纤维素降解菌的分离和筛选
油菜秸秆纤维素降解菌的筛选及复合菌剂的降解特性
油菜秸秆纤维素降解菌的筛选及复合菌剂的降解特性摘要：从土壤、腐烂的木桩和成品肥料中筛选高效降解油菜秸秆纤维素的菌株，并通过正交试验对菌种进行复配组合，筛选出一组高效降解油菜秸秆的复合菌剂，其羧甲基纤维素（CMC）酶活性为12 704.3 U/g，滤纸（FP）酶活性为1 227.7 U/g，秸秆失重率为25.65%，初步鉴定该菌剂组成为地衣芽孢杆菌B4、链霉菌A8、米根霉M3和木霉X1。
采用此复合菌剂以油菜秸秆粉为降解原料进行14 d 的发酵，纤维素降解率为33.10%，半纤维素降解率为23.70%，相比于不加菌剂的对照组，自制菌剂的纤维素、半纤维素降解率分别提高了24.50%和15.60%。
关键词：油菜秸秆；纤维素降解菌；复合菌系；降解特性中国油菜种植面积和产量常年居于世界首位，2009年油菜播种面积为700×104 hm2[1]，如此巨大的油菜种植面积，在菜子收获后必将产生大量的废弃油菜秸秆。
据测定，油菜秸秆中含有丰富的氮、磷、钾及有机质等营养成分，然而，目前油菜秸秆并没有得到合理的利用，大量的秸秆被直接焚烧，这不仅污染了环境，同时造成了资源和能源的极大浪费[2，3]。
因此，如何有效地开发利用油菜秸秆，发挥其潜在资源价值，成为当前亟待解决的问题。
油菜秸秆的主要成分是木质纤维素类物质，木质素含量为16%～21%，纤维素为38%～42%[4]，木质纤维素的高含量是阻碍其资源化利用的关键。
提高富含纤维素的工农业废弃物的利用率，已成为近年来研究的热点[5]，目前对纤维素类物质的有效利用主要采取生物法，利用微生物手段使其达到资源化处理和利用[6]。
而且油菜秸秆细胞壁的结晶度较高，木质素与纤维素之间镶嵌形成稳定结构，导致其应用远远不如其他主要粮食作物秸秆，针对油菜秸秆的微生物处理在国内外鲜有报道[7]。
为此，以降解油菜秸秆纤维素为目的，通过从土壤、腐烂的木桩和成品肥料中筛选油菜秸秆纤维素的高效降解菌株，并对菌种的复配组合以及降解特性进行研究。
专题二课题3 分解纤维素的微生物的分离
2019年高考全国Ⅱ卷37. （4）该小组将人工合成的一段DNA 转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶（酶E）。为了 比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验， 请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加酶E的缓冲液，
B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加_缓___冲__液___，
三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，
说明__缓__冲___液__不__能__降___解__W_____；若A、B处形成的透明圈直径 大小相近，说明_酶___E_与__天__然___酶__降__解__W__的___能__力__相__近______。
谢谢观赏！！！
鉴别纤维素分解菌的培养基
培养基组成 CMC-Na 5~10g (水溶性羧甲基纤维素钠)
提供的主要营养物质 碳源
酵母膏 1g
碳源、氮源、生长因子
KH2PO4 0.25g 土豆汁 100mL
无机盐 碳源、生长因馏水定容至1000mL
氢元素、氧元素
涂布：
分离细菌，通常选取104、 105、106的土壤稀释液
练习巩固
3、在加入刚果红的培养基中会出 现如右图所示的透明圈，产生的 透明圈是( ) A.刚果红与纤维素形成的复合物 B.刚果红被纤维素分解菌分解
形成的 C.纤维素分解后形成的葡萄糖导致的 D.以纤维素分解菌为中心形成的
2019年高考全国Ⅱ卷37. 物质W是一种含氮有机物，会污染 土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某 研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌（目标菌）。回 答下列问题。 （1）要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该
本节书内容的背景知识
高活性纤维素降解菌的分离鉴定
１ 培 养基 ． ２
法需要高温高压设备 ， 不很经济 ， 酶法分解则提供 了一条捷径１ ２ １ 。因此利用微生物降解纤维素， 对纤维 素的充分利用具有战略意义 。 我 们 从 长 期 富 含 枯 枝 落 叶 的 土 壤 中分 离 得 到
维普资讯
