离子排斥色谱法分析有机酸的新进展

近些年发展起来的离子排斥色谱法（Ｉｏｎ－Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＩＥＣ）是分析各种有机酸极为有效的方 法。离子排斥色谱法能够应用的主要原因是：①极适 合于含水基体； ②对强亲水性和强挥发性的物质不会 造成损失； ③只需简单的样品前处理，不需柱前衍生 作用； ④有机酸的分析几乎不受无机阴离子的干扰； ⑤可联合其它的色谱分析方法，实现二维分离。
Ｔａｎａｋａ 等人［２７，２８］提出一种 ＩＥＣ 新方法——“反离 子排斥色谱法（Ｖａｃａｎｃｙ Ｉｏｎ－Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）”。 将待测酸作流动相、水作试样，分别考察了脂肪羧酸 在强酸阳离子交换树脂柱（ＴＳＫｇｅｌ ＳＣＸ）和弱酸阳离子交 换树脂柱（ＴＳＫｇｅｌ ＯＡｐａｋ－Ａ）上的分离情况。发现在 ＴＳＫｇｅｌ ＯＡｐａｋ－Ａ 柱上分析脂肪羧酸时，反 ＩＥＣ法的灵 敏度比硫酸作淋洗液的 ＩＥＣ 法高 ４～１０ 倍，比苯甲酸 作淋洗液的 ＩＥＣ 法高 ２～５ 倍，并得到了好的峰形。作 为应用，Ｈｅｌａｌｅｈ 等人［２９］用添加硫酸的样品溶液作流动 相、纯水作试样，在弱酸阳离子交换树脂柱（ＴＳＫｇｅｌ ＯＡｐａｋ－Ａ）上用反ＩＥＣ法测定了经氯消毒后的饮用水中 的副产物——卤代乙酸（一氯、二氯和三氯乙酸）和乙 酸，得到高灵敏度的电导检测，良好的峰形，及非常 有效的分离。传统 ＩＥＣ 法分析芳香羧酸，一般是依靠 溶质与树脂之间的疏水作用，由于芳香羧酸的疏水性 较强，所以用传统ＩＥＣ法分析芳香羧酸是相当困难的。 Ｈｅｌａｌｅｈ 等人［３０］用反 ＩＥＣ 法，将样品溶液作流动相、含 甲醇的水溶液作试样，在弱酸阳离子交换树脂柱 （ＴＳＫｇｅｌ ＯＡｐａｋ－Ａ）上，分离了硫酸、萘四羧酸、邻苯二 甲酸和苯甲酸，结果令人满意。
生命科学仪器 ２００５ 第 ３ 卷 ／ 第 ３ 期
研究论文
离子排斥色谱法分析有机酸的新进展
原小寓 １，吴伟 ２，于泓 １
（１． 哈尔滨师范大学化学系， 哈尔滨 １５００２５；２． 黑龙江大学化学化工与材料学院，哈尔滨 １５００８０）
摘要 离子排斥色谱法（ＩＥＣ）是分析有机酸的有效方法。对 ＩＥＣ 法分析有机酸的原理及其近年在固定相、淋洗液、检测 器和应用方面的进展作了系统综述，并探讨了其发展方向。 关键词 离子排斥色谱法，有机酸，综述
用无机酸（盐酸、硫酸、硝酸、硼酸等）的稀溶液 作淋洗液，可采用抑制型电导检测、非抑制型电导检 测、紫外光度检测等。田鹏等人［１８］选用盐酸作淋洗 液，四丁基氢氧化铵（ＴＢＡＯＨ）为再生液，对 １２ 种有 机酸在阴离子排斥色谱柱上的保留行为进行了系统研 究，找出了Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＩＣＥ－ＡＳ１柱分离有机酸的规律。 为改善分离，可在无机酸淋洗液中加入有机溶剂。 Ｔａｎａｋａ 等人［１９］在聚甲基丙烯酸酯阳离子交换树脂上 （ＴＳＫｇｅｌ ＯＡｐａｋ－Ａ），用稀硫酸作淋洗液完成了对不同 羧酸的分离，没有显著增大的淋洗液背景电导，获得 比用苯甲酸淋洗液更大的电导检测灵敏度。当向淋洗 液中添加甲醇后，疏水性羧酸的保留时间明显缩短 了。该法可完成对一元、二元羧酸的高质量分析。 Ｙａｎｇ 等人［２０］以 ０．１％硫酸－ 乙腈溶液（ｖ／ｖ， ５／９５）为淋 洗液，用Ｄｉｏｎｅｘ ＩｏｎＰａｃ ＩＣＥ－ＡＳ１ 柱，２５０ｎｍＵＶ 检测， 分离了一些药物活性成分中的草酸、草氨酸、草酰胺 等杂质。
