转基因小鼠肿瘤模型的研究进展_百替生物
小鼠移植瘤模型动态观察
小鼠移植瘤模型动态观察摘要：利用小鼠移植瘤模型动态观察血管生成拟态的时空变化。
方法：采用B16黑色素瘤细胞和C57小鼠制作小鼠恶性黑色素移植瘤动物模型，成瘤后根据随机数字表每天随机抽取一只小鼠处死，共12d，获得肿瘤样本114例。
常规HE染色和CD31、PAS染色。
显微镜下分别计数肿瘤组织中央区和外周区的高倍视野（400）下血管生成拟态以及内皮依赖性血管。
结果：在移植瘤形成的第1～8天，肿瘤组织内存在血管生成拟态。
第9～12天该结构被内皮依赖性血管替代。
肿瘤中央区、外周区血管生成拟态密度均呈现先递增后递减趋势；两个区域内的血管生成拟态密度比较：在第1～6天内肿瘤中央区高于外周区，在第7～8天肿瘤外周区高于中央区。
内皮依赖性血管在肿瘤组织的中央区和外周区呈现递减趋势。
两个区域内的内皮依赖性血管密度比较：在第1～7天肿瘤中央区内皮依赖性血管密度高于外周区，在第8～12d两个区域内的内皮依赖性血管密度无明显差别。
血管生成拟态密度与肿瘤组织的坏死率之间呈密切负相关（r=-0.978,P<0.05）；内皮依赖性血管密度与肿瘤组织坏死率之间亦存在负相关（r=-0.230,P<0.05）。
结论：黑色素瘤移植瘤中血管生成拟态是肿瘤细胞为适应环境而产生的一种暂时性的血液供应方式，与内皮依赖性血管并存于肿瘤组织内。
随肿瘤生长变化而与内皮依赖性血管之间存在一定的时空变化规律。
【关键词】血管生成拟态；肿瘤血管生成；恶性黑色素瘤血管生成拟态是一种与传统的肿瘤血管生成途径完全不同的、不依赖内皮细胞的全新的肿瘤细胞的血液供应方式。
1999年由美国lowas大学的Maniotis和Folberg等提出，他们对眼葡萄膜恶性黑色素瘤微循环研究时发现恶性黑色素瘤细胞通过自身变形和与细胞外基质相互作用，模拟血管壁结构形成可输送血液的管道，从而重塑肿瘤的微循环，并且与宿主血管相连通，使肿瘤获得血液供应，命名为血管生成拟态[1～6]。
小鼠肿瘤模型研究发展历史
小鼠肿瘤模型研究发展历史最早的肿瘤模型是通过将鼠肿瘤移植到具有免疫活性宿主小鼠中而建立的（图1A）。
这些同种异体移植模型在20世纪60年代至70年代期间用作药物筛选的主力，并且成功地鉴定了许多有效的细胞毒性药物，例如长春新碱和丙卡巴肼。
由于这种模型具有完全免疫活性，因此它们在免疫肿瘤学试剂的评估中也特别有用。
因为它们可用于研究从初始阶段的抗肿瘤免疫应答的产生，并且不需要过继转移免疫群体。
此模型可用于前期筛选鼠源/人鼠同源免疫检查点抑制剂的抗肿瘤作用及机制研究。
然而，这种小鼠模型缺乏人类的肿瘤组织和人类的免疫系统，无法模拟人类肿瘤微环境的异质性和复杂性。
肿瘤研究中应用的基因工程小鼠模型（genetically engineered mouse model，GEMM）通过转基因方法修饰小鼠的癌基因或抑癌基因来诱导肿瘤发生（图1B）。
其自发形成原位肿瘤，模拟了肿瘤形成的过程。
并且其肿瘤微环境含有天然免疫抑制基质和脉管系统。
然而此模型建立耗时长，肿瘤发生非同步化，存在非预期表型产生，缺乏人类免疫系统，并且与同源模型一样，需要考虑鼠免疫靶标是否与相应的人靶标交叉反应。
图1. 免疫肿瘤学的临床前小鼠模型为了创建更真实的人类疾病模型，重现人体免疫系统功能的临床前模型,研究人员开始研究开发人源化小鼠肿瘤模型。
人源化小鼠模型历史上的第一个重要事件是产生免疫缺陷小鼠品系，其能够使人细胞植入（图1C和图2）。
人类细胞或肿瘤组织移植到无胸腺裸鼠体内的过程始于20世纪60年代，但是间隔20年后CB17-Prkdcscid小鼠才被广泛应用。
这些小鼠是严重联合免疫缺陷（scid）突变的纯合子，可以成功移植人PBMC ，胎儿组织和人造血干细胞。
然而，基于CB17-Prkdcscid的人源化小鼠存在着很多缺点，如CB17-Prkdcscid 小鼠存在渗漏现象，随着年龄生长，会部分恢复自体的T和B细胞功能且NK细胞和其他免疫细胞活性处于高水平，这使得其对人类细胞的排斥；移植时为了清除小鼠内源造血干细胞，需要对其进行半致死剂量的放射性辐照，而scid突变产生DNA损伤修复缺陷，导致其抗辐照能力差。