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纤维素降解菌筛选分离与CMC酶提取及其活性研究
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纤维素降解菌系的筛选及降解稻草条件研究
纤维素降解菌系的筛选及降解稻草条件研究摘要:以已分离的11株纤维素降解菌为材料,采用滤纸崩解法和透明圈法,初步筛选出4株纤维素降解能力较强的菌株｡将这4株单菌进行两两组合,研究混合菌系在9d内的CMC酶活和FPA酶活与单菌发酵之间的异同｡结果表明,混合菌发酵CMC酶活和FPA酶活均优于单一菌株;同时筛选出一组具有高降解能力的混合菌体系;并对该混合菌系降解稻草的最适反应温度､最适初始pH值､产生还原糖的时间进行了研究,结果表明,在30℃､pH值4.5､发酵96 h时混合菌降解稻草的效果最好｡关键词:纤维素降解菌;筛选;CMC酶活;FPA酶活;还原糖含量;降解条件Screening of Cellulose Degrading Microorganism and the Degrading Condition of Rice StrawAbstract: Four strains with strong degradation ability to cellulose materials were screened out of 11 bacteria using filter paper degradation method and clear halo method. Then a mixed germ with higher degradation ability was obtained as the CMC and FPA enzyme activity of mixed bacteria and pure bacterium was compared. The optimum degrading condition of the mixed germ to rice straw was 30℃, pH 4.5, and fermentation for 96 h.Key words: cellulose degrading microorganism; screening; CMC enzyme activity; FPA enzyme activity; degrading condition纤维素是地球上最廉价､最丰富的可再生资源｡全世界每年纤维素及半纤维素的生成量为850亿t｡利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素是纤维素利用的有效途径｡纤维素的生物降解对开辟新能源和防止其污染环境有重要意义,一直是生物技术领域的研究重点[1,2]｡在长期生产实践中发现该生物过程是微生物单独作用不能完成或只能微弱进行的,必须依靠两种或两种以上的微生物共同作用才能完成,微生物混合培养或混合发酵已越来越受重视[3]｡而且国内对产纤维素酶能力较强的单一菌种研究较多,菌种混合发酵的研究较少[4,5]｡本试验在纤维素降解单一菌株研究的基础上,着力于筛选降解纤维素的混合菌系,旨在为纤维素的高效转化提供依据｡1材料与方法1.1菌种纤维素降解菌分别来自枯树根､烂菜叶､牛粪和牛胃中｡1.2培养基制备PDA培养基:马铃薯200 g,蔗糖20 g,琼脂粉20 g,水1 000 mL,pH值6.5｡滤纸条鉴定培养基:(NH4)2SO4 0.10%, KH2PO4 0.10%, MgSO4·7H2O 0.05%,K2HPO4 0.20%,酵母膏0.01%,滤纸条(规格为1 cm×7 cm)1块,pH值6.5｡纤维素刚果红培养基:(NH4)2SO4 0.20%,MgSO4·7H2O 0.05%,KH2PO4 0.10%,NaCl 0.05%,CMC-Na 2.00%,刚果红0.02%,琼脂2.00%,pH值6.5｡液体发酵培养基:KH2PO4 1.00 g, NaCl 0.10 g, MgSO4·7H2O 0.30 g, NaNO3 2.50 g, FeCl3 0.01 g,CaCl2 0.10 g,秸秆木质纤维素20.00 g,pH值7.20~7.40｡1.3菌种初筛透明圈直径(H)与菌落直径(D)比值的测定:将11株保藏菌种(菌种名称分别为N1､N2､N3､N4､N5､N6､N7､N8､N9､N10､N11)活化后分别接种到PDA培养基上,30℃培养3d｡将每一株菌分别转接到纤维素刚果红培养基上,30℃培养4 d后,加入适量1 mol/L的NaCl溶液,浸泡1 h,根据H与D比值的大小进行初筛｡