实验溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定概要
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实验1-3 溶菌酶的提取分离及鉴定 （酶活力、纯度及分子量测定）
1
实验内容
1. 溶菌酶的粗提取 2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定 3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定
2
背景知识
溶菌酶（lysozyme）：胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质 聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水 解致病菌中黏多糖的碱性酶。 生物学效应：主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰 氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可 溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。该酶活 性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+以及N-乙酰葡萄糖胺所抑 制，能被Mg2+，Ca2+、NaCl所激活
6
粗纯化（ 提取）目标：
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。 注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活， 一般采用低温下（0~10℃）操作。
提取原则
a. 相似相溶。
b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
7
离心分离 （一）基本原理
1. 离心力
Fc = m ac ＝ m r ω2 ＝ m r （2 N/60）2 N为离心机每分钟转数 （r/min ）；
3
4
溶菌酶理化性质：相对分子质量14700 Da，由 129个氨基酸残基构，pI:~10.8，最适温度为 50℃，最适pH为6～7左右。280nm的消光系数 为13.0
5
背景知识： 酶的提取、分离纯化 初步纯化（rough fractionation） （提取）：把酶从生 物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可 能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。 高度纯化（fine fractionation） （精纯化）：除去与产 物性质相似的杂质。 纯化方案评价：酶活力、蛋白浓度、纯度
常温，注意样品热变性和离心 管平衡
冷冻（防止温度升高）， 离心管的精确平衡
冷冻＋真空系统（减少空气阻 力和摩擦）， 离心管的精确平衡
10
离心的形式
角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。
角式由低速到超速均有。
11
角式离心机和离心头（转子）
角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作 注意稳、盖、旋紧。
CH2CH3
载 体
-O-CH2CH2N-H Cl-
Diethylaminoethyl (DEAE)
CH2CH3
阴离子交换剂
(可吸附带负电的蛋白质)
阳离子交换剂
(可吸附带正电的蛋白质) 22
两种离子交换剂
阴离子交换剂：
常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基
DEAE －C2H4N+(C2H5)2H
16
Principles of Operation for Chromatography Techniques
Gel
Ion
百度文库
Filtration Exchange
Hydrophobic Affinity Reversed
Interaction
Phase
17
实验二、溶菌酶的分离纯化及酶活力 、蛋白浓度测定
r平均=1/2（r大+r小）cm
8
通常：
•低速离心以每分钟的转数表示，如： 4000r/min。 •高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表 示，如：65000g。
两者可换算或查测算图。
9
离心机的种类
名称
转速(r/min)
注意事项
低速离心机 高速离心机 超速离心机
6000 6000〜 25000 >25000
12
离心管
材质：玻璃， 塑料
强度：和离 心速度相配
大小：和转 子配套
高速超速管 要加盖
13
离心机操作
平衡、定温、定速、定时。
14
实验一、 溶菌酶的粗提取——略
15
酶精纯化常用技术
膜分离技术 柱层析技术
蛋白质结晶
透析
超滤
凝胶过滤（分子筛/排阻）层析 离子交换层析 疏水层析 吸附层析 亲和层析 反相层析
QAE
－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3
阳离子交换剂：
常用羧甲基 CM
磺丙基
SP
—CH2COO－ —C3H6SO3－
23
化学原料合成 ： sephadex sepharose 载体
天然材料制成： cellulose
如：DEAE-Sepharose， CM-Sepharose
19
离子交换层析
（ion exchange chromatography，IEC）
20
1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。
2.离子交换填料：
离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。
纤维素
琼脂糖 —O—CH2—CO—ON- a+ 葡聚糖
载体 电荷基团
反离子
21
离子交换剂
--带有电荷基团的不溶性载体
目的： 1. 掌握离子交换层析原理及层析操作所需的必须原 件。 2. 掌握层析柱填装方法及层析填料的保存 3. 掌握比色法测定溶菌酶的浓度与酶活
18
原理： 根据溶菌酶 pI 10.8，pH 8.0 PBS 中携带？电，与阴/阳
离子层析填料可结合，通过吸附后，提高pH或离子强度将 溶菌酶与其他蛋白进行分离达到纯化目的。 溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的酶解作用导致细菌完整性 破坏，OD600值会下降，通过单位时间内（每分钟） OD600值的下降评价酶活性。 溶菌酶的活力单位（U）：在室温，pH8.0的条件下， OD600每分钟降低0.001为1个活力单位。 280nm的消光系数为13.0，根据 A=ECL 可粗略测定溶菌酶 浓度，用于酶比活的评价。
Fc通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表 示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少 倍。一般用g（或数字g）表示。
RCF = m r （2 N/60）2 /mg= 1.12 10-5 N2 r
此公式描述了相对离心力与转速之间的关系
旋转半径用r平均代替
24
实验设计原理
利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电荷 不同，因而与离子交换剂有不同吸附力而分 离。
溶菌酶pI:~10.8
pI < 8.0 蛋白质带负电 pI > 8.0 蛋白质带正电
pH8.0
25
2. 阴离子交换剂分离蛋白质的过程
