生化实验七 酮体的生成与测定

实验七酮体的生成

目的要求

1．在复习和掌握酮体生成和利用的理论知识基础上，学习酮体生成和测定的基本原理及方法。

2．进一步掌握滴定法的操作过程。

原理

在肝脏中脂肪酸经β-氧化生成乙酰辅酶A后可缩合成酮体，尤其在糖代谢异常使得草酰乙酸含量不足时，酮体生成增多；而肝脏不能氧化酮体，因此肝内生成的酮体必须经血液运输到肝外组织氧化利用。

本实验以丁酸作为底物，与肝组织糜一起保温，观察肝组织糜中酮体合成酶体系利用丁酸生成酮体的量。酮体包括乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮，本实验以测定丙酮含量反映酮体的生成量。在碱性条件下，碘可将丙酮氧化成碘仿，以硫代硫酸钠滴定剩余的碘，再与对照管比较计算出丙酮的生成量。

图1：酮体的生成示意图丙酮碘化过程如下：

一般认为反应历程分两步进行：

碘过量时，可继续碘化：

碱化后三碘取代的丙酮水解：

剩余的碘用硫代硫酸钠滴定：

操作方法

1．取新鲜猪肝，用预冷的生理盐水洗净血迹，并用滤纸吸干水分，准确称取2份肝组织各1.0g，分别剪碎成直径约1mm3小块的组织糜备用。

2．取2支大试管，按下表操作：

3．取两个三角瓶，分别各加入测定管滤液4.0ml；另取两个三角瓶，分别各加入对照管滤液4.0ml，然后依次加入0.1mol/L碘液5.0ml，10％氢氧化钠5.0ml，摇匀后室温静置10分钟，再加10％盐酸5.0ml后摇匀。

4．用0.025mol/L硫代硫酸钠溶液快速滴定，当溶液由褐色变为浅黄色

时加入0.5%淀粉3滴，用力振荡并继续滴定至蓝色消失为止。

5．计算：

丙酮（mg ）／100g 肝组织＝（A-B ）×

497.0×411×1

100

式中：A 为对照管滴定所用硫代硫酸钠溶液的平均毫升数；

B 为测定管滴定所用硫代硫酸钠溶液的平均毫升数；

4

97

.0为1ml 0.025mol/L 硫代硫酸钠相当的丙酮毫克数。 注 意 事 项

1．本实验以用新鲜动物肝组织为宜，标本夏日在冰箱可保存3日，冬天可稍长。

2．因为硫代硫酸钠的滴定必须在酸性或中性环境中进行，故滴定前需加入盐酸中和氢氧化钠。

3．注意正确掌握滴定终点，在接近滴定终点时应充分振荡三角瓶，滴定至蓝色消失即为终点。

4．淀粉宜用新鲜配制的，淀粉溶液不宜加入过早。 5．试管浸入水浴深度应高于反应液面为宜。

试 剂

1．乐氏（Locke ）溶液100ml ：称取NaCl 0.9g ，KCl 0.042g ，CaCl 2 0.024g ，Na 2CO 3 0.02g ，葡萄糖0.1g ，加水溶解后定容至100.0ml ；

2．1/15mol/L pH7.6磷酸盐缓冲液100ml ：0.691g 磷酸氢二钠水合物和0.738g 磷酸二氢钠水合物溶于100ml 水中；

3．0.5mol/L 丁酸溶液：称取4.4 mL 正丁酸，溶于0.1mol/LNaOH 溶液中，加水定容至100.0ml 。

4．15％三氯醋酸100ml （g/g ）：15g 三氯乙酸溶于75ml 纯水中； 5．10％氢氧化钠：30g 氢氧化钠溶于270ml 纯水中； 6．10％盐酸：82.2ml 浓盐酸溶于217.8ml 纯水中；

7．0.5%淀粉100ml （新鲜配制）：0.5g 淀粉溶于100ml 纯水中 8．0.1mol/L 碘液300ml ：称取I 2 3.75g 和KI 7.5g ，加水溶解并定容至

300.0ml。

9．0.025mol/L硫代硫酸钠溶液：称取6.25g硫代硫酸钠，溶于煮沸过并冷却的蒸馏水中（无CO2存在），添加硼砂3.8g或NaOH 0.8g（硫代硫酸钠溶液在pH9～10时最稳定），再用煮沸过并冷却的蒸馏水准确定容至1000.0ml，贮存于棕色瓶中。使用前要用KIO3进行标定。

10．生理盐水500ml：4.5g氯化钠溶于500ml纯水中。

所需仪器