酵母人工染色体
基因工程题库版--名词解释
各种题型确定题目重要题目候补题目不确定答案的题目试卷与题库重复题目名词解释同裂酶（同切点酶）：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。
同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们来源各异，识别的靶序列也各不相同,但切割后都能产生相同的黏性末端,特称为同尾酶。
测序酶：是经修饰过的T7噬菌体DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使得T7DNA聚合酶完全失去了3~-5~外切酶活性，只有5~-3~聚合酶活性，而且聚合能力很强，测序时常用此酶。
与klenow相比优点是：是双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。
限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基系列的核酸水解酶。
限制-修饰系统中的限制和修饰作用：限制-修饰系统中的限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用，在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制-修饰系统中的修饰作用。
5. 限制性片段长度多态性（RFLP）：当DNA序列的差异发生在限制性内切酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切酶酶解后，其片段长度的改变可以经过凝胶电泳区分，出现的这种DNA多态性称为限制性片段长度多态性。
6. 星号活性：限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定的条件下测定的。
当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。
（“非最适的”反应条件例如高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等。
)克服星号活性的方法：维持反应体系适当的离子强度、较低的温度或酶浓度，尽可能缩短反应时间或DNA 样品的重新处理等。
第四章 基因工程的质粒载体
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
细菌人工染色体的研究和应用
体 ｐＣＯ Ｓ Ｉ１以来 ， 来越 多的克 隆载 体相 继 涌现 ， 得 越 使 克隆载体 的 整体 结 构 和克 隆效 率 有 了很 大改 善 。基 于生物体 的许 多 重要 性 状 牵涉 到 复杂 的生 理生 化 反 应系列 ， 多基 因或基 因簇 的控 制 ， 受 与几 百 ～几 万 ｋ ｈ Ｄ Ａ 片段 相关 。另 外 ，复杂 基 因组 的物 理 作 图 和基 Ｎ 因的图位克 隆 也 涉 及 到 大 片段 Ｄ Ａ 的研 究 。 因此 ， Ｎ 提高载体 的容 纳量 ， 直是 克隆载体 的 重要 发展方 向 一
之 一 。 随 着 脉 冲 交 变 电 泳 技 术 （ｃｗ ｒ ，９４ ［ 的 发 Ｓｈ ａ ｓ１８ ） ｔ ２ ７ 展 以及 基 因组 研 究 的 １ 深 入 ， 插 入 大 片 段 Ｄ Ａ， ３益 可 Ｎ
能独立 、 稳定存 在和遗 传 的人工染 色体 等 多方 面的研 究取得 了迅 速 的发 展 。所谓 人工 染色 体 ， 指一 类能 是
自主 复 制 序 列 和 端 粒 子 连 接 在 一起 ， 建 成 了第 一 个 构
植 物 人 工 染 色 体 （ Ａ ，ｐａｔａ ｉｃ ｈ ｍ ｓｍ ， Ｐ Ｃ ｌ ｒｆ ｉ ｃｒ ｏｏ ｅ ｎ ｔ ａ ｏ ｉ ｌ
Ｊ ｎ ，１ ９ 的 构 建 也 在 进 行 中 。 表 １总 结 了 人 工 染 ｉｇ ９ ） ａ ９
（ 国科 学 院遗 传 研 究 所 ８ ２组 中 ０ 北京 １０ ０ ） ０ １ １
摘 要 细 菌人 工 染 色体 （ ａｔ ａ ａ ｉｃ ｈｏ ｏｏ ｅ Ｂ Ｃ 是 第二代 大片段 Ｄ Ａ 的克 隆载 体 系统 。 Ｂ ｃ ｒ ｌ ｒｆ ｉ ｃｒ ｓｍ ， Ａ ） ｅ ｔ ａ ｉ ｉ ｌ ｍ Ｎ 因其嵌 合 率低 ， 传稳 定性好 ， 遗 重组 Ｄ Ａ 容 易分 离和 制 备 ， Ｎ 转化 效 率 高等 ， 补 了 Ｙ Ｃ 的 不 足 ， 弥 Ａ 很 快 在基 因组研 究 中处 于 中心地 位 。近 年 来 ， 已有 多种 Ｂ Ｃ载 体 被 构 建 出来 ， 些 Ｂ Ｃ 载体 在 复 杂 Ａ 这 Ａ
载体介绍