３ 淋洗液
离子排斥色谱法的主要分离机理是 Ｄｏｎｎａｎ 排斥。 有机酸在水溶液中存在离解平衡，离解程度受ｐＨ值控 制。提高 Ｈ＋ 浓度可抑制有机酸的离解，从而增加有 机酸在固定相上的保留。淋洗液的主要作用是提供 Ｈ＋，原则上，凡能提供 Ｈ＋ 的溶液均可作为淋洗液。
ＩＥＣ 法分析有机酸的淋洗液主要有水、无机酸和 有机酸三大类。淋洗液的选择与检测方式、色谱柱的 特性等有关。
用水作淋洗液最大优点是背景电导低，但淋洗强 度弱。可采用非抑制型电导检测或库伦检测。但对ｐＫａ 值相近的有机酸，用水洗脱分离有困难，可向水淋洗 液中加入有机溶剂，以减少有机酸疏水端与固定相间 的作用，使酸的保留有所差别，或添加强酸以降低ｐＨ 值。孙桂芳［１７］以 ４％丁醇水溶液作淋洗液，直接电导检 测，很好地分析了环境样品中的 Ｃ２～Ｃ５ 脂肪酸。
ＶＲ ＝ Ｖｍ ＋ Ｋｄ ＶＳ 式中：ＶＲ ——溶质的保留体积，Ｖｍ——柱内树脂 颗粒间的淋洗液体积，ＶＳ——柱内树脂微孔内吸留的 淋洗液体积，Ｋｄ ——分配系数，Ｋｄ 值与溶质的电离度 及其进入树脂内的扩散能力有关。 在 ＩＥＣ 分离模式中，有机酸与固定相间的相互作 用除上面所述的Ｄｏｎｎａｎ排斥外，还包括疏水性吸附作 用、极性作用（如氢键）、π－π电子作用及大小排斥作 用等［６］。其中，树脂功能基与溶质的羟基或溶质未离解 的羧基之间产生氢键，而聚合树脂的芳香基能够与芳 香酸和不饱和酸产生强的π－π电子作用。 有机酸的保留主要受酸离解程度（ｐＫａ值）影响［７，８］， 同时也受酸在固定相上吸附分配的影响［８］。容易离解 的有机酸在柱上保留弱，保留时间短，先流出；不易 离解的有机酸，在柱上保留时间长，后流出。各种有 机酸由于离解度、荷电性、亲水性（疏水性）等的差异， 引起在柱上保留时间的差异而得到分离。
用作淋洗液的有机酸主要有烷基磺酸、总体氟化 的羧酸等，近几年用芳香羧酸作淋洗液也较多。这类
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淋洗液本底电导低，可采用非抑制型电导检测或抑制 型电导检测。Ｃｈｅｎ 等人［２１］用 ２，６－ 吡啶二羧酸（ＰＤＣＡ） 作淋洗液，间接 ＵＶ 检测、非抑制型电导检测 ＩＥＣ 法 分析了 ８ 种羧酸。由于 ＰＤＣＡ 高摩尔吸收率和低背景 电导，使两种方法都有高的灵敏度，成为测定环境样 品的有效方法。Ｔａｎａｋａ等人［２２］用添加β－环式糊精（β－ ＣＤ）的苯甲酸溶液作淋洗液，分离不同ｐＫａ值和疏水性 的脂肪羧酸，随着淋洗液中β －ＣＤ 浓度的增大，羧酸 的保留时间缩短，淋洗液背景电导降低，产生高灵敏 度的电导检测。Ａｂｅ等人［２３，２４］用不同芳香酸水溶液作淋 洗液，电导检测 ＩＥＣ 法，在 ＴＳＫｇｅｌ ＯＡｐａｋ－Ａ 树脂柱上， 分别分离了含不同烃基的全氟烃基磺酸、全氟烃基亚 磺酸和多氟羧酸。