生物化学第三节 基因的生物学功能鉴定技术

第三节基因的生物学功能鉴定技术2015-07-16 71002 0人类基因组计划虽然解析了基因序列，但绝大多数基因的功能尚不清楚。

因此，利用各种技术手段研究基因的功能将是“后基因组时代”的主要内容之一。

基因功能的确定必须通过实验来验证。

通常采用基因功能获得和（或）基因功能缺失的策略，观察基因在细胞或生物个体中所导致的细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，从而从正反两方面对基因的功能进行鉴定。

此外，基于正向遗传学的随机突变筛选技术也成为揭示基因功能的重要手段。

由于基因的功能必须在完整的生物个体及其生命过程中才能得到完整的体现，因此，从整体水平研究基因的功能是必然的选择。

一、用功能获得策略鉴定基因功能基因功能获得策略的本质是将目的基因直接导人某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因功能。

常用的方法有转基因技术和基因敲入技术。

（一）用转基因技术获得基因功能转基因技术（transgenic technology）是指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞(embryonic stem cell)，即ES细胞，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体DNA，随后将受精卵或ES细胞植入假孕受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。

转基因动物（transgenic animal）是指应用转基因技术培育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物，其制备步骤主要包括转基因表达载体的构建、外源基因的导入和鉴定、转基因动物的获得和鉴定、转基因动物品系的繁育等。

在转基因动物中，以转基因小鼠最为常见。

建立转基因小鼠的常用方法有两种，一是直接将目的DNA显微注射到受精卵的雄性原核，然后植入假孕母鼠体内，使之发育成幼仔；二是将带有目的基因的ES细胞注射到囊胚，然后在小鼠体内发育成幼仔。

在出生的动物中即含有在一个等位基因的位点进行了DNA整合的小鼠，即转基因杂合子。

经子代杂合子交配，在其后代中可筛选到纯合子（图22-7）。

利用转基因动物模型研究外源基因，能够接近真实地再现基因表达所导致的结果及其在整体水平的调控规律，把复杂的系统简单化，具有系统性和独立性。

利用转基因技术建立的疾病动物模型具有遗传背景清楚、遗传物质改变简单、更自然更接近疾病的真实症状等优点。

然而，转基因动物模型仍存在一些亟待解决的问题，如外源基因插入宿主基因组是随机的，可能产生插入突变，破坏宿主基因组功能；外源基因在宿主染色体上整合的拷贝数不等；整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传等。

为解决上述问题，可以在转基因动物利用组织特异性启动子实现外源基因的时空特异性表达，或用化学或生物分子作为诱导剂，实现对外源基因表达时间及水平的精确控制。

（二）用基因敲入技术获得基因的功能基因敲入( gene knock-in)是通过同源重组的方法，用某一基因替换另一基因，或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。

通过基因敲入可以研究特定基因在体内的功能；也可以与之前的基因的功能进行比较；或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。

基因敲入是基因打靶( gene targeting)技术的一种。

基因打靶是一种按预期方式准确改造生物遗传信息的实验手段。

该技术的巧妙之处在于将ES细胞技术和DNA同源重组技术结合起来，实现对染色体上某一基因的定向修饰和改造，从而深入地了解基因的功能。

基因打靶的原理如图22-7：①从小鼠囊胚（受精卵分裂至8个细胞左右即为囊胚，此时受精卵只分裂不分化）分离出未分化的ES细胞；②然后利用细胞内的染色体DNA与导人细胞的外源DNA在相同序列的区域内发生同源重组的原理，用含有筛选标记的打靶载体，对ES细胞中的特定基因实施“打靶”；③将“中靶”的ES细胞移植回小鼠囊胚，进而与囊胚一起分化发育成相应的组织和器官，最后产生出具有基因功能改变的“嵌合鼠”。

由于“中靶”的ES细胞保持分化的全能性，因此它可以发育成为嵌合鼠的生殖细胞，使得经过定向改造的遗传信息可以代代相传。

图22-7 制备转基因和基因打靶小鼠的原理除基因敲入外，基因打靶还包括基因敲除、点突变、缺失突变、染色体大片段删除等。

基因打靶与转基因技术均可用于基因功能研究，但二者的最大区别就是基因打靶能去除和（或）替换生物体内的固有基因，而转基因技术则未去除或替换固有基因。

目前，基因打靶已成为研究基因功能最直接和最有效的方法之一。

二、用功能失活策略鉴定基因功能基因功能失活策略的本质是将细胞或个体的某一基因功能部分或全部失活后，通过观察细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化来鉴定基因的功能。

常用的方法主要有基因敲除和基因沉默技术。

（一）用基因敲除技术使基因功能完全缺失基因敲除( gene knock-out)属于基因打靶技术的一种（图22-7），其利用同源重组的原理，在ES细胞中定点破坏内源基因，然后利用ES细胞发育的全能性，获得带有预定基因缺陷的杂合子，通过遗传育种最终获得目的基因缺陷的纯合个体。

然而，基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制，例如，有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。

为了克服以上不足，条件性基因敲除( conditional gene knock-out)技术应运而生，该技术可以更加明确地在时间和空间上操作基因靶位，敲除效果更加精确可靠，理论上可达到对任何基因在不同发育阶段和不同器官、组织的选择性敲除。

以Cre/loxP系统为代表的条件敲除的原理如图22-8：Cre重组酶属于位点特异性重组酶，能介导两个34bp的loxP位点之间的特异性重组，使loxP位点间的序列被删除。