pBR322—→插入在Ampr 中，基因型为Tetr 、Amps 、—— →在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培 养基可生长； 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。
这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该 基因活性丧失的现象叫插入失活。
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC）
YAC的特点： 1.只能在酵母细胞中扩增 2.克隆容量大，一般为200kb-500kb 3.构建原理，按染色体结构构建
染色体复制和遗传的三个基本组件：
1.自主复制序列（ARS） （autonomous replicating sequence） DNA复制起始点（ori） 2.着丝粒（centromere，cen） 3.端粒（telomeres，tel）
P1 噬菌体载体和 P1 人工染色体载体
P1 噬菌体 ：大肠杆菌的一种溶原性噬菌体。 P1 噬菌体载体 工作原理类似黏粒载体 外源片断70-100kb
P1 人工染色体载体 P1 噬菌体载体的改造，结合了P1 噬菌体载体和 BAC载体的优点。 克隆外源片断130-150kb
（详细介绍）质粒载体
什么是质粒？
1.“严紧型”复制控制的质粒(stringent plamid)：拷 贝数少（1-5个）； 2.“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：拷 贝数多（10-200个）。
质粒DNA的转移
1. 质粒的类型 据能否自我转移可分为:
接合型（conjugative plasmid)
非接合型（non-conjugative plasmid) 2. F质粒(fertility factor)
基因工程名词解释
基因工程名词解释1、基因工程：对不同的遗传物质在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需的基因在细胞中表达，产生人类所需的产物或新生物类型。
2、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后再转入另一个生物体（受体）内，按照人们的意愿稳定遗传并表达新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
3、基因xx：经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。
通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
（包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达。
从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
）4、限制性内切核酸酶：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。
5、修饰酶：体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节(covalentmodificationregulation)，这类酶称为修饰酶(prosessing enzyme)。
6、同裂酶：识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
（同序同切酶、同序异切酶、“同功多位”等）7、同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
8、位点偏爱：某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同切割效率。
9、星星活性：极端非标准反应条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
10、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。
11、DNA聚合酶：以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。
DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。
第八章酵母基因工程详解
二、酵母转化系统
酵母宿主系统 酵母载体系统 酵母系统标记基因 酵母转化方法 外源DNA在酵母宿主中的命运
1、酵母宿主系统
用作模式真核生物的酵母宿主菌 用作外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
用作模式真核生物的酵母宿主菌
GAL10 Promoter