单菌株滤纸失重率的测定:将透明圈大的菌种接种于滤纸条鉴定培养液中,以不接种处理作对照,28℃摇床培养8 d,分别在2､4､6､8 d时测其失重率｡滤纸失重率的测定:用滤纸过滤发酵液,将残留物80℃烘干称重,用减重法计算出滤纸失重率｡失重率=(培养前底物干重-培养后底物干重)×100%/培养前底物干重｡将单菌株滤纸失重率较大且H/D值大于2.0的菌株作为复筛菌种｡1.4复筛将初筛所得单菌种进行两两组合,对单菌种和不同组合菌种测定羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活｡以体积比为1∶1的接种比例､10%的接种量分别接入固态培养基中｡1.4.1羧甲基纤维素酶活测定①酶液的制备:将发酵液于4 000 r/min,4℃,离心20 min,取上清液,备用｡②纤维素酶活力的测定方法(DNS法):取A､B､C共3支50 mL 比色管,在A､B管中分别加入1.5､0.5 mL的1% CMC-Na溶液(用pH值4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液配制)适当稀释的酶液, C管中加入1.5 mL的pH值为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液和0.5 mL酶液,50℃下保温30 min,然后在3支比色管中分别加入2.5 mL的DNS试剂,沸水浴5 min后放入水中冷却,终止反应,定容至25 mL,摇匀,在波长520 nm处测定吸光值(C管作空白对照),并从葡萄糖标准曲线上查出相应的葡萄糖含量,再折算成酶活力单位｡CMC酶活力定义为:在pH值4.8,50℃条件下,1 mL酶液每分钟水解羧甲基纤维素钠生成1 μg葡萄糖的酶量,称为一个酶活力单位,以U/mL表示｡1.4.2滤纸酶活(FPA)测定取A､B､C共3支具塞比色管,在A､B管中加入pH值4.8醋酸-醋酸钠缓冲液1.5 mL和1 cm×6 cm规格的新华滤纸条(约50 mg),50℃下预热10 min后,加入0.5 mL适当稀释的酶液,C管不加底物作空白对照,50℃下保温60 min,然后在3支比色管中分别加入2.5 mL DNS试剂,沸水浴5 min后立即在水中冷却,终止反应,定容至25 mL,摇匀,在波长520 nm处测定吸光值(C管作空白对照),根据葡萄糖标准曲线计算酶活力｡酶活力定义为:在pH值4.8,50℃条件下, 1 mL酶液每分钟水解滤纸条生成1μg葡萄糖的酶量,称为一个酶活力单位,以U/mL 表示｡1.5菌种降解稻草条件研究还原糖含量测定按照DNS比色法[6]进行｡2结果与分析2.1初筛结果由经过活化的11株菌株在刚果红培养基上的生长情况(表1)可知,菌株N1､N2､N3､N7､N8和N9的滤纸失重率相对较高;从透明圈与菌落圈直径之比来看,菌株N1､N3､N7､N8的H/D都超过2.0｡因此,选取N1､N3､N7､N8号菌株作为复筛对象｡2.2复筛结果发酵过程中菌系CMC酶活的变化情况见表2｡由表2可知,接种后1~2 d内酶活逐渐上升,大部分菌株在3~4 d时酶活出现最高峰值,5~6 d酶活开始下降,7~9 d酶活又缓慢上升｡两种菌株混合培养在一定程度上会提高CMC酶活,组合菌株N7+N8培养4 d时的CMC酶活为195.7U/mL,相当于其菌株单独培养平均酶活的2.36倍｡表3表示的是滤纸酶活在发酵过程中的变化情况,总体的变化趋势是在1~4 d 内先上升,5~7 d上升到峰值,之后再下降｡两种菌混合培养时FPA酶活也有一定程度的提高,组合菌株N7+N8在发酵6d时的FPA酶活为30.5 U/mL,相当于其菌株单独培养平均酶活的1.7倍｡因此,选取组合N7+N8作为最优纤维素降解混合菌系｡2.3组合菌株N7+N8降解稻草的最适温度分别研究了温度在20､30､40､50､60℃时混合菌降解稻草后的CMC酶活､FPA 酶活､产还原糖量(表4)｡由表4可知,CMC酶活､FPA酶活､还原糖含量三者之间存在较明显的正相关性,三者均在温度为30℃时达到最大值｡因此选择30℃作为混合菌降解稻草的最适温度｡2.4组合菌株N7+N8降解稻草的最适pH值分别研究了初始pH值为4.0､4.5､5.0､5.5和6.0时混合菌降解稻草后的CMC酶活､FPA酶活､还原糖量｡由表5可知,初始pH值为4.5时,CMC酶活､FPA酶活､还原糖含量三者均达到最大值｡因此选择4.5为混合菌降解稻草的最适初始pH值｡2.5组合菌株N7+N8降解稻草的最适培养时间在混合菌降解稻草的最优发酵条件下,每隔12 h测定1次其生长状况及产糖情况,研究培养时间对混合菌生长及产还原糖的影响,结果见图1｡由图1可知,混合菌系在培养72 h之前,还原糖产量较低,在培养72~96 h过程中,混合菌系迅速产生还原糖,在96 h时还原糖产生量最高,达1.8 g/L｡