第13章、生物活性测定技术

变化来测定酶活性。
3 荧光法（fluorescence）
氧化态的黄素（ flavin ）化合物发出强
烈 的 荧 光 ， 还 原 态 失 去 荧 光 。 NAD+ 和
NADP+ 无 荧 光 ， 而 NADH 和 NADPH 有 460nm蓝色荧光。荧光法灵敏度高。
4 同位素测定法（isotope determination）
6 化学分析法（chemical analysis）
酶促反应一段时间后，取出一部分反应液，
用化学方法分析底物或产物的量。如 ACC合成酶
的 产 物 ACC 的 测 定 ： 加 HgCl2 终 止 反 应 ， 加
NaOCl-NaOH 混合液使 ACC转化成乙烯，再用气 相色谱测乙烯。
1-氨基环丙烷-1-羧酸 （ACC）
No inhibitor
Vmax
（变小）
With noncompetitive inhibitor
Km (不变) Fig. Noncompetitive inhibitio13.
[S]
1
) ) = (1+ (1+ + v Vmax [ ki ] [S] Vmax [ ki ]
1/ v With
1 [I] (1+ ) Vmax [ Ki ] noncompetitive inhibitor
比活性
酶的纯度往往用比活性来表示，比活性是
用同一酶制剂的酶活性除以蛋白质的质量，即 单位质量蛋白质所具有的酶活性，常用的单位 为u/mg protein。酶制剂的比活性越高说明酶 的纯度越高。
二、酶活性测定的主要方法
温度、 pH 、离子强度（ I=(1/2)Σ CZ2 ）等因 素对酶活性有很大的影响，测定酶活性时一般采 用最适环境条件。若酶催化反应时需要辅助因子， 应加入最适量的辅助因子。底物浓度应采用零级 反应时的底物浓度，这时反应速度只与酶浓度有 关，而与底物浓度无关。随着反应的进行，产物 浓度越来越高，而底物浓度越来越低，导致反应 速度下降，所以测酶活性时应测反应的初速度， 即反应开始后较短一段时间内的反应速度（反应 了的底物不超过5%）。
应用：计算酶的转换数（TN，催化常数Kcat）单位 时间内每个酶分子将底物分子转换成产物的最大值 。
计算公式为： V max TN E
(单位是s-1)
计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致
1. [S] ＜＜ Km时： υ=Vmax[S]/ Km 一级反应 2.若[S]＞＞Km 时： υ=Vmax 零级反应
通常以非共价键与酶和（或）酶-底物复合物结合，使酶活性 降低或消失。采用透析或超滤等物理方法可将抑制剂除去， 使酶恢复活性。
类型：
竞争性抑制（competitive inhibition） 非竞争抑制（ noncompetitive inhibition） 反竞争抑制（ uncompetitive inhibition）
70
80
90
Temperature C
Fig. The effect of temperature on enzyme activity.
二、pH对酶促反应的影响
pH-酶反应速率曲线与最适pH（optimum pH）
100
Tab. Optimum pH of some enzymes
80
Relative Activity (%)
Km
[I]
1
1
[I]
[I]
No inhibitor
-1 / Km
1/[S]
3)反竞争性抑制
1/v [I] 正常
1/[S] -1/Km(1+[I]/ki)
表. 三种抑制作用总结
类型
无抑制剂
米氏方程
v = Vmax[S]/(Km + [S]) v= Vmax[S]Ki/(Km Ki + Km [I] + Ki[S] )
胃蛋白酶
60
过氧化氢酶 胰蛋白酶
40
延胡索酸酶 核酶
20
精氨酸酶
0 2 3 4 5 6 pH 7 8 9 10
Fig. The effect of pH on enzyme activity.
