浅谈结核分枝杆菌的快速诊断

浅谈结核分枝杆菌的快速诊断

著者：

xx于xxxx田皓xx

指导教师：

xx

[摘要]：

结核是一种常见的传染病，一直是威胁人类生命健康的传染病的主要杀手之一。目前，虽然常规细菌学检查依然是临床诊断的金标准，但由于分枝杆菌生长缓慢，其分离，鉴定和药敏实验通常要几周或更长时间，因此其快速断具有十分重要的临床应用价值，分子生物学技术是目前临床应用的重要的快速检验方法。此外，还有新兴的噬菌体裂解技术。本文将主要介绍这两种方法。

[关键词]：

结核杆菌，分子生物学技术，核酸探针法，PCR，PCR-SSCP，基因芯片技术，噬菌体裂解技术

1882年，德国细菌学家Kohn发现结核分枝杆菌(MTB)为结核病的致病菌。至此，人类从未停止过对结核分枝杆菌以及抗结核药物的研究。近年来，结核病在全球范围内又死灰复燃，成为传染病的首位杀手。由于人口剧增，移民增加，吸毒酗酒与贫困等原因以及细菌本身耐药性的产生，结核病日益严重，发病率呈回升趋势。全世界已有约20亿人感染了结核分枝杆菌。每年有900万新结核病人，约300万人死于结核病[1]

。因此，早期快速诊断MTB感染，为临床积极治疗提供依据，更显得极为重要。结核病的快速准确诊断是控制结核病的重要措施。

一、结核分枝杆菌实验室诊断概况

结核分枝杆菌是一种细长略弯曲的杆菌，分枝状排列，一般的染色方法不易着色，常用Ziehl-Neelsen抗酸染色方法，故又称抗酸杆菌[2]

。该菌为专性需氧菌，营养要求较高，生长缓慢，繁殖一代需18小时，在固定培养基上2—5周才出现肉眼可见的菌落[3]

。因此在临床上很容易贻误病情，不利于早期治疗，所以对结核分枝杆菌的快速诊断也迫在眉睫！

目前对结核分枝杆菌的诊断方法大致可以分为四类。第一类为常规的细菌学检验方法，如涂片染色法、细菌培养法等。虽然仍作为检验MTB的金标准，但该方法缺乏特异性、耗时长（一般需要一周左右的时间），且假阴性率高，只能结合临床表现和X线检查。故而对早期快速诊断MTB并不适用。第二类为免疫学方法，依靠检测MTB特异性抗原进行诊断。乐军等[4]

提出了用ELISPOT检测MTB特异抗原T淋巴细胞的频率，该方法特异度为

95.5%。Lyshchenkok等[5]

通过检测MTB重组抗原来提高MTB的敏感性，即鸡尾酒式MTB特异性复合抗原。第三类是利用分子生物学方法进行快速诊断，该方法耗时短（只需1—2天）且特异性和敏感性较高，是目前临床上的理想诊断方法。第四类是目前仍在探索和研究中的分枝杆菌噬菌体裂解法应用于MTB的临床诊断。本文将重点介绍分子生物学方法和噬菌体裂解法应用于临床中对MTB的快速诊断。

二、结核分枝杆菌的实验室快速诊断技术

(一)分子生物学技术

1.核酸探针法

核酸探针是指带有放射性和非放射性核酸标记物的已知序列的DNA或RNA 片段。核酸探针法的基本原理是利用已知的核酸探针检测MTB核酸样品中特定的基因序列，如有顺序完全互补的核苷酸序列，则通过核苷酸间碱基互补的原理互相结合，形成杂交体，再通过显色或显影的方法将MTB的核苷酸顺序的位置或大小显示出来。近年来，已将核酸探针应用于对细菌、病毒等的临床诊断中。张灵霞等[6]

