、酪氨酸、甘氨酸残基的羧基参与形成的肽键

②化学裂解法：测定相对分子质量大的蛋白质序列。溴化氰：断裂由Met残基的羧基参加形成的肽键羟胺断裂肽段的分离纯化

7.测定各肽段的氨基酸序列

Edman化学降解法：PITC与多肽链的游离氨基作用，测定任何非封闭的多肽蛋白质序列仪酶降解法：利用外肽酶（氨肽酶和羧肽酶）逐个向里切

质谱法，气质联用法

根据核苷酸序列的推定法

8.重建完整多肽链的一级结构

9.确定半胱氨酸残基之间形成的S-S交联桥的位置

采用胃蛋白酶水解原来的含二硫桥的蛋白质，所得的肽段混合物用对角线电泳进行分离，用茚三酮反应鉴定

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