胰腺癌转基因小鼠模型研究进展
胰腺癌转基因小鼠模型研究进展蒋书恒;张志刚;马铭泽;覃文新【摘要】胰腺癌是人类恶性肿瘤中最为致命的一种,癌基因KRAS的突变,抑癌基因(如CDKN2A、SMAD4)的失活或缺失以及大量信号途径的变化是胰腺癌的重要特征.因此,为弄清胰腺癌的这些生物学行为以及制订合理的治疗方案,建立模拟胰腺癌发生、发展过程的实验动物模型显得尤为重要.目前,基于KRAS突变的转基因小鼠模型较好地模拟了胰腺癌的癌前病变过程,结合其他抑癌基因的缺失或突变,进一步展示了胰腺癌的进展过程,如侵袭和转移等.该文就胰腺癌转基因小鼠模型予以综述.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2014(020)022【总页数】4页(P4071-4074)【关键词】胰腺癌;转基因;小鼠模型;KRAS突变【作者】蒋书恒;张志刚;马铭泽;覃文新【作者单位】复旦大学上海医学院,上海200240;上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因重点实验室,上海200240;上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因重点实验室,上海200240;上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因重点实验室,上海200240;复旦大学上海医学院,上海200240;上海市肿瘤研究所癌基因与相关基因重点实验室,上海200240【正文语种】中文【中图分类】R735.9胰腺癌主要病理类型为导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)，约占95%，是一种恶性程度极高的肿瘤，5年总体生存率低于4%[1]。
大多数患者在确诊时疾病已进入晚期阶段，失去手术机会，加上胰腺癌特殊的组织病理特征，如大量结缔组织增生、血管丰度低，治疗药物很难进入肿瘤组织发挥药效，导致患者预后极差[2]。
胰腺PDAC存在三种癌前病变类型，分别是起源于小叶内导管的胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)、出现在主胰管或其主要分支的导管内乳头状黏液瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm，IPMN)以及产生黏蛋白的黏液性囊性瘤(mucinous cystic neoplasm，MCN)[3-4]。
转基因小鼠肺癌模型的研究和应用
抑癌基 因的等住基 因突变技 术制造 了条件控 制基 因表达 的
第 ２代 基 因鼠 ， 鼠肺 肿 瘤 的 生 长 更 接 近 散 发 肿 瘤 生 长 流 使 程 。 人 们 又发 现 』散 发 肿 瘤 一般 缺 少进 展 期 肿 瘤 的 特 征 ， ， 可 能 是 因为 肿 瘤 向 明 显 恶性 进 展 需要 多 重 遗 传 改 变 的 累 积
后的原 因之一 。 如何 建立一种 高效 、 准确、 能够最 大限度地复 制人体 内环境 ， 并与人 类肺癌发 生发展及转移过程 最相近 的 肺癌模 型是 需要迫切解决的 问题。 多年来 ， 国内外学者通过 选 用不 同动物 、 采取 不 同方法建立 了 多种动 物模 型， 随着转 基 因技 术的发展 ， 转基 因小鼠肺癌模 型越 来越 受国际 学者 的 青 睐， 为肺癌的病 因学、 早期诊断、 临床 治疗和预 防提 供 了更
瘤率高 ， 易监视肿瘤生 长情 况 ， 目前 临床 前 药物 实验最 常 是 用的模 型 ， 例如 。 Ｘ Ｖ ２肿瘤是实验室常用的肿 瘤之 一， 常被种
的优 缺 点 ， 转 基 因小 鼠 肺 癌 模 型 的研 究及 应 用作 一 综述 。 对
或基 因突 变的联合 ， 于是 尝试将 条件控 制表 达的 Ｋ—ｒｓ ａ 基
因导 入 Ｔｐ３或 ｐ ６ ／ １ Ａ 缺 失 的 鼠 ， 功 制 造 了 晚 期 ｒ５ １ Ⅲ ｐ９￣ 成
