0731 蛋白质含量测定法 - 国家药典委员会

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蛋白质含量测定法
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组成蛋白质的基本单位是氨基酸， 氨基酸通过脱水缩合形成肽链， 蛋白质是一条或多条 多肽链组成的生物大分子。 不同品种应针对自身蛋白质特性选择适宜的测定方法并做相应方 法学验证，同时应尽可能选用与待测定品种蛋白质结构相同或相近的蛋白质作对照品。2 第一法 凯氏定氮法3
本法系依据蛋白质为含氮的有机化合物， 当与硫酸和硫酸铜、 硫酸钾一同加热消化时使 蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后以 硫酸滴定液滴定，根据酸的消耗量算出含氮量，再将含氮量乘以换算系数，即为蛋白质的含 量。 本法灵敏度较低，适用于 0.2~2.0mg 氮的测定。氮转化成蛋白质的换算系数因蛋白质中 所含氨基酸的结构差异会稍有区别。 供试品溶液的制备 照各品种项下规定的方法制备，生物制品按如下方法操作。
精密量取供试品（如供试品为冻干制剂或固体粉末时，应复溶后量取）适量，用 0.9%氯 化钠溶液稀释并定量制成每 1ml 中含氮量约 1mg 的溶液，精密量取 1ml，作为总氮供试品 溶液进行测定。非蛋白氮供试品溶液的制备，除另有规定外，照附注项下钨酸沉淀法操作， 即得。 测定法 除另有规定外，按测定法(1)操作，生物制品按测定法(2)操作。
(1) 本测定法适用于不含无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。精密量取各 品种项下规定的供试品溶液适量，置凯氏定氮瓶中，照氮测定法(通则 0704 第二法)测定供 试品溶液的含氮量，除另有规定外，氮转换为蛋白质的换算系数为 6.25。
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中国药典 2010 年版一部无蛋白质测定的附录；二部附录Ⅶ M 中收载的蛋白质含量测定法，包括凯式定 氮法、福林酚法（Lowry 法） 、双缩脲法、2,2’-联喹啉-4,4’-二羧酸法（BCA 法） 、考马斯亮蓝法、紫外 －可见分光光度法共六种方法；三部附录Ⅵ B 中收载的蛋白质测定法，包括凯氏定氮法、Lowry 法和双缩 脲法三种方法。上海所通过对已有的蛋白质测定法的系统性、规范化研究，将中国药典 2010 年版二、三部 各附录的所有测定方法进行梳理规范，拟整合成统一的附录。 2 关于各法测定所用蛋白对照品，为正确规范使用对照品和标准品，拟统一改为“蛋白测定用对照品” 。但 是，由于二部品种与三部品种中蛋白测定用对照品的来源、适用范围等均不同，二部采用中检院对照：血 清白蛋白（牛） ；三部亦采用中检院对照：蛋白含量测定国家标准品；两者未统一。故拟订标准中暂未统称 为“蛋白测定用对照品” ，而是将其分别标示为“血清白蛋白（牛）对照品”和“蛋白含量测定国家标准品” ， 从而供不同品种分别采用，以免混淆。建议中检院统一对照品后再作修订。 3 本法中国药典 2010 年版二部、三部均有收载，且与欧洲药典 8.0 版、英国药典 2013 年版与美国药典 36 版附录中收载的方法基本一致。不同点在于：(1)二部附录对供试品溶液并未做具体规定，三部附录给出了 供试品溶液的制备方法；(2)二部附录给出非蛋白氮供试品溶液制备的两种常用方法用于非氮的测定，三部 附录采用钨酸沉淀法用于非氮的测定，采用三氯醋酸沉淀法直接测定供试品中蛋白氮的含量。二部、三部 所用这两种蛋白沉淀方法原理、操作、试液浓度均基本一致。经试验验证，整合为现有内容。