为改善分离， 还在淋洗液中加入甲 醇、２，２，２－ 三氟乙醇等改良剂。除二元多氟羧酸的峰 分离不完全外，其余皆可很好地分离。Ｏｈｔａ等人［２５，２６］为 扩大ＴＳＫｇｅｌ ＳＣＸ柱的使用范围，用Ｃ７脂肪羧酸作淋洗 液，电导检测 ＩＥＣ 法同时分析了 Ｃ１～Ｃ６ 脂肪羧酸，发 现 ５－ 甲基己酸与其它 Ｃ７ 脂肪羧酸相比，最适合在 ＴＳＫｇｅｌ ＳＣＸ 柱上分离上述羧酸；用 Ｃ６ 脂肪羧酸作淋洗 液，电导检测 ＩＥＣ 法分析了 Ｃ１～Ｃ５ 脂肪羧酸，发现 １ｍｍｏｌ／Ｌ 异己酸（ｐＨ ４．０）与其它Ｃ６ 脂肪羧酸相比，最适 合在 ＴＳＫｇｅｌ ＳＣＸ 柱上同时分离上述羧酸，检测灵敏度 相对较高。
一些研究者还对 ＩＥＣ 固定相作了许多研究和改 进。Ｏｈｔａ 等人［１２，１３，１４］用涂敷铝、锆的方法改进硅胶，并 把它们作为 ＩＥＣ 法分析不同羧酸的固定相，以扩大该 铝吸附硅胶（Ａｌ－Ｓｉｌｉｃａ）、锆吸附硅胶（Ｚｒ－Ｓｉｌｉｃａ）的应用。 在酸性淋洗液条件下，Ａｌ－Ｓｉｌｉｃａ 柱 ２５ｍｉｎ 内即可很好 地完成对 Ｃ１～Ｃ８脂肪羧酸和疏水性芳香酸的分离；在 酒石酸作淋洗液，ＵＶ－ 光度检测 ＩＥＣ 法中，Ｚｒ－Ｓｉｌｉｃａ （２０ｍｇ／ｇ）柱（２５０ × ４．６ ｍｍ Ｉ．Ｄ．），２０ｍｉｎ 内即可很好地 分离一元、二元、三元和四元苯甲酸及苯酚；以含庚 醇的均苯四甲酸作淋洗液，抑制电导检测 ＩＥＣ 法中， Ｚｒ－Ｓｉｌｉｃａ（１０ｍｇ／ｇ）柱（２５０ × ４．６ ｍｍ Ｉ．Ｄ．），２５ｍｉｎ 内即 可很好地分离 Ｃ１～Ｃ８脂肪羧酸。一些研究者尝试用未 功能基化的树脂分离有机酸。Ｌｉ 等人［１５］用未功能基化 的高交联度 ＰＳ－ＤＶＢ 树脂作液相色谱法分析不同羧 酸、胺类的固定相，该法仅靠ＰＳ－ＤＶＢ树脂与羧酸、胺 类之间的疏水性作用即可较好地进行分离，但由于疏 水性作用较强，淋洗液中需加入大量有机溶剂。对于
目前，ＩＥＣ法是分析各种有机酸公认有效的方法。 以下对 ＩＥＣ 法分析有机酸的原理及其在固定相、淋洗 液、检测器等方面的进展作一综述。
原理发展而来的［５］。ＩＥＣ的分离柱填料一般是有一定交 联度的（８％）、总体磺化的Ｈ＋ 型高容量阳离子交换树 脂。树脂的电荷密度较大，导致在树脂颗粒间隙的液 体和树脂微孔内吸留的液体间形成一个“半透膜”。溶 质阴离子（如 Ｃｌ－）由于受 Ｄｏｎｎａｎ 排斥，不能进入树脂微 孔内，因此不被保留，而非离子型的中性分子，如有 机酸、醇类等，则不受Ｄｏｎｎａｎ排斥的影响，可通过“半 透膜”进入树脂的微孔内，有保留作用。溶质保留体 积表示如下：
有机酸是有机物中很重要的一部分。由于有机酸 的定性与定量分析在化学工业、环境保护、食品工业、 农业科学和生物化学等领域具有重要意义，因而吸引 了许多分析化学工作者对其进行了长期的研究。