3讨论本研究筛选出了一组具有较高纤维素降解活力的混合菌系,该混合菌系的CMC 酶活和滤纸酶活均高于单一菌株;同时研究了该混合菌系降解稻草的最适反应温度､最适初始pH值及培养时间对还原糖量的影响｡本研究虽对上述试验条件进行了探讨,但以下问题有待进一步研究:①所得混合菌系纤维素降解酶活力距离生产要求还有很大的差距,应采用诱变等方法对该菌系进行处理,以提高现有菌系的产酶活力;②在利用单因素法研究温度､pH值､培养时间对产酶的影响的基础上,需进一步研究多因素对发酵产酶的影响,以使理论研究更加贴近实际生产｡参考文献:[1] MANDELS M, STERNBERG D. Recent advances in cellulose technology[J]. J Ferment Technol,1976,54(4):267-286.[2] HARUTA S,CUI Z,HUANG Z,et al. Construction of a stable microbial community with high cellulose-degra-dation ability[J]. Applied Microbiology Biotechnology,2002,59(4-5):529-534.[3] 冯树,周樱桥,张忠泽. 微生物混合培养及其应用[J] .微生物学通报,2001,28(3):92-95.[4] 史玉英,沈其荣,娄无忌,等. 纤维素分解菌的分离和筛选[J]. 南京农业大学学报,1996,19(3):59-62.[5] 洪洞,黄秀莉. 纤维素酶的应用[J].生物学通报,1997,32(12):18-19.[6] 王玉万,徐文玉. 木质纤维素固体基质发酵物中半纤维素､纤维素和木质素的定量分析程序[J].微生物学通报,1987,14(2):81-84.。
畜禽粪便纤维素降解菌的诱变与筛选
亚硝酸诱变 亚硝酸诱变 时间 ／ ｍｉ ｎ 浓度 ｍｏ １ ． Ｌ － 紫外线诱变 径和 透 初 筛获得 的 时 间／ ｍ ｉ ｎ 明圈直 菌株编号
径之 比
１ ：１ ． ６
１： １ ． ２ １： １ ． ５ １ ：２ ． １ １ ：２ ． ５
２ ． ２实验 方 法 ２ ． ２． １ 诱 变 剂 处 理 ｌ 卜 ２
孢子悬浮液制备 取 ３ ０ ℃培养 ５ ｄ的试管斜 面菌 种 ，加 入 ｐ Ｈ ７ ． ０的磷酸缓 冲液洗下孢子 ，倒 入装 有玻璃珠的三角瓶 中 ，３ ０ ￣ （ ２ ，１ ８ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ 恒温振荡 ２ ｈ ，使孢子分 散和活化 ，用灭 菌 的脱脂 棉过滤 ，诱 变处理前调节孢子浓度为 １ ０ ６ ／ ｍ Ｌ 。 紫外线 ～亚硝酸复合诱 变 将 经 紫外 线 诱 变 的斜 面 菌 株加 ０ ． ０ ５ ｏｏ ｔ １ ． Ｌ ～Ｎ ａ Ｎ Ｏ 或 ０ ． １ ｏ ｔ ｏ ｌ ・ Ｌ 的 Ｎ ａ Ｎ Ｏ ２ 溶液 ２ ｍＬ ，诱变 ５ ｍ ｉ ｎ ，各 加入 ２ ｍ Ｌ ０ ． ７ ｍｏ １ ． Ｌ － １ Ｎ ａ ２ Ｈ Ｐ Ｏ 溶 液 ，作 终止 剂。将 经亚 硝酸 诱变 的斜 面 菌株 的 磷 酸孢子悬液在距 功率 １ ５ Ｗ的紫外线灯 ３ ０ ｃ ｍ处 ，分 别照射 ４ ｍｉ ｎ或 ６ ｍ ｉ ｎ ，在红灯 下分别稀 释原浓 度的 １ ０ 、１ ０ 。 、１ ０ ４ 倍， 各涂 ３ 个 平皿 ，每个培养皿接菌 液 ０ ． ２ ｍ Ｌ，均匀涂布 于平皿培 养基 。取 未经紫外线处理的菌液 ，稀释至 同样 的浓度 ，作为对 照。编号后置 于 ３ ０ ℃温箱 ，恒 温培养 ７ ２ ｈ 。 ２ ． ２ ． ２ 初筛 次诱变 的初筛是挑取在平板培养基生长 旺盛 的单菌落 ，
2.3分解纤维素的微生物的分离
富集培养→纯种分离→性能测定。
（1）不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是
从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养
嗜盐菌的菌样应从 海滩等高盐 环境采集。
（2）富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境
条件，使其群落中的数量大大增加，从而分离出所需微生物的培
养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择以淀粉为 的
3、操N作aC：l溶液作用：刚漂果洗红作，用以—免—出洗现去的与透纤明维圈素不结够合清不晰牢。的 方法1：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。 方法2：在倒平板时就加入刚果红。