(2)本测定法适用于添加无机含氮物质及有机非蛋白质含氮物质的供试品。除另有规定 外，精密量取各品种项下规定的总氮及非蛋白氮供试品溶液适量，分别置凯氏定氮瓶中，照 氮测定法(附录 VⅡ D 第二法)测定，以总氮量减去非蛋白氮量即为供试品溶液的含氮量， 除另有规定外，氮转换为蛋白质的换算系数为 6.25。 【附注】 非蛋白氮供试品溶液制备常用方法 钨酸沉淀法 精密量取供试品（如供试品为冻干制剂或固体粉末时，应复溶后量取）适
量 （蛋白质含量不高于 0.2g)， 置 20ml 量瓶中， 加水 10ml， 加 10％钨酸钠溶液 2ml， 0.33mol/L 硫酸溶液 2ml，加水至刻度，摇匀，静置 30 分钟，滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得(可 依据蛋白质浓度适当调整 10％钨酸钠溶液及 0.33mol/L 硫酸溶液用量，使钨酸终浓度保持 1 ％)。 三氯醋酸沉淀法 精密量取供试品 （如供试品为冻干制剂或固体粉末时， 应复溶后量取）
适量(蛋白质含量约 6～12mg)，加等体积的 10％三氯醋酸溶液，混匀，静置 30 分钟，滤过， 弃去初滤液，取续滤液，即得(可依据蛋白质浓度适当调整 10％三氯醋酸溶液用量，使三氯 醋酸终浓度保持 5％)。 第二法 福林酚法(lowry 法)4 本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与 Cu2+螯合形成蛋白质－铜复合物， 此复合物使酚试剂的磷钼酸还原， 产生蓝色化合物， 同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中 酪氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸还原呈蓝色反应。 在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比， 以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。 本法灵敏度高，测定范围为 20～250μg。本法干扰物质较多，对双缩脲反应产生干扰 的离子，同样容易干扰福林－酚反应，且影响还要大。还原物质、酚类、枸橼酸、硫酸铵、 三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。 除另有规定外，按方法一操作；如有干扰物质时，除另有规定外，按方法二操作并需经 方法学验证。 方法一： 试剂 碱性铜试液取氢氧化钠 10g，碳酸钠 50g，加水 400ml 使溶解，作为甲液；取酒
石酸钾 0.5g，加水 50ml 使溶解，另取硫酸铜 0.25g，加水 30ml 使溶解，将两液混合作为乙 液。临用前，合并甲、乙液，并加水至 500ml。
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中国药典方法与国外药典方法较为不同，二部、三部方法较为接近。进一步比较二部、三部方法的试液 浓度和蛋白质浓度，实际比色试液条件基本一致，主要不同点在于蛋白质浓度、反应温度和时间。经试验 验证后，整合为现有内容。

对照品溶液的制备
除另有规定外，取血清白蛋白（牛）对照品或蛋白含量测定国家标
准品，加水溶解并制成每 1ml 中含 0.2mg 的溶液。 供试品溶液的制备 致） 。 测定法 精密量取对照品溶液 0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml（对照品溶 照各品种项下规定的方法制备 （蛋白质浓度应与对照品溶液基本一
液取用量可在本法测定范围内进行适当调整） ，分别置具塞试管中，各加水至 1.0ml，再分 别加入碱性铜试液 1.0ml，摇匀，室温放置 10 分钟，各加入福林酚试液[取福林试液中的贮 备液（2mol/L 酸浓度）1→16]4.0ml，立即混匀，室温放置 30 分钟，照紫外－可见分光光度 法(附录 IV A)，在 650nm 的波长处测定吸光度；同时以 0 号管作为空白。以对照品溶液浓 度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量，同法测定。从线性 回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。 方法二： 测定前将脱氧胆酸盐－三氯醋酸加入样品中通过将蛋白沉淀来去除干扰物质。 这种方法 也可用于将稀溶液中的蛋白浓集。 试剂 500ml。 试液 B 取 2.98%二水合酒石酸二钠溶液 100ml 与 1.25%硫酸铜溶液 100ml 混合，加水 试液 A 取 1%氢氧化钠溶液 200ml 与 5%碳酸钠溶液 200ml 混合，加水稀释至
稀释至 250ml，临用新制。 试液 C 取试液 A 与试液 B 按 50:1 的比例混合，临用新制。 取福林试液中的贮备液（2mol/L 酸浓度）1→2（所配得的福林酚试液应
福林酚试液
满足以下要求：取供试品溶液 1ml，加试液 C 5ml 和配好的福林酚试液 0.5ml，所得溶液的 pH 值应为 10.25±0.25。若溶液 pH 值超出范围，应适当调整福林酚试液的稀释倍数。 ） 去氧胆酸钠试液 对照品溶液的制备 取去氧胆酸钠适量，加水制成每 1ml 中含 1.5mg 的溶液。 除另有规定外，取血清白蛋白（牛）对照品适量，加水分别制成每
1ml 中含 0.00mg、0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg 的溶液（对照品溶液浓度可 在本法测定范围内进行适当调整） 。 供试品溶液的制备 致） 。 测定法 精密量取各对照品溶液 1.0ml， 分别置玻璃试管中， 加入去氧胆酸钠试液 0.1ml， 照各品种项下规定的方法制备 （蛋白质浓度应与对照品溶液基本一
涡旋混匀，室温放置 10 分钟，加入 72%三氯醋酸溶液 0.1ml，涡旋混匀，高速离心，轻轻