gfp基因的克隆与表达

基因工程实验设计

题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达

专业：生工1001 姓名：刘会淼

2013年3月13

实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。

实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入 DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。

1.材料与方法：

1.1.1 实验材料

克隆菌 DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性内切酶 Bam H1、Not Ⅰ

1.1.2 仪器设备

Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管

1.1.3 试剂及溶液

分装后于121 ℃ 高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）；

溶液Ⅰ 50 mL

葡萄糖50 mmol/L

Tris-Cl (pH 25 mmol/L

EDTA (pH 10 mmol/L

121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存；

溶液Ⅱ 100 mL

NaOH mol/L

SDS 1% (W/V)

用时由母液2 mol/L NaOH、10%(W/V) SDS稀释现配；

溶液Ⅲ 100 mL

KOAc (5 mol/L) 60 mL

冰乙酸 mL

H2O mL

121 ℃高压灭菌 15 min后置于0~4 ℃贮存；

氯仿；琼脂糖；灭菌的去离子水；10×酶切缓冲液；TaqDNA聚合酶；TaqDNA聚合酶缓冲。灭菌的 mol/L CaCl2，标准相对分子质量的DNA；溴乙锭（EB）储存液μg/mL；LB/Kan（50 μg/mL）固体培养基；IPTG配成浓度为400 mM水溶液，-20 ℃保存备用；卡那霉素（Kan）配成浓度为100 ug/mL水溶液，-20 ℃保存备用；70%乙醇：用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成，放在0~4 ℃；无水乙醇：放在0~4 ℃；RNase 母液：将RNase 溶于10 mmol/L Tris·Cl(pH 、15 mmol/L NaCl 配成的试剂中，配成10 mg/mL的溶液，在100 ℃加热15 min，使可能溶有的DNase失活，然后缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20 ℃；

方法：

1.2.1 大肠杆菌DH-5α (pEGFP-N3)染色体DNA的提取

1.2.2、实验目的：掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。

1.2.3，器材：⑴，微量移液器、高速离心机、ＥＰ管、吸头、烘箱、水浴锅、管架、胶头滴管、冰箱

⑵，消化缓冲液: CTAB/NaCl溶液：?NaCl溶解于80ml?H2?O,缓慢加入

10g?CTAB,加水至100ml；其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:

异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70%?乙醇，TE，10%?SDS，蛋白酶?K?(20mg/ml

或粉剂)，5mol/L?NaCl。

1.2.4实验原理

生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA 紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。

1.2.5、实验步骤1.?100ml?细菌过夜培养液,?5000rpm离心10分钟,?去上清液。?

2.加?TE悬浮沉淀,?并加?10%?SDS,?50μl?20mg/m l(或1mg干粉)蛋白酶?K,?混匀,?37℃保温1小时。?

3.加?5mol/L?NaCl,?混匀。?

4.加?CTAB/NaCl溶液,?混匀,?65℃保温20分钟。?

5.用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,?5000rpm离心10分钟,?将上清液移至干净离心管。

6.?用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提,?取上清液移至干净管中。?

7、加?1/10?体积3mol/L?NaAc，及２.５?倍体积预冷（－２０℃）无水乙醇，混匀。－２０℃沉淀３０min。12000rpm15min，弃上清

8、加70%乙醇1ml，轻轻混匀，12000rpm15min，弃上清。

9、ＥＰ管放置于烘箱中烘干。

10、加３０ul TE或ddH2O溶解ＤＮＡ。

11、琼脂糖凝胶电泳检测

注意，实验室中一般用的的EP管，可根据自己需要按比例调节加样量。

DH-5α(pET-28a)的载体质粒也可根据同样方法提取。

1.3.1ＰＣＲ扩增

1.3.2实验目的

１、学习ＰＣＲ扩增的基本原理。

２、掌握ＰＣＲ技术的常规操作。

３、了解ＰＣＲ扩增的参数设计。

1.3.3实验原理

１、聚合酶链反应 (Polymerase chain reaction，PCR)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的ＤＮＡ为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异ＤＮＡ片段的过程。

２、ＰＣＲ反应体系

引物、dNTP、 Mg２＋、模板、 Taq DNA聚合酶， Buffer。

３、ＰＣＲ循环参数

① 9５℃ 5min

② 9５℃ 30s

③ 5２℃ 30s

④ 72℃ 30s

⑤ goto②２９times

⑥ 72℃ 10min

1.3.4器材

1，微量移液取样器，移液器吸头， PCR微量离心管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外凝胶成像系统

2，Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液， MgCl2，dNTP，引物，模板，ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液

3，引物：

1.3.5实验步骤

１、在 PCR 微量离心管中配制30ul反应体系。

dd water

10×PCR buffer（不含MgCl2）3ul

25mM MgCl2 2ul

10mmol/L dNTP 1ul

10μmol/L 引物1 1ul

10μmol/L 引物 2 1ul

模板 1ul

Taq酶