泛素化蛋白检测办法

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泛素化蛋白检测方法

●蛋白质泛素化简介

蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程

一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活

性状态以及细胞内定位等情况。

泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列

酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有

（

位赖氨

种E2

酶、600

的作用。结

构域的E3酶。这

两种E3

●

的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？

然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游的信号通路

有什么影响？

研究上述内容的实验方法和实验流程：

方法一：westernblotandstrip

通过WB检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和

特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的

特定位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】

方法二：westernblotandimmunoprecipitations

通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和westernblot分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。

方法三：invitroubiquitinationassay

将要研究的目的基因转染293细胞，使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A（被泛素化的那个蛋白）与UBE1，UbeH13-

SDS

方法三：invitroubiquitinationassay