１ 动物 自发或 由致癌物诱发的肺癌模型
线诱发肺 癌的概 率升高。由此可见 ， 因改变的动物对化 学 基
致 癌 物 及 物 理 辐射 的敏 感性 增 强 。
物 的敏感性 与人 类 肿瘤 不 同。 以 尚不能很 好 地代 表人 类 所
肺癌 。
在人 肺癌 中原癌基 因 Ｋ— ａ 激 活和抑癌 基 因 ｐ ３失 活 ｒｓ ５
转基因小鼠研究进展
转基因小鼠的研究进展1 转基因小鼠技术发展以往的转基因技术是将外源基因导入原核细胞或真核细胞来研究基因的表达调控与基因的功能。
但基因在离体单个细胞中的功能并不一定能代表基因在整体中的功能。
因为在一个复杂的动物个体中，众多的基因彼此之间在功能上并不是孤立的，而是相互关联、相互影响的。
而且，一个基因在单一细胞中的表达究竟会对整个机体的生理功能产生什么作用也必须在整体水平来研究。
从60年代开始，生命科学研究人员就试图找到一种恰当的方法，将特定的基因导入发育中的哺乳动物体内，以便研究基因的功能及调控规律。
到70年代中期，几种将外源基因导入早期哺乳动物胚胎的方法逐步建立起来，从而为建立转基因小鼠奠定了基础。
1982年，美国学者Palmiter将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵，所生7只子代小鼠中有6只生长加快，体重明显增加，这就是所谓的“超级小鼠”(supermouse)诞生了。
“超级小鼠”的建立成功轰动了整个生命科学界，科学家们对此表现出浓厚的兴趣，许多实验室竞相开展这方面的研究工作，因此转基因小鼠技术迅速发展，不断完善。
转基因小鼠技术兴起于60年代，至80年代中期逐渐成熟。
其中关键的技术是实现外源基因的导入及整合，这一技术的发展到目前已经历了四个阶段。
1.1第一阶段：实现外源基因的导入1974年，Jaenisch等用显微注射法将SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。
这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。
以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵中的转移，并能遗传给后代。
在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。
这一阶段转基因技术的共同特点是导入的外源基因是随机整合的。
这种随机整合的外源基因可能是单拷贝的，也可能是多拷贝的。
外源基因整合的结果可能会有几种情况出现：①能够有效地表达，且不影响动物的发育以及正常的生理功能。
转基因小鼠胃癌模型的研究进展
ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ， Ｉ Ｔ Ｆ ／ Ｔ Ｆ Ｆ ３ ） 。Ｔ Ｆ Ｆ １主要 表 达 于 胃小 凹表 面 黏 液细 胞或 胃小 凹 胃壁 细胞 中 ， 人 和 小 鼠的 Ｔ Ｆ Ｆ １蛋 白
（ 原名 ｐ Ｓ ２ ） 都 属 于 三 叶草 形 多 肽 家族 ， Ｔ Ｆ Ｆ １异 常 表
胃癌小 鼠模 型 的开发 提供 了基 础技 术支 持 ， 使 得各 种 转 基 因小 鼠模 型 不 断 涌现 。本 研 究 对 目前 常见 的几
种 转基 因小 鼠模 型做 一综 述 。
一
。
Ｔ Ｆ Ｆ包 括乳腺 癌相 关 肽 （ ｔ ｈ ｅ ｂ ｒ ｅ ａ ｓ ｔ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ —ａ ｓ ｓ ｏ —
变 。然 而 ， 该 系小 鼠 胃癌 模 型 产生 的肿 瘤 多 为鳞 状细 胞 胃 癌 ， 不 同于 人 常 见 的 胃腺 癌 。近 年 来 ， 基 因 工程 技 术 的 快 速 发 展 促 进 了 转 基 因 小 鼠 胃癌 模 型 的 出现 。转 基 因小 鼠 胃癌 模 型 是 直 接 将 调 控 胃 癌 发 生 的 相 关 基 因转 染 到 小 鼠胚 胎 中 而 形 成 肿 瘤 的 一 种 新 技术 ， 其 形 成肿 瘤 的形 态 特 征 与 人 肿瘤 的 自然 发 生极 为 相 似 ， 且发生于特定组织 ， 特 异 性 较 高 。因 此 ， 转 基 因动 物 在 胃癌 形 成 、 发 展机制 ， 尤 其 是信 号通 路研 究 中 具 有 独 特 的 优 势 ， 对研究基 因突变而引起 的遗传疾 病发 病机制 十分有效 ， 是一 种极为理 想 的 胃
