液态发酵生产水溶性红曲黄色素的条件优化

研究报告　中　国　酿造　２０１６年第３５卷第１１期　总第２９７期　・７３・　

液态发酵生产水溶性红曲黄色素的条件优化　李瑞杰，谢玉梅，何思琴，王磊，陈　莎，高梦祥，李利　（长江大学生命科学学院，湖北荆州４３００２５）　摘要：以红色红曲菌（Ｍｏｎａｓｃｕｓｔｕｂｅｒ）Ｍ．７为实验菌株，以色价和色调为评价指标，对液态发酵生产水溶性红色红曲黄色素的条件　进行了研究。结果表明，培养基ｐＨ值为３～４时，红色红曲菌Ｍ．７能合成大量的水溶性红曲黄色素，发酵液呈鲜艳的黄色色调；培养基　最优碳源为２％蔗糖，最优氮源为０．２％硫酸铵；水溶性红色红曲黄色素的色价和色调值随着培养时间的延长先升后降，在第８天时达　到最高，色价为５．５６Ｕ／ｍＬ，ＯＤ　ｍ／０Ｄ５。ｏｍｎ为１Ｏ．２９，ＯＤ４００　。／０Ｄ　为３．９３。　关键词：红色红曲菌；水溶性红曲黄色素；液态发酵　中图分类号：ＴＳ２６４．４　文章编号：０２５４—５０７１（２０１６）１１—００７３—０５　ｄｏｉ：１０．１１８８ｗｊ．ｉｓｓｎ．０２５４—５０７１．２０１６．１１．０１５　

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆｌｉｑｕｉｄ－ｓｔａｔｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｙｅｌｌｏｗ　Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｇｍｅｎｔ　

ＬＩ　Ｒｕｉｊｉｅ，ＸＩＥ　Ｙｕｍｅｉ，ＨＥ　Ｓｉｑｉｎ，ＷＡＮＧ　Ｌｅｉ，ＣＨＥＮ　Ｓｕｏ，ＧＡＯ　Ｍｅｎｇｘｉａｎｇ，ＬＩ　Ｌｉ　（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，Ｙａｎｇｔｚｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ　４３００２５，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ　Ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｒｕｂｅｒ　Ｍ・７　ａｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｓｔｒａｉｎ，ｃｏｌｏｒ　ｖａｌｕｅ　ａｎｄ　ｃｏｌｏｒ　ｔｏｎｅ　ａｓ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｉｎｄｅｘ，ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｙｅｌｌｏｗ　Ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｐｉｇｍｅｎｔ　ｂｙ　ｌｉｑｕｉｄ　ｓｔａｔｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｐＨ　ｗａｓ　３－４，ａ　ｌａｒｇｅ　ｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｙｅｌｌｏｗ　Ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｐｉｇｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｂｙ　Ｍ　ｒｕｂｅｒ　Ｍ一７．ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈｓ　ｗａｓ　ｂｒｉｇｈｔ　ｙｅｌｌｏｗ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃａｒｂｏｎ　ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆｔｈｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ＷａＳ　ｓｕｃｒｏｓｅ　２％，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｏｕｒｃｅ　ｗａｓ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｓｕｌｆａｔｅ　ＯＩ２％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｃｏｌｏｒ　ｖａｌｕｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｌｏｒ　ｔｏｎｅ　ｏｆｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｙｅｌｌｏｗ　Ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｐｉｇｍｅｎｔ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｓｔａｇｅ，ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌａｔｅ　ｓｔａｇｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍａｘｉｍｕｍ　ｐｏｉｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　８　ｄａｙ．Ａｆｔｅｒ　８ｄ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｂｌｅｙｅｌｌｏｗＭｏｎａｓｃｕｓｐｉｇｍｅｎｔｗａｓ　５．５６Ｕ／ｍｌ，ｏＤ　Ｄｓｌ０ｍｗａＳ　１０．２９　ａｎｄＯＤ枷　Ｄ　ｗａｓ　３．９３．　Ｋ　ｗｏｒｄｓ：Ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｒｕｂｅｒ；ｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｙｅｌｌｏｗ　Ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｐｉｇｍｅｎｔ；ｌｉｑｕｉｄ—ｓｔａｔｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　