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
3）pho4TS-PHO5启动子
低温诱导、磷酸盐抑制
A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录
酿酒酵母（Saccharomyces cereviasiae）：
*无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真核生物 *繁殖方式与原核类似，易于操作 *基因表达调控机理与高等真核类似
用作外源基因表达的酵母宿主菌
酿酒酵母： 最成熟的真核细胞表达系统，表达水平低，产物过度糖基化
甲醇酵母：可以利用甲醇作唯一碳源，表达水平高，产物糖基化更合理
B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子
C、pho4TS 温度敏感，35℃时失活，PHO5关闭
D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23℃）诱导表达
2、酿酒酵母分泌系统
酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源： 性结合因子：MF-α 酸性磷酸酯酶：PHO5 蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL
碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化
细胞：带壁的完整细胞 原理：通过碱金属离子（如Li+等）、PEG和热休克处理诱
双元细菌人工染色体基因组文库研究进展
２ ０ １ ３ 年第 ２ 期
农艺 杰伟 ｚ 陈亚娟 张少斌 魏建 华
（ 一 沈阳农业大学 ， 辽 宁沈 阳 １ １ ０ ８ ６ ６ ； 北京市农林科学院 ， 北京农业生物技术研究中心）
摘要 酵母 人 工 染 色体 （ Ｙ Ａ Ｃ ） 、 细 菌人 工染 色体 （ Ｂ Ａ Ｃ ） 是 伴 随着人 类基 因组计 划的 实施 而产 生的 ， 这些 大 片段 基 因克 隆栽 体的应 用推 动 了分 子生物 学、 遗传 学 等 学科 的快速发 展 。 以农杆 菌介 导 的直接 转 化植 物 为代表 的双 元细 菌人 工 染 色体 （ Ｂ Ｉ Ｂ Ａ Ｃ ） 栽体 的发展 ， 加 速植 物 基 因组 的研 究 ， 成为植 物 基 因组分 析 、 基 因功能鉴 定 、 染 色体 结构 与功 能关 系研 究 的重要 工 具 。 介 绍 了人 工 染 色体 文 库 的发展 史， 根 据 建库
（ Ｓ ｈ ｅ ｎ ｙ ａ ｎ ｇ Ａ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｓ ｈ ｅ ｎ ｙ ａ ｎ ｇ Ｌ ｉ ａ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ １ １ ０ ８ ６ ６ ； Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ Ａ ｇ ｒ ｏ ～ Ｂ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈＣ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ， Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ Ａ ｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ ｏ ｆ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ａ ｎ ｄ Ｆ ｏ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｙ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ） Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ Ｙ Ａ Ｃ， Ｂ Ａ Ｃ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｅ ｗ ｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｈ ｕ ｍ ａ ｎ ｇ ｅ ｎ ｏ ｍ ｅ ｐ ｒ ｏ ｊ ｅ ｃ ｔ ａ ｐ ｐ ｅ ａ ｒ ｉ ｎ ｇ ． Ｔ ｈ ｅ ｓ ｅ ｌ ａ ｒ ｇ ｅ ｆ ｒ ａ ｇ ｍ ｅ ｎ ｔ ｇ ｅ ｎ ｅ ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ 印ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ
基因工程生物化学
逆转录酶为依赖 RNA的 DNA聚合酶，具有 5’ 3’
2
聚合酶活性外，以 RNA为模板合成 DNA。
3
逆转录酶还具有核糖核酸酶H (RNase H) 活性，可
4
从 5’ 末端或 3’ 末端降解RNA:DNA杂合链中的
5
RNA。
6
依赖 DNA的 DNA聚合酶
7
逆转录酶无 3’ 5’ 外切酶活性。
8
禽类逆转录酶和鼠类逆转录酶的比较
以 mRNA为模板合成第一条 cDNA链，所用的引物包括 Oligo (dT)12-18 特定序列的寡核苷物 克隆特定的 cDNA：用特定序列的寡核苷酸引物 RT-PCR：用特定序列的寡核苷酸引物 制备 cDNA 探针：用特定序列的寡核苷酸引物或 随机序列的寡核苷酸引物
A
C
C
C
5'
DNA连接酶
基因工程 (Genetic engineering)
(Central dogma)
基因 (Gene) 能编码一条多肽链并具有一定长度的 DNA 分子。 基因组 (Genome) 一种生物全部染色体的遗传物质的总和，以全长 DNA 的碱基对 (bp) 数目表示。
5’ 凸端 (5’ overhang) 粘性末端
3’ 凸端 (3’ overhang) 粘性末端
CCCGGG GGGCCC
5’ - 3’ -
-3’ -5’
5’ - 3’ -
- OH 3’ - P 5’
CCC GGG
GGG CCC
5’ P - 3’ OH-
-3’ -5’
SmaI
-3’ -5’
细菌基因组 大肠杆菌： 4 x 106 bp
人类基因组：3 x 109 bp
酵母基因工程
遗传表型 抗G418 抗氯霉素 抗氨甲喋呤和磺胺 耐受铜离子 耐受高浓度蔗糖 抗硫酰脲除草剂
• 利用质粒上的营养成分生物合成标记基因 互补相应的营养缺陷型受体菌，可以在不 添加任何筛选试剂的条件下维持转化子中 质粒的存在，但这种筛选互补模式并不稳 定，而且对选择培养基的要求也很高，在 大规模传统发酵中普遍使用的复合培养基 一般不能用作这种转化菌的培养。
如果说E.coli是外源基因最成熟的 原核生物表达系统，Yeast则是最成熟 的真核生物表达系统。
酵母菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传 操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为 安全的基因工程受体系统。
YAC质粒：
在YCp中引入TEL； TEL：端粒，酵母染色体 末端序列，利于线性 DNA末端稳定；
稳 定 性 随 着 插 入 DNA 一种载体。这种载体 必须在整合到酵母染色体上才能使其上所包含 的基因得到稳定表达。
（二）酵母菌的宿主系统
用作模式真核生物的酵母宿主菌 用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
1、用作模式真核生物的酵母宿主菌 酿酒酵母(Saccharomyces cereviasiae)：
单细胞、真核生物； 繁殖方式与原核类似，易于操作； 基因表达调控机理与高等真核类似。
如：leu1/leu2、trp1、his3/his4、ura3
选择压力：不完全培养基 如：无氨基酵母氮源（YNB）、无机盐培养基
显性标记基因
显性标记基因编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白。
基因工程
二 DNA或RNA浓度、纯度和相对分子质量的测定
常用的方法有紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳法。
（一）紫外分光光度计法测定DNA、RNA的浓度和纯度
分子量在1-200kb之间 。
生命科学学院
一、 质粒载体
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：
超螺旋DNA最快、线形DNA次之、开环DNA最慢。
OC
SC
Lห้องสมุดไป่ตู้
生命科学学院
一、质粒载体
质粒的不相容性(incompatibility,又称质粒的不亲和性)
两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。
生命科学学院
四、人工染色体及其应用
(一)酵母人工染色体
酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)是一类酵母穿梭 载体。
YAC具有自主复制序列、克隆位点 以及可在细菌和酵母菌中选择的标记 基因。可以接受350-400kb的外源DNA 片段。
生命科学学院
一、质粒表达载体