达 于 胃肠疾 病 和多种 肿瘤 中。为 了进 一 步 了解 Ｔ Ｆ Ｆ １ 的功 能 ， Ｌ ｅ ｆ ｅ ｂ ｖ ｒ ｅ等 ” 通 过 同源重 组构 建 Ｔ Ｆ Ｆ １ 一 小
免疫肿瘤研究之基因工程鼠模型（GEMM）
免疫肿瘤研究之基因⼯程⿏模型（GEMM）因为肿瘤免疫研究的需求不断成长，免疫活性模型的使⽤率也不断升⾼。
这些模型包含了同源模型以及基因⼯程⿏模型显性癌基因或是肿瘤抑制基因造成的肿瘤⽣长GEMM最早是在80年代开发出的技术，也担任了免疫疗法评估中重要的⾓⾊。
第⼀个基因移转⼩⿏的研发是在发现克隆基因可以整合到⽼⿏基因组并成功繁衍后发现的。
最初显性癌基因是通过GEMM来表达，但却形成了⾃发性肿瘤。
第⼀个基因移转⼩⿏被命名为肿瘤⿏，能够表现出乳腺特异性启动⼦控制的特定V-HRas癌基因。
90年代初期，基因敲除的技术已经成熟，成功制作出GEMM，但因为缺乏肿瘤抑制基因⽽造成肿瘤⽣长。
这些年来，GEMM提供了许多癌症研究与转译肿瘤的知识，这篇⽂章将探讨GEMM最主要的优点和缺点，以及免疫肿瘤模型的使⽤⽅法。
⾃发性肿瘤模拟出⼈类⾸要的肿瘤⽣长GEMM免疫治疗评估中最常⽤的功能是这类⽼⿏有完整的免疫活性与健全的⽼⿏基质。
另⼀个有⽤的功能是肿瘤⽣长的⽅式，是⾃发性⽽⾮植⼊⽼⿏体内的。
这代表着肿瘤⽣长的⽅式是将会与⼈类的肿瘤⽣长⽅式相似，同时也拥有类似免疫抑制与躲避免疫系统监控的特性。
因此GEMM可以⽤来测试癌症发展的完整性以及评估刺激哪个部份的免疫系统可以得到最好的结果。
⼤量的模型汇集涵盖许多的适应症因为多年的研究成果，使GEMM成为⼀种能够涵盖许多适应症的模型，相⽐较之下，较新的⼈源⼩⿏模型就没有办法。
现在⼤量的GEMM模型能够涵盖的适应症包含了：肺部、前列腺、乳房、结肠、胰脏。
⽽同源模型虽说也有⼤量的汇集，但却只能显现出⼀定数量的细胞系。
适合⽣物机制研究GEMM的主要使⽤⽅⾯在于观察肿瘤⽣长以及使⽤的局限性。
肿瘤的⾃发性使得模型成为理想的⽣物机制研究对象，但对于药效评估来讲⽤处不⼤。
每⼀只⽼⿏的肿瘤成长速度都不同，没办法达到100%的外显率，肿瘤成长的潜伏期也有可能特别长。
药效研究既复杂⼜昂贵GEMM的药效测试⾮常复杂，每只⽼⿏能够使⽤的时间都不⼀样，因此在预测治疗时效⽅⾯会变得困难。
【权威解读】Nature：尿蛋白标记——潜在早期肺癌鉴定物
【权威解读】Nature：尿蛋白标记——潜在早期肺癌鉴定物肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。
在过去的五年当中，肺癌患者的存活率低于15%。
近50年来，肺癌的发病率和死亡率均明显增高。
男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位；女性发病率和死亡率则均占第二位。
到2008年，全世界范围内有180万人死于肺癌。
肺癌的治疗手段包括外科手术治疗、放射治疗、化学治疗、免疫治疗、中医中药治疗等。
尽管治疗手段多种多样，但是肺癌的治愈率仍很低。
大规模的临床试验证明低剂量的电脑断层扫描使高危个体的死亡率显著降低。
然而，临床检测肺癌的生物标志物对于高危人群是迫切需要的。
在这里，作者报道了一种尿蛋白能够作为检测肺癌的一种标志物。
使用症状明显的肺癌Kras（G12D）小鼠模型，通过同胞比较鉴定了出现癌症症状小鼠的尿蛋白水平。
患者的尿液与正常对照的蛋白组学水平同样被检测。
重要的是，检测的七种蛋白在小鼠模型和患者体内均明显的升高。
在一个独立的实验中，作者发现这七个蛋白中的两个蛋白在肺癌样本中的表达上调，而对照组没有出现这种趋势。
这些蛋白的动力学特性与疾病小鼠模型相符合。