随着人们健康意识的提高，天然食用色素越来越受　到国内外消费者的青睐。红曲色素（Ｍｏｎａｓｃｕｓｐｉｇｍｅｎｔｓ）是　我国近年来增长速度最快的天然食用色素，是红色红　曲菌（Ｍｏｎａｓｃｕｓｒｕｂｅｒ）发酵产生的次生代谢产物，包括黄　色、橙色和红色三类色素组分，在我国及东南亚地区已　有超过１　０００年的应用历史，目前在欧美等国家的肉制品（如　火腿肠）中也得到了很好的应用［１－２］。　黄色素是重要的食用色素，约占市场需求量的６０％以　上嘲。目前，市售的食用黄色素产品以植物提取为主（如姜　黄素、栀子黄等凹），因而易受季节、气候、产地等因素的影　响。相比之下，采用微生物发酵法进行天然食用色素的生　产，不受季节限制、原料转化率高、成本低，是目前世界食　品色素添加剂的发展趋势。目前，市场上应用广泛的红曲　色素以红色素为主，而红曲黄色素的生产起步较晚，目前　生产厂家也很少，产品并未大规模上市，而且存在色价和　色调都不高等问题【３】，因此，红曲黄色素的开发研究具有　广阔的前景，可产生显著的经济效益。　有研究表明，红曲菌所产生的红曲色素包括醇溶性组　分和水溶性组分［１］。目前的红曲色素产品一般以醇溶性组　分为主，水溶性较差，应用范围主要限制于油性食品（如火　腿肠、香肠等）中。近年来，通过菌种的选育和发酵培养基　的优化来获得高色价和色调值的红曲黄色素已取得一定　成果［５－１２１，但也均以生产醇溶性红曲黄色素为主。为丰富红　曲黄色素产品的种类，促进其在饮料等非油性食品中的应　用，本研究以红曲色素高产菌株一红色红曲菌Ｍ．７为实验　材料，通过液体发酵法研究了水溶性红曲黄色素的生产条　件，以探索一种安全、高效、低成本的水溶性红曲黄色素　的生产方法，为其工业规模化生产提供基础和参考。　１材料与方法　１．１材料与试剂　１．１．１菌株　红色红曲菌（Ｍｏｎａｓｃｕｓ　ｒｕｂｅｒ）Ｍ．７：由华中农业大学　

收稿日期：２０１６．０４．１９　基金项目：国家自然科学基金资助项目（３１５０１４５３：３１３７１８２９）；长江大学大学生创新创业训练计划项目（２０１５００８９）　作者简介：李瑞杰（１９９４．），女，本科生，研究方向为食品质量与安全。　・通讯作者：李利（１９８３一），女，讲师，博士，研究方向为食品微生物学。　２０１６　Ｖｏ１．３５　Ｎｏ．１　１　・７４・　Ｓｅｒｉａｌ　Ｎｏ．２９７　Ｃｈｉｎａ　Ｂｒｅｗｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｒｅｐｏｒｔ　

陈福生教授惠赠，该菌株为红曲色素高产菌株。　１．１．２培养基　红曲菌孢子培养基（查氏酵母琼脂（Ｃｚａｐｅｋ　ｙｅａｓｔ　ｅｘ．　ａｔｒａｃｔ　ａｇａｒ，ＣＹＡ））：ＮａＮＯ３　３　ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４　１　ｇ，ＫＣ１　０．５　ｇ，　ＭｇＳＯ４￣７Ｈ２０　０．５　ｇ，ＦｅＳＯ４￣７Ｈ２０　０．０１　ｇ，蔗糖３０　ｇ，酵母膏　５　ｇ，蒸馏水１　Ｌ，琼脂２０　ｇ，ｐＨ　５．５。　液态发酵种子制备培养基：在１　Ｌ蒸馏水中加入去皮　马铃薯２００　ｇ，煮沸３０　ｍｉｎ，用４层纱布过滤，滤液中加葡萄　糖２０　２，定容至１　Ｌ。　水溶性红曲黄色素液态发酵培养基ｌｌ３］：谷氨酸钠　５．０４　ｇ，ＫＣ１　０．５　ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０　０．０１　ｇ，ＭｇＳＯ４’７Ｈ２０　１　ｇ，　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０　０．０１　ｇ，ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ　０．００３　ｇ，葡萄糖２０　ｇ，　０．１　ｍｏ儿柠檬酸一磷酸盐缓冲液（ＤＨ　３、４、５、６、７或８）０．５　Ｌ，　蒸馏水０．５　Ｌ。　以上培养基灭菌条件为：１２１℃，２０　ｍｉｎ。其中水溶性　红曲黄色素液态发酵培养基中的葡萄糖单独灭菌，灭菌　条件为１１５℃，１５　ｍｉｎ。　１．２仪器与设备　ＴＥ１２４Ｓ电子分析天平、ＰＢ．１０　ｐＨ计：德国赛多利斯公　司；Ｍｉｎｉ　Ｓｐｉｎ　Ｐｌｕｓ离心机：德国Ｅｐｐｅｎｄ０　公司；ＨＶＥ．５０高　温灭菌锅：日本Ｈｉｒａｙａｍａ公司；Ｕ．１９００双光束紫外可见分　光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；ＳＰＸ．１００Ｂ．Ｚ　生化培养箱：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；叠加　式ＩＳ．ＲＤＳ３摇床：美国Ｃｒｙｓｔａｌ公司；ＧＺＸ．６０００电热恒温鼓　风干燥箱：上海新苗医疗器械制造有限公司。　１．３实验方法　１．３．１水溶性红曲黄色素的发酵　（１）孢子悬浮液的制备：将保存在４℃的菌种接种到　ＣＹＡ斜面上，２８℃培养１０　ｄ，加入５　ｍＬ无菌水洗下孢子，　用双层擦镜纸过滤除去菌丝，玻璃珠将孢子振荡打散，血　球计数板计数。　（２）种子的培养：２５０　ｍＬ＝角瓶中装液态发酵种子制　备培养基５０　ｍＬ，接种孢子悬浮液，使孢子的终浓度为　１０　个／ｍＬ，２８℃、２２０　ｒ／ｍｉｎ振荡培养４０￣４４　ｈ，作为种子液。　（３）液态发酵：２５０　ｍＬ三角瓶装水溶性红曲黄色素　液态发酵培养基１００　ｍＬ，接入上述种子液１０　ｍＬ，２８℃、　２２０　ｒ／ｍｉｎ振荡培养２～９　ｄ。　ｌ＿３．２生物量的测定　采取干质量法，即发酵完成后，发酵液用布氏漏斗抽　滤得到菌丝体，用３倍体积的蒸馏水洗涤菌丝体，于６０　ｃ【＝　中干燥至质量恒定，称质量。　１．３．３色价的测定　发酵液用布氏漏斗抽滤得到滤液，１２　０００　ｒ／ｍｉｎ离心　３　ｍｉｎ，稀释一定倍数，于２００￣６００　ｎｌｎ进行全波段扫描，分　别取波长４００　ｎｌＴｌ、４７０　ｎｎａ和５１０　ｎｎｌ处吸光度值计算黄色　素、橙色素和红色素的色价。色价计算公式：　色价（Ｕ／ｍＬ）＝ＯＤ值×稀释倍数　色价ｃＵ／ｇ）－　。　１－３．４色调的测定　本实验色调定义为黄色素／红色素＝ＯＤ￣ｏ＝／０１９５　。　；黄　色素／橙色素＝ＯＤ４ｏｏ珊／０Ｄ｝７０　。　２结果与分析　２．１　ｐＨ对红色红曲菌产水溶性黄色素的影响　据报道，ｐＨ对红曲色素的产生有一定影响　。一般　认为，酸性条件下主要产物为红曲黄色素和红曲橙色素；　中性或碱性条件下主要产物为红曲红色素。为了实现红　曲黄色素的生产，首先利用柠檬酸．磷酸盐缓冲液制备不同　ｐＨ的发酵培养基，研究ｐＨ对红曲菌液态发酵产色素的影　响，结果见图１。　巷　蛆］　口ＯＤ４ｏ０ＪＯＤ４７０ｎｍ　Ｉ　ＯＤ４ｏｏ　／０Ｄ５１０　３　４　５　６　７　８　ｐＨ　图１　ｐＨ对水溶性红曲黄色素色调的影响　Ｆｉｇ．１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐＨ　ｏｎ　ｃｏｌｏｒ　ｔｏｎｅ　ｏｆ　ｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｙｅｌｌｏｗ　Ｍｏｎａｓｃｕ８　ｐｉｇｍｅｎｔ　由图１可知，发酵培养基的ｐＨ对色素的种类影响很　大，在ｐＨ３￥１ｐＨ４时，红曲菌Ｍ．７产生较多的水溶性黄色　素，发酵液呈鲜艳的黄色色调，ＯＤ４ｏｏ＝／０１９５　。　分别为４．５０　和３．７６，ＯＤ４ｏｏｍ／ＯＤ４７ｏ　分别为２．４８和２．４０，黄色素的色　价分别为１．０４Ｕ／ｍＬ和０．９５Ｕ／ｍＬ；而当ｐＨ为５、６、７和８时，　红曲菌Ｍ．７产生较多的水溶性红色素，发酵液呈明显的　红色色调，　ＪＯＤ５　。ｍｎ依次为１．６６、１．０７、０．６９￣Ｄ０．６８，　０Ｄ彻ｔ￣／ＯＤ４７０Ⅲｎ依次为１．４４、１．００、０．７４和０．７３。该结果中　ｐＨ对红曲色素影响的规律与文献报道基本一致【Ｂ　］。因　此，将发酵培养基的ｐＨ值控制在３～４，可实现水溶性红　曲黄色素的发酵生产。在后续实验中，均将发酵培养基　的ｐＨ值控制在３～４。　２．２碳源种类对红色红曲菌产水溶性黄色素的影响　分别以２％的可溶性淀粉、玉米粉、大米粉、蔗糖、马铃　薯淀粉、葡萄糖为碳源，０．５％谷氨酸钠为氮源，初始ｐＨ值　为３．０，发酵２　ｄ后，考察碳源种类对发酵液中水溶性红曲黄　色素色价和色调的影响，结果见图２。　由图２Ａ可知，以可溶性淀粉、蔗糖和马铃薯淀粉为碳　源时水溶性红曲黄色素的产量较高，色价均＞８０　Ｕ／ｇ￣＇体干　质量；由图２　口，蔗糖为碳源时的色调值最高，ＯＤ４ｏｏｒＪＯＤ５　。ｍｎ、　ＯＤ４ｏｏ￣／０Ｄ４７ｏ　分别是４．７５、２．３５，表明此时产生的水溶性红