重组酶介导的条件性基因敲除通常需要两种小鼠，一种是在特定阶段、特定组织或细胞中，表达Cre重组酶的转基因小鼠；另一种是在基因组中引入了loxP位点的小鼠，即靶基因或其重要功能域片段被两个loxP位点锚定的小鼠。

两种小鼠交配后，Cre基因表达产生的Cre重组酶就会介导靶基因两侧的loxP间发生切除反应，结果将一个loxP和靶基因切除。

由于可以控制Cre重组酶在特定阶段、特定组织或细胞中表达，使得Cre介导的重组可以发生在特定的阶段、组织或细胞中，导致这些组织或细胞中的靶基因在特定的阶段被敲除，而其他组织或细胞中因不表达Cre而使得靶基因不被敲除。

图22-8 Cre/loxP系统条件敲除靶基因的原理条件性基因敲除的优势在于克服了重要基因被敲除所导致的早期致死，并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及疾病发生、治疗过程中的作用和机制。

但这一技术亦存在一些缺点，如费用太高、周期较长，而且许多基因在敲除后并未产生明显的表型改变（可能是这些基因的功能被其他基因代偿所致）。

（二）用基因沉默技术可使基因功能部分缺失基因沉默策略通常是利用反义技术，在转录或翻译水平特异性阻断（或封闭）某些基因的表达（即沉默相应基因），然后通过观察细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化来鉴定基因的功能。

以下简要介绍几种常用的基因沉默技术。

1．用RNA干扰技术研究基因功能利用RNAi能在短时间内高效特异地抑制靶基因表达的特点，可以很方便地研究基因的功能。

RNAi的基本原理见第十八章。

用于基因沉默的siRNA 既可以在体外进行化学合成或体外转录生成，也可以基于具有合适启动子的载体或转录元件，在哺乳类动物或细胞中转录生成。

研究者既可以将siRNA导人特定细胞，在细胞水平上研究基因的功能；也可以通过转基因的方法，在动物体内实现特异、稳定、长期地抑制靶基因的表达，从而在整体水平上研究基因的功能。

与基因敲除相比，RNAi技术具有简单、易操作、周期短等优势，因此已被作为一种简便和有效的工具而广泛用于基因功能的研究。

然而，该技术可能对靶基因的相似序列发生作用，导致脱靶(off-targeting)效应。

2．用miRNA技术研究基因功能尽管miRNA的作用机制与siRNA类似，但因其可通过与mRNA不完全互补配对结合而抑制翻译，故1种miRNA可沉默多个靶基因（平均一种miRNA可有100靶基因以上），而siRNA通常沉默单一基因。

目前，miRNA在基因功能及基因表达调控研究中都得到了广泛应用。

3．用反义RNA技术研究基因功能即通过反义RNA(与mRNA互补的一段RNA序列)与细胞中的mRNA特异性结合，从而抑制相应mRNA的翻译。

4．核酶( ribozyme)技术天然的核酶通常是单- RNA分子，具有自剪切作用。

另外，核酶也可由两个RNA分子组成，二者通过互补序列相结合，形成锤头状二级结构，并组成核酶的核心序列，进而发挥剪切作用。

核酶通过剪切靶RNA分子（即破坏靶RNA分子）而抑制基因的表达。

三、用随机突变筛选策略鉴定基因功能尽管利用转基因、基因敲人／敲除、基因沉默等技术从特定基因的改造到整体动物表型分析的“反向遗传学”研究大大推动了功能基因组学的进展，但是也存在明显的局限性：首先，由于生物体的代偿机制，使得基因敲除动物常常观察不到异常表型；其次，由于“反向遗传学”只能对已知基因进行研究，而人类基因组中尚有90%以上的非编码序列处于未知状态；第三，由予“功能缺失”和“功能获得”小鼠常出现胚胎期死亡，而目前可用于条件性基因改造的启动子还很少，从而阻碍了特定基因在成体动物中的功能分析；第四，由于一个蛋白质有多个不同的功能域，特定基因在不同位点上的突变可能产生不同的表型，应用单一的“功能缺失”方法，显然不可能发现这些不同的异常表型。

因此，只应用“反向遗传学”不足以完成功能基因组学的任务，而基于“正向遗传学”的、从异常表型到特定基因突变的随机突变筛选策略逐渐受到青睐。

随机突变筛选策略的第一步是通过物理诱变、化学诱变或生物技术产生大量的基因组DNA 突变。

其中乙基亚硝基脲(ENU)诱变是近年来发展起来的研究基因功能的新手段。

ENU是一种化学诱变剂，它通过对基因组DNA碱基的烷基化修饰，诱导DNA在复制时发生错配而产生突变。

它主要诱发单碱基突变，造成单个基因发生突变（双突变的情况非常少），更接近于人类遗传性疾病的基因突变情况。

同时，ENU的突变效率非常高，可以达到0.2%，是其他突变手段的10倍左右。

例如，经ENU处理可使雄鼠精子基因组发生点突变，进而使得后代小鼠有可能出现突变表型，经筛选及遗传试验即可得到突变系小鼠。

通过对突变小鼠的深入研究、对突变基因定位以及位置候选法克隆突变序列，就会得到突变基因的功能信息。

另外，基因捕获( gene trapping)技术也是一种产生大规模随机插入突变的便利手段，对于揭示基因序列所对应的基因功能具有重要的应用价值。