因此，这些尿素蛋白可能作为检测早期肺癌的标志物。
多年的流行病学研究及实验和临床观察表明，各种环境的和遗传的致癌因素可能以协同的方式引起细胞非致死性的DNA损害，从而激活原癌基因或（和）灭活肿瘤的抑制基因，加上凋亡调节基因和（或）DNA修复基因的改变，使细胞发生转化。
经过一个漫长的多阶段演进过程，其中某个克隆相对无限制扩增，通过附加突变，选择性形成不同特点的亚克隆，从而获得浸润和转移能力，形成恶性肿瘤。
因此，综合来说癌症是一种基因疾病，通过激活以及逐渐积累来改变癌基因的表达，以及对抑癌基因的抑制作用。
这种变化导致基因与蛋白相比于对照组有不同的变化。
其中一些基因可以通过测量其在体液中的变化来判断癌症在体内的状态。
对于其他形式癌症的研究表明，利用体液检测癌症状态的方法可以显著提高患者的存活率。
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转基因小鼠肿瘤模型的研究进展沈富毅，潘隽玮，郁嘉伦，余昂，侯晓骏[摘要]动物模型在肿瘤病因的揭示，发病机理的探索以及治疗措施的评估中有着不可替代的重要作用。
继常规转基因方法之后，可诱导表达转基因、基因打靶、条件性基因打靶以及基因捕获等技术的出现及其在肿瘤模型建立中的应用为我们提供了大量能较好模拟人体相应肿瘤的动物模型，极大地深化了我们对肿瘤生物学行为的认识，并有助于人们找到攻克肿瘤的办法。
[关键词]肿瘤，小鼠模型，转基因肿瘤是一类严重危害人类健康及生命的重大疾病，动物模型在肿瘤病因、发病机理的揭示以及治疗措施的评价中发挥着不可替代的作用。
肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变系或经致癌剂诱变而得，对它们的研究使我们对环境致癌物及其代谢活动机理有了一定的认识；但自发突变频率在自然状态下通常很低，而诱发模型也因其不可精确控制性而限制了它们的应用。
在过去的二十多年里，随着人们对癌基因激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中作用的认识日益深入，以及近年发展起来的小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，小鼠肿瘤模型的建立工作取得了突破性进展，本文就此作一简要综述。
1.常规转基因（transgenic）上世纪80年代初发展起来的原核显微注射技术，使我们可以将外源DNA直接导入小鼠生殖系以构建转基因动物模型。
目的基因在合适启动子驱动下表达，可赋予转基因动物新的表型，通过其表型分析可识别研究基因的功能。
转基因动物技术在肿瘤研究中的主要作用就是建立转基因的肿瘤动物模型，该研究始于1974年，Jaenisch等1用显微注射法将多瘤病毒SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。
这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。
以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵的转移，并能遗传给后代。
在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。
1985年，Adams2等用转基因方法首次构建了B淋巴瘤myc癌基因易位的小鼠模型，此后10年，陆续发展了针对各种类型恶性肿瘤的转基因小鼠研究。
如今这项技术运用较为成熟的是，利用免疫球蛋白启动子调控的c-myc基因在转基因小鼠中的表达，导致早期淋巴瘤的发生3。
在LTR/c-myc转基因小鼠模型中，利用哺乳类动物肿瘤病毒长末端重复序列（LTR）驱动c-myc广谱的表达，可造成多种组织形成肿瘤，如睾丸、乳腺和淋巴系。
1984年Stewart把小鼠乳腺癌病毒（MMTV）的增强子与myc基因或ras基因连接,形成的MMTV-myc转基因小鼠和MMTV/V-Ha-Ras转基因小鼠都有高的乳腺癌发生率4。
近年来，这项技术更多的运用于肿瘤发生机制的探索上。