二、Klenow片段 （一）基本性质 大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N 端三分之二的大肽段，即Klenow片段。
Klenow片段仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5` 的核酸外切酶活性，但失去了5`→ 3`的核酸外切酶活性。
生命科学学院
载体的概念
载体（vector) • 是由在细胞中能够自主复制的DNA分子构成的一 种遗传成分；基因工程中，携带目的基因进入宿 主细胞进行扩增和表达的工具称为载体。 目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持 高效表达，在很大程度上决定于载体 。
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2009-08-04 22:22人类人工染色体HAC人类人工染色体研究进展人类人工染色体研究进展摘要：本文主要介绍了人类人工染色体（HAC）的结构、构建及其在基因治疗、转基因动物等方面的应用，对HAC的最新研究进展作了简要介绍，同时总结了当前HAC研究面临的问题。
关键词：HAC 基因治疗转基因动物酵母人工染色体（YAC）[1,2]、细菌人工染色体(BAC)等人工染色体相继构建成功以后，1997年，科学家成功构建了第一条人类人工染色体（Human Artificial Chromosome，HAC）[3]。
与YAC、BAC等相比，HAC不整合到细胞的基因组中,而是以一个独立的功能性染色体单位而存在，可以同细胞中正常的染色体一样复制、分裂、稳定遗传，并且不会对受体产生毒害，这使得HAC有可能解决基因治疗中的一些难题[3,4]。
HAC具有容量大、不容易导致基因沉默、可随细胞周期表达或关闭等优点，开创了人工染色体研究的新纪元，其研究受到广泛关注。
1. HAC的基本结构HAC包含构成人工染色体的所有基本结构，即端粒（TEL）、复制起点（Origin）及着丝粒（CEN）。
1.1 端粒端粒是人工染色体中了解得比较清楚的一个基本功能单位。
端粒是DNA-蛋白质复合物，能阻止染色体末端相互连接，并防止染色体复制时DNA丢失[5]。
端粒DNA由长5-20kb的(TTAGGG)n重复的排列串组成；将长度超过1 kb的(TTAGGG)n重复序列导入体外培养的人类细胞后,可在70%的转染细胞中发挥端粒功能[6]。
Farr将克隆的端粒DNA导入人-鼠杂种细胞，证明端粒DNA可以形成具有完整功能的端粒[7 ]。
1.2 复制起点人基因组DNA中约每50-300kb为一个复制子，每个复制子有一个独立的复制起始点以启动DNA合成[8]。
一些基因位点的复制起始点已被定位，如β-球蛋白基因、二氢叶酸还原酶基因等，但将这些位点的DNA片段转入细胞后就失去了复制起始点的功能。
现在仍不知一个复制起始点到底需要多大，因为当DNA片段太短时则不具有复制起始点的功能[8,9]。
也不知道构造哺乳动物人工染色体时是否要求特定的复制起点序列。
1.3 着丝粒目前还不知道着丝粒的精确的DNA序列，具有着丝粒功能的DNA序列又难以在体外进行操作[10]，因此，着丝粒结构成为当前HAC研究中的一大难点和热点。
人类染色体上具具有一段171bp的α-卫星DNA重复序列[11]，是人类着丝粒的主要组成元件，该序列单体可以不同方式排列成几Mb的片段[12]。
由于人类染色体均含有一定数量的α-卫星DNA[11]，而且大多数人类染色体α-卫星DNA均具有着丝粒功能[13],因此可以认为，着丝粒功能是以这种重复序列为结构基础的。
用含70 kb 21号染色体α-卫星DNA序列的DNA或1个85 kb含X 染色体来源的α-卫星DNA序列的结构进行转染，可以有效地形成HACs，这进一步证实了α-卫星DNA在构造人工染色体中的重要作用。
2. HAC的构建2.1 天然染色体改造法构建HAC构建HAC的策略之一是以天然染色体的断裂片段为基础，构建新的HAC，如构建△HACs[14]。
通过低剂量辐射、端粒定位染色体截断技术、外源性DNA片段定点插入后扩增等都可以获得天然染色体的断裂片段。
这种方法通过含有端粒片段和选择标记、有时也通过含有靶染色体同源片段的打靶载体将特定染色体连续截为更小的微型染色体，所获得的微型染色体是自由的，也是可以正常分离的[15]。
图1显示△HAC的构建方法及外源基因导入方法。
△HACs是通过对人21号染色体的长臂（q arm）和短臂（p arm）进行部分序列切除而构建成[14]，通过cre-重组酶介导的Cre/loxP系统插入待转移的目的基因。
图 1 The △HAC system[14]. (a) Generation of the 21DpqHAC vector. (b) Loading of transgene to the 21△pqHAC vector.2.2 组装法构建HAC这种方法可以称为组装法或从下到上法，即通过将已成功克隆的着丝粒和端粒DNA导入人类培养细胞来形成从头构造的HACs，所获HACs的长度为1-10 Mb。