目前，用于分析有机酸的方法有很多，如滴定法、 分光光度法、气相色谱法、荧光法、薄层色谱法、酶 法等。滴定法［１］一般只用于测定样品中酸的总量，方法 的灵敏度低，通常用作常量分析；气相色谱法［２］常因有 机酸的沸点高，不易气化而需要对其衍生再进行测定， 方法繁琐，难以分析分子量大的有机酸；分光光度法 ［３，４］一般要对样品进行预分离、衍生化等前处理，能同 时分析的酸种类较少。由于有机酸的强极性及部分有 机酸的不稳定性，使用上述这些方法，一般都要进行 预分离、衍生化等繁琐的处理，而且能同时达到分离 的有机酸种类较少，方法的灵敏度和选择性亦不很令 人满意。
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阳离子交换树脂。阳离子交换树脂又分为强酸型、弱 酸型。强酸型阳离子交换柱通常指磺酸型阳离子交换 柱，弱酸型阳离子交换柱通常指羧酸型阳离子交换柱。 Ｎｇ等人［９］在三种不同强酸型阳离子交换剂固定相上（磺 化的聚苯乙烯 － 二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸酯、硅基）， 使用 １４ 种不同 ｐＨ 值的淋洗液，得到了 １３种选定羧酸 （包括一元、二元脂肪酸和芳香酸）的保留数据。结果显 示，疏水性吸附作用对 ＩＥＣ 法分析含三个及三个以上 碳原子的一元脂肪酸和芳香酸起主要作用。聚甲基丙 烯酸酯交换剂疏水性吸附作用最大，硅基交换剂最小。 Ｉｔｏ 等人［１０］用聚甲基丙烯酸酯弱酸型阳离子交换树脂 （ＴＳＫｇｅｌ ＯＡｐａｋ－Ａ 或 ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＩＣ－Ａ／Ｃ）、弱酸淋洗 液（苯甲酸）和电导检测的 ＩＥＣ 法测定了经厌氧消化的 工艺用水中 ７ 种脂肪羧酸。测定这些生物学上重要的 羧酸，作为评价和控制这个过程的一种方法是必需的。 Ｏｈｔａ 等人［１１］用不同亲水性的强酸型、弱酸型阳离子交 换树脂（磺化硅胶：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－２ＳＷ；磺化聚甲基丙烯 酸酯树脂：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－５ＰＷ；羧化硅胶：ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ－ ２ＳＷ；羧化聚甲基丙烯酸酯树脂：ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ－５ＰＷ 和 ＴＳＫｇｅｌ ＯＡ－Ｐａｋ Ａ）作固定相，稀硫酸作淋洗液，分别 完成了对 Ｃ１～Ｃ７脂肪酸和一些芳香酸的分离。结果发 现，硅基阳离子交换树脂（ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－２ＳＷ 和 ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ－２ＳＷ）很适合分离这些芳香酸；聚甲基丙烯酸酯阳 离子交换树脂（ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－５ＰＷ， ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ－５ＰＷ 和 ＴＳＫｇｅｌ ＯＡ－Ｐａｋ Ａ）是分离 Ｃ１～Ｃ７ 脂肪酸非常好的固定 相。