Li等5构建了乳腺癌WAP-Tag转基因小鼠模型，该模型由小鼠乳清酸蛋白WAP启动子和SV40大T抗原构建而成，可用于乳腺癌变过程中细胞的增殖与凋亡、DNA突变及修复机制等方面的研究。
在慢性粒细胞性白血病(CML)的研究中，Heisterkamp等6构建的bcr-abl和crkl双转基因小鼠发病潜伏期及存活期均大大缩短，直接证明了crkl参与了bcr-abl所致的白血病。
尽管相关的研究已经很多，然而常规转基因本身固有的缺陷如基因拷贝数的不可控性（因为是在小鼠胚胎时期植入转基因，所以无法知晓其复制的数目）以及转入的基因整合在宿主基因组的位点随机性增加了其表型分析的难度，因此现在已较少单独采用常规转基因技术来制作肿瘤动物模型。
2．可诱导表达的转基因（inducible transgene expression）常规转基因技术通过特定启动子的选择实现了转基因的组织特异性表达，在此基础上，人们又开发了许多可诱导表达模型用以调控基因表达的时相。
目前，最常用的是反式因子rtTA与四环素衍生物强力霉素结合后激活四环素操纵子表达的方法（tet-on），而tTA与强力霉素结合则起抑制四环素操纵子表达的作用7（tet-off）。
这样，tet-on转基因小鼠可以通过摄入四环素的方法激活癌基因的表达；tet-off转基因小鼠则持续表达癌基因，直至因强力霉素的摄入而被特异性抑制。
应用此系统已构建了可诱导性Hras-G12V小鼠黑色素瘤8,c-myc可诱导表达T细胞淋巴瘤9等肿瘤模型。
Fisher等10利用四环素诱导系统建立了在肺细胞定向表达、带有K-Ras4b(G12D)癌基因的小鼠模型。
在此种转基因小鼠饮食中加入强力霉素，诱导癌基因K-Ras 表达，7天后肺细胞增生，2个月后小鼠肺组织中相继形成腺瘤、腺癌，并向胸膜扩散。
撤去强力霉素后，K-Ras mRNA水平急剧下降,增生细胞和肿瘤细胞凋亡，3天后肿瘤肿块迅速缩小，1个月后检测不到肿瘤组织。
四环素诱导系统的优点在于可以对转基因的表达进行精确的调控，转基因的表达呈四环素药物剂量依赖性反应并可具有组织特异性，而只须停止给药就可恢复到对照条件。
3．基因打靶或基因删除(gene targeting)从80年代到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已发展到成熟阶段。
1981年Evans11等从小鼠胚胎中成功分离得到胚胎干细胞(Embryonic Stem cell，ES)，即从着床前胚胎(孕3～5天)分离出内细胞团(Inner cell mass，ICM)细胞并摸索出维持其全能性的体外培养条件，在此基础上建立了胚胎干细胞技术。
1984年，Bradly等12成功应用显微注射法将ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获得了源于ES细胞系的纯系小鼠。
随后不久，同源重组现象被发现并很快用于内源性基因的精确修饰。
1987年，Utah大学Kirk13领导的研究小组根据同源重组的原理，实现了导入外源基因的定点整合，这一技术称为“基因打靶”。
基因打靶是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因目的的一种技术14。
1988年，Mansour等15通过建立一套正负双选择标记系统（PNS）来筛选基因组内同源重组正确发生的ES细胞克隆。
该载体上含有正负选择基因各一，正选择基因为neo基因（neomysine），位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达；负选择基因为HSV-TK基因（herpers simplex virus-TK），在靶基因同源区之外，位于载体的3’末端。
同源重组时，TK基因将被切除而丢失，而在随机整合时，所有的序列（包括TK）均保留。
（图1）当加入G418和GANC后，HSV-TK由于表达的胸苷激酶可使GCV（ganciclovir）转变为毒性氨基酸，使含此基因的转染细胞死亡。
同源重组后，因HSV-TK基因位于构建的打靶载体目的基因同源序列之外，所以可用GCV来筛选随机整合的阳性克隆细胞。
