氨氧化古细菌(AOA)的研究进展

氨氧化古细菌（AOA）的研究进展 摘要一直以来，氨氧化细菌（AOB）是硝化反应中负责将NH4+ 转化成为NO2- 的一类无机自养微生物。近几年来国外一些学者于海洋中发现氨氧化古细菌（AOA）存在，它们同样广泛存在于土壤、自然水体、污水处理厂、垃圾渗滤液等产生硝化反应的环境中，负责将氨转化为亚硝酸盐。甚至在某些生态环境中，AOA 占主导地位。概述了国外对不同环境下氨氧化古细菌种群多样性的差异，以及各类环境中共有的氨氧化古细菌种类。最后，对今后氨氧化菌深入研究的方向及其功能作了进一步的展望。 [关键字]：氨氧化古细菌 系统发育 生态分布 Advances on Ecological Research of Ammoniaoxidizing Abstract：For long times, ammonia oxidation by ammonia-oxidizing bacteria （AOB）is the key process in thenitration reaction. These ammonia-oxidizing bacteria are a kind of inorganic autotrophic microorganism who have theresponsibility of transferring NH4+ to NO2-. But in these several years, some foreign researchers found ammonia-oxidizingarchaea （AOA）who exist in the marine. They are generally in the environment which contains nitration reaction,such as soils, fresh water, wastewater treatment systems. soils and even wastewater treatment. AOA have thesame function as AOB, and in some certain habit, the AOA are the predominant oxidizer. We also summarize thediversity difference between the AOA in various environments. Here we describe our perspectives for the future researchof AOA in applied ecology and environmental protection． Keywords：Ammonia-oxidizing archaea; Phylogeny; Ecological distribution 1 氨氧化古细菌在生态环境中的分布 1.1 AOA 的发现 氨氧化细菌（AOB）在泥土、淡水、海水层、河口以及沉积物等各种生态环境中已经得到了广泛关注，并在海洋的上层和深海层中的生物地球化学循环中起到了关键作用。但是近年来，越来越多的研究表明，在氨氧化培养中，有硝化作用的古细菌在海洋泉古菌中有很高的丰富度。这在氨氧化菌的研究方面是一个极大的突破。Landmark 用独立培养的方法 揭示了有很大一部分泉古菌生长在冰冷的含氧海水中[1-2]，例如，海洋泉古菌在全世界的海洋中有1028 之多。这种数量上的优势表明了氨氧化古细菌（AOA）在全球生态地球化学循环中占有重要地位。2005 年，Venter 等进一步深入研究了浮游生物古细菌的新陈代谢能力，并在含马尾藻海洋中，通过对DNA 序列的打靶，研究了微生物基因的多样性。基于他的发现，一个独特的氨单（加）氧酶基因位于相关古细菌的scaffold 处，Venter 等认为一些古细菌也许具有能够执行化能自养硝化作用的能力[3]。