利用此方法Harrington 等在HT1080细胞中得到了第一个HAC[3]. 他们将大于1 Mb的人17号染色体的α-卫星DNA、人端粒DNA、人基因组DNA随机片段用脂质体共转染HT1080细胞,。
经过重组，那些同时含有着丝粒、端粒、复制起点且按照正常染色体结构顺序的重组连接产物以染色体的形式稳定保存下来，而那些不完整或未按照正常顺序连接的产物因其不能稳定地进行有丝分裂而丢失、降解。
由此通过有丝分裂而自然筛选出HAC[16,17]。
其他研究者利用HT1080细胞导入含有人α-卫星序列结构的环状YAC、PAC或BAC结构和端粒序列，这些细胞中产生了从头构造的环状人工染色体[18]。
3. HAC载体表达体系目前，目的基因的插入主要基于如下几种策略:(1)共转染；(2)应用Cre/loxP和FLP-FRT系统进行位点特异性重组；(3)染色体克隆技术[14,19,20]。
Kuroiwa等[20]将Cre/LoxP介导的位点特异性重组技术同端粒定位染色体截断技术相结合,发展了染色体克隆技术(图2),使精确地插入特定染色体区段成为可能。
Auriche等将囊性纤维化跨膜转导调节因子基因(CFTR)全序列及其上游调控序列插入HAC中，成功地检测到了该基因的转录和翻译产物[21]。
Ikeno 等[22]将携带三磷酸鸟苷酸环化水解酶基因(GCH1)全序列(包括编码序列和调控区)的BAC,与包含α-卫星DNA序列的BAC共转染，进入人类成纤维细胞内，筛选出携带GCH1基因的HAC克隆，分析结果表明，这些HAC表现出很高的有丝分裂稳定性，且GCH1水平明显提高，并对IFN-γ的刺激高度敏感。
图2 染色体克隆技术4. HAC的应用4.1 基因治疗过去的基因治疗方案中，所用载体在转染宿主细胞后,目的基因可能会出现不表达，或通过非同源重组而插入宿主细胞染色体，造成宿主细胞的癌化等结果，这严重影响了基因治疗的效果[23]。
而HACs 作为载体则可以避免对宿主细胞染色体的负面影响，并由于其具有携带大片段基因的优点，可以将目的基因调控序列一并导入细胞内，从而实现目的基因时空特异性的表达，大大提高了基因治疗的有效性和安全性,显示出了良好的应用前景。
人类人工染色体可以作为表达载体，通过在人类细胞中表达目的蛋白以修补有缺陷的基因，从而可以达到治疗由基因缺陷所致疾病的目的[24]。
有研究表明,携带有全长40 kb、含调控区域、编码次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT1)基因的HACs,可以补偿HPRT缺陷型HT1080细胞的代谢缺陷[25]。
4.2 构建转基因动物生产蛋白质Kuroiwa 等[26]应用同源位点特异性Cre2/LoxP 重组，在鸡DT40 细胞中将10Mb 含Ig 位点的人22 号染色体片段，连接到截断的人14 号染色体上,随后将其转入小鼠胚胎干细胞,获得了可表达人Ig 的嵌合体小鼠。
这预示着可以把利用HAC技术构建转基因动物，使动物成为生产某些对人类有益的生物大分子（如抗体等）的生物反应器。
5. 目前研究中存在的问题尽管目前已经成功构建一些HAC系统，并且研究显示其具有极大的应用潜能，但也还有许多问题需要解决。
一是关于HAC结构的问题。
不同类型的HAC的成功构建为研究人染色体的结构和功能带来了新的视野和新的观点，但究竟哪一种更适合作为基因表达的载体还没能下定论。
各种不同方法构建的HAC各有其优劣，需要更多的研究以明确定其应用的价值。
二是HAC标准化的问题。
目前有关HAC的标准还没用比较具体的标准，只提出了HAC标准化的一些基本条件，Kuroiwa等[27]对此进行了深入的研究，利用同一载体SC20制作了5种不同的HAC；Katoh M等也在此方面做了大量工作[28]。
三是HAC的转移方法问题。
目前较成功的转移方法有显微注射[27]、脂质体介导[28]和微细胞融合(microcell fusion)或微细胞介导的染色体转移( microcell-mediated chromosome transfer, MC-MT)[29~31]等,由于HAC较大，用前两种方法易于导致HAC损伤，所以现在常用微细胞融合法。
微细胞融合法转移HAC的效率比较低[14]。
目前针对HAC还没用既高效又快速的转移方法，这是限制其应用的一个问题，是科学家需要努力解决的挑战。
6. 结语从第一个HAC构建成功至今虽然只有短短十年，还有很多问题需要解决，但HAC已表现出极重要的应用潜能。
随着HAC的理论和技术不断完善，HAC必定在基因治疗等领域来发挥巨大的作用。
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