因此经过正负双选择系统的筛选可得到同源重组已发生的阳性克隆细胞。
图1正负双选择标记系统基因打靶技术的出现为在体内研究抑癌基因的功能提供了可能。
基因敲除或称基因打靶，对象是胚胎干细胞（ES），注入ES细胞的基因片段与靶基因发生同源重组后可使该位点上的一个等位基因发生突变，携带有突变的等位基因的ES细胞重新注射到正在分裂的囊胚中，再移植到假受孕体鼠，其F1代产生的是嵌合体小鼠，近交F2代中就会产生纯合子后代。
利用此方法，最先建立的抑癌基因动物模型是p53-/-小鼠16。
P53-/-小鼠自发肿瘤发生早，且经化学致癌物诱发的肿瘤生长速度明显加快，这些结果提示p53具有抑癌功能。
除p53基因外，相继建立的抑癌基因剔除小鼠模型还涉及Rb、Apc、Nf1和Nf2、Brcal和Brac2等基因17。
p21、p16、p15等抑癌基因的突变也与多种恶性肿瘤的发生有着密切的关系，黑素瘤就是其中之一18。
Shapiro19在实验中发现，p16缺失的NSCLC细胞株中出现Rb持续磷酸化，转染p16后恶性生长受到抑制，表明p16对肿瘤生长具有抑制作用。
Sharpless20等发现，p16缺失的小鼠自发性或致癌物诱导性肿瘤的发生率明显增高。
以上模型在应用于抑癌机理的探索过程中，常有出乎意料的结果，这可能是由于人和小鼠之间许多基本的生物学差别所造成。
4.条件性基因打靶(conditional gene targeting)常规的基因打靶技术无法控制靶基因的表达，外源基因的表达不具组织特异性，且许多抑癌基因的纯合缺失容易导致早期胚胎死亡。
此外，在培养纯系小鼠的过程中，有些基因的互补效应也增加了表型分析的复杂性。
而条件性基因打靶则是在常规的基因打靶基础上，利用重组酶介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“开关”，从而使对小鼠基因组修饰的范围和时间处于可控状态。
条件性基因打靶技术有效地克服了常规基因打靶的上述缺点，因而能更加真实地模拟体内抑癌基因的失活过程。
(图2)条件性打靶的示意图条件性基因打靶的结果是使靶序列被删除或倒置。
目前使用得最广的是噬菌体P1的Cre和酵母flp重组酶。
它们分别识别34bp的LoxP和48bp的Frt位点。
早在1983年，CoxMM就发现大肠杆菌内flp基因所表达的flp重组酶可以特异性地让其质粒DNA发生置换，此后人们利用这项发现开展了一系列条件性基因打靶研究。
1993年，Gu等21以Cre-LoxP系统为基础，利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性，从而在LoxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰的目的(图2)。
人们可以通过诱导剂给予时间预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制，以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。
Johnson等22利用噬菌体Cre-loxP系统建立了在转基因小鼠肺组织中特异表达Ras 基因的模型。
此模型种，Ras癌基因一侧连接了LoxP单元和一个终止信号，并将其导入小鼠基因组中。
只要终止信号存在,Ras基因就没有活性。
当小鼠吸入一种含有Cre基因的重组腺病毒之后，腺病毒感染肺细胞，Cre基因与LoxP单元发生重组，LoxP单元与终止信号从Ras基因侧翼被切下,失去终止信号的Ras基因就在腺病毒感染的肺细胞中表达了。
通过控制吸入腺病毒的数量,来控制Ras基因在肺细胞中表达的数量。
这种小鼠模型与人类癌症发生非常相似，首先是区域细胞增生，然后是非癌增生，接着发展成恶性腺癌。
利用Cre-LoxP系统和Flp-frt系统也可用于特定组织器官或特定细胞中靶基因灭活的表型改变研究23。
5.基因捕获技术（gene trapping）条件性基因打靶技术是目前被用来研究结构信息明确的基因功能的最重要的手段之一。