13.3、酶动力学参数的测定
1．米氏方程
Vmax [S] v K m [S]
Km为米氏常数
（一）酶促反应
态的酶制剂，其酶含量可用单位质量酶制剂所含的
酶活性单位来表示，即u/mg。
国际酶活性单位
1961 年，国际酶学会议为酶活性单位规 定了一个统一的标准，即在特定的条件下 （一般为酶催化反应的最适条件）， 1 分钟转 化 1μ mol 底物，或转化 1μ N 底物有关基团所
需的酶量为1个国际单位（IU）。
酶促反应式
K4
米氏方程：

（二）米氏常数Km
1．Km的含义:
当Km=[S]时，V= Vmax/2，Km值等于反应速率达到最 大反应速率Vmax一半时的底物浓度。
2．Km的意义
Km是酶的一个特征性常数
反映酶对底物亲和力的大小
鉴别酶的种类
判断可逆反应的速率
（三）Vmax
定义：Vmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即 酶完全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈 正比。
温度稳定性
最适pH pH稳定性 酶动力学参数测定 金属离子对酶活性的影响
有机溶剂对酶活性的影响
酶活测定：取缓冲液 2.4mL 于试管中，加入 0.5mL0.01mol/L PNPP，45℃水浴 10min，加入 0.1mL 酶液，1min 后加入 1mL 1mol/L NaOH 终止 反应。对照组先加入 1mL 1mol/L NaOH，再加入 0.1mL 酶液。最后用分光光度计测定 405nm 处的 吸光度。 一个酶活力单位定义：在此反应条件下，每 毫升溶液每分钟催化底物水解，产生 1μmol 产物 所需的酶量。
和应用时，都要遇到对酶的活性、纯度及含量进行
经常的、大量的测定工作，这是必不可少的指标。 要研究某种酶，首先必须建立起该酶活性的测 定方法。 酶活性是指酶催化一定化学反应的能力，检查 酶的含量及存在，通常是用该酶在一定条件下催化 某一特定反应的速度，即酶的活性来表示。
一、酶活性单位
酶活性指的是酶制剂催化能力的大小，它既与 酶分子的浓度（量）有关，又与酶分子催化能力的 大小（质）有关。人们规定一定的催化能力为一个 酶活性单位。液体酶制剂的酶浓度用单位体积酶制 剂所含的酶活性单位来表示，即 u/ml。对于固体状
-1
6
8
10
1/[S](1/mmol.L )
Fig.The Lineweaver -Burk double-reciprocal
13.4、酶促反应的影响因素
激活剂 抑制剂
1.激活剂
激活剂（activator） 无机离子 提高酶活性。
金属离子: K+、Na+、Ca2+、Mg2+ 、Zn2+ 等。
1) 竞争性抑制
ki2
ki1
• 竞争性抑制曲线
v
Vmax （不变）
No inhibitor With competitive inhibitor
Km
Km (变大)
[S]
1
) = (1+ + v Vmax [ ki ] [S] Vmax
1/v With competitiv e inhibitor [I]
1、最适反应温度
在 pH 9.0 条件下，分别测定 ALP 在 25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、
55℃、60℃和 65℃反应体系中的酶活力。
以反应温度为横坐标，相对酶活力为纵坐 标，绘制酶活变化曲线。
2、温度稳定性研究
将纯酶液与适量 0.05mol/LTris-HCl 缓冲 液（pH 9.0，含 0.1 mol/LNaCl）混合，分别
在 25℃、35℃、45℃、55℃放置 4h，每小
时测定一次酶活力。以静置时间为横坐标， 相对酶活力为纵坐标，绘制酶活变化曲线。
3、最适反应 pH
在最适反应温度条件下，分别测定 ALP 在
pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5 和 11.0 反应体系中的酶活力。其中，pH 7.0、7.5、 8.0、8.5、9.0 的缓冲液为 0.05mol/LTris-HCl 缓冲 液；pH 9.5、10.0、10.5 的缓冲液为 0.05 mol/L 甘 氨酸-氢氧化钠缓冲液；pH 11.0 的缓冲液为磷酸氢 二钠-氢氧化钠缓冲液。以反应pH 为横坐标，相
(1)不可逆抑制作用（irreversible inhibition)
抑制剂以共价键和酶分子上必需基团结合（牢固结合），使 酶活性降低或丧失，这种抑制剂不能用透析、超滤等物理方 法解除抑制作用。 专一性的不可逆抑制 不可逆抑制 非专一性的不可逆抑制
(2)可逆抑制(Reversible Inhibition)
Vmax
Vmax 不变
Km
Km 增加
竞争性抑制
非竞争性抑制
反竞争性抑制
v = Vmax[S]Ki/(Km + [S])( Ki + [I])
v = Vmax[S]Ki/(Km Ki + [S] Ki + [S][I])
减小
减小
不变
减小
13.5、实例
最适温度
菲律宾 蛤仔碱 性磷酸 酶的酶 学性质 研究
形式 NADH 和 NADPH 在 340nm 处光吸收较大，因
此可以测定340nm处的光吸收变化来检测NADH和 NADPH的生成或减少，从而得知脱氢酶的活性。
乳酸脱氢酶催化的反应