基因工程期末复习资料

分子克隆技术期末考试

一、名词解释

1、Restriction Endonuclease（限制性内切酶）：是一类识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列（4-8bp），并由此处切割DNA的核酸内切酶。

2、Competent cell（感受态细胞）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态，即易于吸收外源DNA的细胞。

3、Star activity（星星活性）：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。

4、Plasmid（质粒）：是一类存在于细菌和真菌细胞中独立于DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子,其大小通常在1-100KB范围内。

5、Plasmid vector（质粒载体）：在由限制性内切酶修饰过的质粒DNA序列中插入外源目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导入宿主细胞，进行重组、筛选、扩增的过程。

6、Binary vector（双元载体）：既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。

7、shuttle vector（穿梭载体）：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体。这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状，具有多克隆位点。

8、Isocaudarner（同尾酶）：不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可以产生相同的粘性末端。同尾酶切割DNA得到的产物可以进行互补连接。但形成的新位点不能被原来的酶识别。

9、MCS（multiple cloning site，多克隆位点）：是包含多个（最多20个）限制性酶切位点的一段很短的DNA序列，它是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。

10、Signal peptide（信号肽）：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质定位的N 端的氨基酸序列（有时不一定在N端）

11、R/M system（restriction and modification system，限制与修饰系统）：限制酶和甲基转移酶（甲基化酶）组成限制和修饰系统。限制作用实际上就是限制酶降解外来DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制，甲基化是常见的修饰作用，宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。该系统就好比人的免疫系统。

1）restriction（限制）：限制性内切酶将侵入细菌内的外源DNA切成小片段。

2）modification（修饰）：细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。

二、相关知识点

1、限制与修饰系统的比较

II I III 酶分子内切酶与甲基化

酶分子不在一起

三亚基双功能酶二亚基双功能酶

识别位点4-6bp，大多为回

文对称

二分子对称5-7bp非对称

切割位点在识别位点中或

靠近识别位点无特异性，至少在

识别点外1000bp

在识别位点下游

24-26bp

限制反应与甲基

分开的反应互斥同时竞争

化反应

否是是

限制作用是否需

要ATP

2、限制性内切酶的命名原则：

答：主要依据来源而定，涉及宿主的种名、菌株号或生物型。现在通用的命名原则是：

依次取宿主属名的第一个字母（大写）、种名的头两个字母（小写、斜体）、菌株号（小写）、然后再加上序号（罗马字）。

如：H in dIII限制性内切酶，H in指来源于流感嗜血杆菌，d表示来自菌株Rd，III 表示序号。

3、DNA聚合酶I与Klenow DNA聚合酶的关系：

答：Klenow DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中删去5’→3’外切核酸酶活性的肽段后的大片段肽段，其聚合性和3’→5’外切核酸酶活性不受影响。该片段也称Klenow 片段。

即：枯草杆菌蛋白酶

DNA聚合酶I Klenow DNA聚合酶

4、DNA连接酶：催化DNA5’磷酸基团与3’羟基之间形成磷酸二酯键。

1）T4DNA连接酶：可以连接粘性末端和平末端；

2）大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端。

5、反转录酶（reverse transcriptase）

依赖于RNA的DNA聚合酶，有5’→3’合成DNA活性，但没有3’→5’外切核

酸酶活性。

反转录酶的活性包括：5’→3’DNA 聚合活性（需Mg 2+），即以RNA 或DNA 为模板及带3’—OH 的RNA 或DNA 引物合成DNA ；5’→3’或3’→5’RNA 外切核酸酶活性，产生5’磷酸及3’羟基的长4-20个碱基的核苷酸。

6、末端转移酶（terminal transferase ）

一种不寻常的DNA 聚合酶，是一种不依赖于模板的DNA 聚合酶，具有5’→3’外切酶活性。

7、T4多核苷酸激酶（T4 polynucleotide kinase ）

是一种磷酸化酶，可以将ATP 的 -磷酸基团转移至DNA 或RNA 的5’末端。

8、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase ）

通过除去5’磷酸基团，可以防止DNA 片段自身连接。

二者的关系“

5’HO OH3’

3’HO OH5’

5’○P OH3’ T4多核苷碱性磷酸

3’OH ○P5’

9、普通载体最基本的原件：MCS、ORI以及选择标记。

10、线性DNA（LDNA）、开环DNA（OCDNA）以及超螺旋DNA（SCDNA）电泳速度的大小：

SCDNA>LDNA>OCDNA

11、ɑ-互补：LacZ′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。（现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为lacZ′基因。LacZ′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。LacZ′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）显色出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着lacZ′基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的β半乳糖苷酶，在IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lacZ′中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。）

蓝白斑实验的原理：由于克隆用载体带有lacZ的调节序列和β-半乳糖苷酶的部分编码序列，可以与缺陷型宿主在诱导物IPTG存在下，形成α-互补，宿主