同年，Konneke 等从热带海洋水族馆鱼缸里的岩石土壤底层中分离出一株氨氧化古细菌，命名为Nitrosopumilusmaritimus。通过定量PCR 的测定，证明了这些含丰富泉古菌的培养揭示了氨氧化成亚硝酸盐的氧化速率与泉古菌丰富度的增加一致[4]。 1.2 在环境中的分布及环境因子对其分布的影响硝化反应，是微生物的连续氧化过程，将氨氧化到亚硝酸盐再到硝酸盐，它是生物地球化学氮循环中关键的一步。氨氧化微生物催化硝化反应中限速的第一步———氨氧化为亚硝酸盐。直到前些年，氨氧化的微生物群落才逐渐开始被研究清楚，β- 和γ- 变形菌纲的好氧无机化能自养细菌是目前得到肯定的氨氧化微生物群。但是近几年，对氨氧化菌的研究有了很大的变化和进展[5]。首先，厌氧氨氧化被 认为是一种生物过程的新分支[6-7]；不久，属于泉古菌属的氨氧化古细菌（AOA）的分离培养带来了一次飞跃性的进展[4]。研究发现，在一些不同类型的土壤，北海、大西洋、太平洋和黑海这些陆地和海洋生态系统中，AOA 的数量超过了氨氧化细菌（AOB）。更进一 步的分子学研究也证明了AOA 与海洋海绵体可以共生存[9-12]，而且针对AOA 的amoA 基因的很多研究样品来自范围更广泛的生态环境中[13-15，16-19]。硝化反应中AOA 的发现是微生物的进化历史和多样性研究的巨大变革。 1.2.1 土壤环境 2006 年，S. Leininger 等取土壤样品，通过设定amoA 基因和四醚脂（泉古菌的特征物质）对泉古菌可能的生态影响进行量化研究，发现AOA 的种群结构在不同土层深度是不同的，这也反映了可能存在不同生态类型的AOA。同时，通过为古细菌的amoA和16SrRNA 基因设计的5 种不同引物结合体，得到AOA 比AOB 更占具主导地位的结果[20]。这是第一个关于自然湖水的研究，尤其是针对其中的根际沉积物__ Francis 等[3]定义的水体/ 沉积物菌种（种A1）和土壤/ 沉积物菌种（种B），而且它们在微生物根际和非根 际沉积物中的菌种类型是不同的。研究结果表明，在水生植物根际沉积物中，AOA 在数量上是AOB 的500~8 000 倍。同样的结论在某些土壤生态系统[22]和陆生植物根际环境[23-24]中也可以得出。尽管会呈现空间和季节性的变化，但是AOA 在L.uniflora 的根际环境的氨氧化群落中，始终占主导位置。这种趋势暗示了AOA 很可能比AOB 更能够适应根际的微需氧环境或者更能优先利用根部释放的能源[25-26]。在根际土壤中，根系释放的O2、CO2 等对AOA有很大的影响。在缺氧条件下培养，检测到土壤中AOA 的amoA 基因数量很低，而且氨氧化能力也极大地降低。Bowatte 等在2007 年研究了根系周围的CO2 升高对根系AOB 和AOA 群落的影响，结果发现AOB 的amoA 基因在根系土壤和非根系土壤中几乎没有变化；而AOA 的amoA 基因则占多数，AOA∶AOB 的范围在1.2~69.3。值得一提的是，在根际土壤中硝酸盐增加时，古细菌amoA 基因的cDNA拷贝数有显著的增加，这表明了在含水量大的土壤中，硝酸盐可以反硝化为氨，增加了古细菌amoA 基因在RNA 水平的表达。因此，很有可能AOA 在水稻根系土壤中古细菌占主导地位[21]。2008 年，Tourna 等针对不同环境因子对氨氧化菌的影响进行研究，他们从苏格兰农业大学、Craibstone 、Aberdeen、Scotland 采集表层10 cm 的土壤样品，研究发现非嗜热氨氧化泉古菌的氨氧化作用是以AOA 和AOB 中amoA 基因丰富度为基础，而不是AOA 和AOB 的活性。在硝化反应过程中，DGGE和16SrRNA 以及amoA 基因分析都没有检测到AOB 群落结构的变化；而AOA 在高温培养时期，群落结构发生了很大的变化。在高温期，随着AOA 的 序列类型相对丰富度的增加，其群落结构也有很大的变化，海洋古细菌种有所增加，土壤古细菌反而没有增加。这种现象说明了非嗜热泉古菌在土壤硝化反应中起到了重要的作用[27]。 