报道通过利用DNA探针、辣根过氧化物酶发光来检测痰、脑脊液等结核标本，有较高的敏感性。

2.基因芯片技术

基因芯片又称DNA芯片或蛋白质芯片，系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400）序列已知的寡聚核苷酸探针分子固定于支持物（如玻璃板，硝酸纤维素膜等）上，与待检标本中标记的DNA或RNA进行分子杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和序列信息[7]

。xx等[8]

以DNA直接测序法为对照，用DNA微阵列技术分析28种分枝杆菌标准菌株和9种非分枝杆菌菌株。结果显示，DNA微阵列技术的特异性为100%，并可以同时鉴别出其种属。因此，DNA微列阵技术可简便，快速，灵敏且特异性好地将大多数分枝杆菌鉴定到种属，为临床治疗提供快速、准确的诊断。

3.PCR及其衍生技术

PCR是一种体外核酸扩增系统，根据DNA分子天然复制的过程，通过高温变性、低温退火、适温延伸过程，经过若干循环，将特异的DNA片段进行扩增，从而进行临床检测。PCR的方法敏感性优于常规方法，但在扩增过程中不可避免地会出现污染，如用电泳法鉴别产物，引起产物的交叉感染；非特异性扩增；结果不准确出现较高的假阴性和假阳性率等等。因此，产生了PCR的衍生方法——逆转录—PCR

逆转录—PCR即以RNA为模板，先将RNA逆转录为cDNA，再进行PCR检测。mRNA与DNA及rRNA不同，在于其易被破坏，典型的半衰期只有2-

3min，细菌死亡之后mRNA便会从死细菌细胞中快速消失，因此mRNA的存在通常是结核基因连续转录的标志。因此，以mRNA为基础的扩增试验可用于区分活菌还是死菌[9]

4.PCR-SSCP

多聚酶链式反应-单链构象多态性分析法（PCR-SSCP），主要用于结核杆菌耐药性的检测。其原理为根据在非变性聚丙烯酰胺凝胶中相同长度单链DNA片

段泳动距离的改变判定单个碱基变异。由于利福平耐药突变只在特定区域内发生，而通过PCR方法扩增这段基因，电泳直接判定突变有无，大大简化了突变分析操作。Telenti[10]

最先评估了放射性同位素标记PCR-SSCP方法的结核杆菌ropB突变中的应用价值。所有利福平耐药菌株均成功地被检测出来，证明此方法特异准确。它可以同时进行大量临床标本筛选，使结果报告时间缩至48～72小时。目前国内外本方法的研究较多，并已有成功用于临床痰标本及脑脊液标本检测的报道[

11、12、13]

。SSCP方法为临床快速简便鉴定结核杆菌ropB基因突变开辟了新领域，尽管存在一定不足，如每次电泳均需有标准结核杆菌株对照及有时差异不易区分、不能鉴别沉默突变[14]

等，但仍不失为一种有广泛应用前景的方法。

分子生物学技术，能够对临床早期疑似病人的结核病进行早期的快速诊断，而且灵敏度和特异性较高，不失为临床上诊断结核分枝杆菌的快速方法。但是在实践中，由于成本和实验室条件要求较高，该方法在临床上的普及受到了一定的制约。

(二)噬菌体裂解技术

从1947年Gardner首次分离出分枝杆菌噬菌体，至今已分离出了250余种。噬菌体作为一项新的研究工具逐渐被开发和利用[16]

。从而开辟出一个对MTB研究和诊断的新领域。

分枝杆菌噬菌体是一种专性寄生于分枝杆菌的DNA或RNA病毒，有裂解型（毒型）和温和型（溶原型）两类。分枝杆菌噬菌体具有病毒的共同生物学特性：

个体小，结构简单，能通过滤器，没有独立的代谢酶系，只能在活的处于代谢状态的宿主体内繁殖。分枝杆菌噬菌体感染细菌具有种属行异性，即一种噬菌体只能感染一个细菌种属，甚至于一个种属的几株细菌。