Cl-ClC- l- ClCl-
ClC- lC- lClC- l-ClC- l-Cl-
1
实验内容
1. 溶菌酶的粗提取 2. 溶菌酶的分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定 3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定
2
背景知识
溶菌酶（lysozyme）：胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质 聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水 解致病菌中黏多糖的碱性酶。 生物学效应：主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰 氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可 溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。该酶活 性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+以及N-乙酰葡萄糖胺所抑 制，能被Mg2+，Ca2+、NaCl所激活
6
粗纯化（ 提取）目标：
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。 注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活， 一般采用低温下（0~10℃）操作。
提取原则
a. 相似相溶。
b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
7
离心分离 （一）基本原理
1. 离心力
Fc = m ac ＝ m r ω2 ＝ m r （2 N/60）2 N为离心机每分钟转数 （r/min ）；
3
4
溶菌酶理化性质：相对分子质量14700 Da，由 129个氨基酸残基构，pI:~10.8，最适温度为 50℃，最适pH为6～7左右。280nm的消光系数 为13.0
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背景知识： 酶的提取、分离纯化 初步纯化（rough fractionation） （提取）：把酶从生 物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可 能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。 高度纯化（fine fractionation） （精纯化）：除去与产 物性质相似的杂质。 纯化方案评价：酶活力、蛋白浓度、纯度
常温，注意样品热变性和离心 管平衡
冷冻（防止温度升高）， 离心管的精确平衡
冷冻＋真空系统（减少空气阻 力和摩擦）， 离心管的精确平衡
10
离心的形式
角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。
角式由低速到超速均有。
11
角式离心机和离心头（转子）
角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作 注意稳、盖、旋紧。
CH2CH3
载 体
-O-CH2CH2N-H Cl-
Diethylaminoethyl (DEAE)
CH2CH3
阴离子交换剂
(可吸附带负电的蛋白质)
阳离子交换剂
(可吸附带正电的蛋白质) 22
两种离子交换剂
阴离子交换剂：
常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基
DEAE －C2H4N+(C2H5)2H
16
Principles of Operation for Chromatography Techniques
Gel
Ion
百度文库
Filtration Exchange
Hydrophobic Affinity Reversed
Interaction
Phase
17
实验二、溶菌酶的分离纯化及酶活力 、蛋白浓度测定
r平均=1/2（r大+r小）cm
8
通常：
•低速离心以每分钟的转数表示，如： 4000r/min。 •高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表 示，如：65000g。
两者可换算或查测算图。
9
离心机的种类
名称
转速(r/min)
注意事项
低速离心机 高速离心机 超速离心机
6000 6000〜 25000 >25000
12
离心管
材质：玻璃， 塑料
强度：和离 心速度相配
大小：和转 子配套
高速超速管 要加盖
13
离心机操作
平衡、定温、定速、定时。
14
实验一、 溶菌酶的粗提取——略
15
酶精纯化常用技术
膜分离技术 柱层析技术
蛋白质结晶
透析
超滤
凝胶过滤（分子筛/排阻）层析 离子交换层析 疏水层析 吸附层析 亲和层析 反相层析
QAE
－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3
阳离子交换剂：
常用羧甲基 CM
磺丙基
SP
—CH2COO－ —C3H6SO3－
23
化学原料合成 ： sephadex sepharose 载体
天然材料制成： cellulose
如：DEAE-Sepharose， CM-Sepharose
19
离子交换层析
（ion exchange chromatography，IEC）
20
1.原理:根据待分离物质带电性质不同的分离 纯化方法。
2.离子交换填料：
离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。
纤维素
琼脂糖 —O—CH2—CO—ON- a+ 葡聚糖
载体 电荷基团
反离子
21
离子交换剂
--带有电荷基团的不溶性载体
目的： 1. 掌握离子交换层析原理及层析操作所需的必须原 件。 2. 掌握层析柱填装方法及层析填料的保存 3. 掌握比色法测定溶菌酶的浓度与酶活
18
原理： 根据溶菌酶 pI 10.8，pH 8.0 PBS 中携带？电，与阴/阳
离子层析填料可结合，通过吸附后，提高pH或离子强度将 溶菌酶与其他蛋白进行分离达到纯化目的。 溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的酶解作用导致细菌完整性 破坏，OD600值会下降，通过单位时间内（每分钟） OD600值的下降评价酶活性。 溶菌酶的活力单位（U）：在室温，pH8.0的条件下， OD600每分钟降低0.001为1个活力单位。 280nm的消光系数为13.0，根据 A=ECL 可粗略测定溶菌酶 浓度，用于酶比活的评价。
Fc通常以相对离心力RCF（relative centrifugal force）表 示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力常数g）的多少 倍。一般用g（或数字g）表示。
RCF = m r （2 N/60）2 /mg= 1.12 10-5 N2 r
此公式描述了相对离心力与转速之间的关系
旋转半径用r平均代替
24
实验设计原理
利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电荷 不同，因而与离子交换剂有不同吸附力而分 离。
溶菌酶pI:~10.8
pI < 8.0 蛋白质带负电 pI > 8.0 蛋白质带正电
pH8.0
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2. 阴离子交换剂分离蛋白质的过程
Cl-ClC- l- ClCl-
ClC- lC- lClC- l-ClC- l-Cl-