1.2.2 水体环境 众所周知，海洋是硝化的重要场所，古细菌在海洋中的微生物群体中占主要优势，在Santa Barbara海峡，泉古菌门和亚硝酸盐的浓度显然是随着时间而相互联系。可以认为古细菌的一个部分重要的作用是氧化重新矿化的NH4+（例如，执行化能自养硝化作用的第一步），更可能的是，也许水体中的AOA控制着古细菌更广泛的模式[28]。这些研究都表明，泉 古菌的一些特定的类群，主要功能是自养氨氧化。海洋泉古菌被证明在海洋氨氧化反应中起到很重要的作用，因此对海洋生物化学循环有着不可忽视的作用。近年来， 一株自养氨氧化菌Nitrosopumilusmaritimus 的培养为一些海洋浮游泉古菌的氨氧化能力提供了确凿的证明。Mincer 等2007 年的研究数据表明，泉古菌和Nitrospina 主要分布在海洋上层透光带地区以下，只有冬天深层洋流混合时期，这些浮游泉古菌能在表层有适量的分布。相反的，广古菌在蒙特雷湾的分布与浮游泉古菌相关，当亚硝酸盐出现最高值时，广古菌在表层水体体现高的丰富度。这也说明了这些浮游广古菌可以利用这些亚硝酸盐。尽管对浮游广古菌的生理学特性还没有很深入地研究，但是它们在公共海域的表层透光带地区的分布与它们基因组中proteorhodopsin 基因的存在相一致。2007 年，Hatzenpichler 等首次证实了嗜热AOA 的高丰富度，同时第一次在细胞级别上证实了这些AOA 属于土壤泉古菌1.1b。他们在46 ℃的温泉中进行氨氧化富集培养，从中筛选出氨氧化微生物。经过16SrRNA、克隆、RFLP 筛选并测序，发现温泉中得到的46 组序列均属于土壤泉古菌1.1b，通过amoA、amoB 基因扩增，相似度都大于99%。他们又通过催化报告分子沉淀- 荧光原位杂交（CARD-FISH）和膜显微自显影（MAR）方法证明这些嗜中温古细菌在氨中的代谢活性：当氨浓度在 0.14 和0.79 mM 时AOA 的活性最高；当氨浓度在3.08 mmol/L 时对AOA 的活性有部分抑制[5]。同年，Sahan 等对Westerschelde 入海口沉积物中的氨氧化菌的时空分布进行了研究，amoA 基因的数值分析表明，盐度、温度、亚硝酸盐浓度和净初级生产率对AOA 的分布有较大的影响。温度和盐度的变化使得样品中的AOA 群落分离开，2 月、3 月和4 月；5 月、7 月和9 月。本文中发现净第一生产力的增加使9 月的样品中AOA 群落增加了几乎3 倍。另外，虽然亚硝酸盐的浓度对AOB 种群分布没什么影响，但是可能对AOA 的分布有一定的影响。1999年，Murray 等对Santa Barbara 渠道的研究也得到了相似的结论。2006 年，Wuchter 等对北海的研究中发现，海洋泉古菌的丰富度与亚硝酸盐呈正相关，但是β- 和γ- 变形菌纲的丰度几乎没什么变化。当然，用的[29]。 2 氨氧化古细菌（AOA）有关16SrRNA 和amoA 基因的研究进展 针对硝化反应限制速率的第一步———氨氧化反应的研究，一直都集中在AOB。在基于16SrRNA(确定了β- 和γ- 变形菌纲的AOB) 的研究中，AOB序列分布明显的地域性与入海口大梯度变化的盐度，氨浓度和氧浓度相联系[30]；在amoA 基因(编码了氨加单氧酶的α 亚基)的研究中，也得到同样类似的结论[31-32]。尽管这些数据为入海口沉积物中AOB的动力学研究作出了显著贡献，但是目前由于在硝化反应中发现优势微生物种群———古细菌，所以有关微生物的氨氧化反应和硝化反应必须在此基础上进行重新评估。古细菌是由一类独一无二、数量巨大的微生物群落组成[33-35]，仅在海洋中，就发现适温古细菌之王———泉古菌存在，数量高达1028。尽管这类微生物在海洋生物化学循环中的作用还有待进一步探究， 但是系统发育的多重汇集菌株表明，多数泉古菌负责氨氧化反应。这些在针对氨加单氧酶（amo）基因的宏基因组研究有：与马尾藻海中支架相关联的古细菌中的amo[36]，来自1.1b 土壤泉古菌中一个16Sr-RNA 基因，在相同的43kb 宏基因