染色法
优点
缺点
这两种方法各有哪些优点与不足？
颜色反应基本 操作繁琐。
方法1 上是纤维素分 刚果红会使菌落之间发生
(后置染色法） 解菌的作用 混杂。
发酵产纤维素酶实验 液体发酵 固体发酵
2、纤维素酶的测定方法:
对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 葡萄糖含量进行定量测定。
课堂小结
分解 纤维 素的 微生 物的 分离
纤维素酶 种类、作用、催化活力
筛选原理 刚果红染色
前置染色法 后置染色法
实 土壤取样 验 选择培养 设 计 纯化培养
富含纤维素土壤 增大分解菌含量 染色鉴别
为什么？
微生物大量繁殖
为什么选择培养能够“浓缩” 所需的微生物？
在选择培养的条件下，可以使那些能够 适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖， 而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖 被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
注意：该步骤也可省略，但纤维素分解菌较少。
3.梯度稀释
按照课题1的稀释操作方法，将选择培养 后的培养基进行等比稀释101～107倍。
纤维素降解菌的筛选-毕业论文
---文档均为word文档，下载后可直接编辑使用亦可打印---摘要）集[C].中国微生物学会农业微生物学专业委员会、中国土壤学会土壤生物和生物化学专业委员会、中国植物营养与肥料学会微生物与菌肥专业委员会、农业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心：中国土壤学会土壤生物和生物化学专业委员会，2010：5.[16]张恒，张应杰，陆昌龙.生活垃圾可发酵物降解菌的筛选[J].安徽农业科学，2005(10)：117-118+200.[17]张爽.低温纤维素降解菌的筛选及其玉米秸秆降解效果研究[D].东北农业大学，2018.[18]张凯帅.纤维素降解菌筛选及基于宏基因组克隆表达纤维素酶基因[D].内蒙古农业大学，2018.[19]刘震飞.秸秆木质纤维素降解菌的筛选及发酵工艺优化的研究[D].兰州交通大学，2018.[20]郑国香，赵欣，李健.一组耐低温纤维素降解菌系培养条件优化及产酶分析[J].东北农业大学学报，2017，48(04)：61-68.[21]李春艳，于琦，冯露，成毅，成小松，王雪，张平根.低温纤维素降解菌分离鉴定及产酶条件优化[J].东北农业大学学报，2015，46(10)：74-81.[22]勾长龙，王雨琼，王巍，赵晗旭，娄玉杰，高云航.两株长白山地区低温纤维素降解真菌的筛选鉴定及其产酶条件优化[J].中山大学学报(自然科学版)，2015，54(05)：115-121+129.[23]侯会利.牛粪固体物堆肥制作卧床垫料的效果及其低温纤维素降解菌的筛选[D].内蒙古农业大学，2015.[24]罗立津，万立，陈宏，温翠莲，徐福乐，贾纬，聂毅磊，袁红莉.耐低温木质纤维素降解菌群的富集培养及其种群结构分析[J].农业生物技术学报，2015，23(06)：727-737.[25]李鹤，张恒芳，秦治家，高云航，娄玉杰，刘淑霞.低温秸秆降解菌的研究进展[J].中国农学通报，2014，30(33)：116-119.[26]黄颖婕,周尚峰,刘震夷,岳勇志,李祖任,邬腊梅,王立峰.牛粪堆肥纤维素高效降解菌的筛选和应用[J].湖南农业科学,2018(02):50-53.[27]毛婷,魏亚琴,杨红建,牛永艳,陈娟,王治业.牦牛粪便中纤维素降解菌的筛选及产酶优化[J].中国农业大学学报,2019,24(11):106-116.[28]李林超,张超,董庆,郭成,周波,高峥.堆肥过程中纤维素降解菌的分离与鉴定[J].生物技术通报,2019,35(09):165-171.[29]方华舟,王培清.牛粪堆肥各阶段主要纤维素降解菌分离与作用规律分析[J].中国土壤与肥料,2012(06):88-92.[30]乔健敏,岳林芳,成立新,郑重,李子健,凤英,李蕴华,王志铭,宝华,于朝晖.肉牛粪污中纤维素降解菌的分离筛选[J].畜牧与饲料科学,2019,40(11):79-83.。
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纤维素降解菌的分离和筛选
1.实验目的：1.掌握纤维素降解菌的的分离和筛选的方法
2.学会会培养基的制备
3.再次了解菌落的形态
2.实验原理：从美术楼后面树林中取适量的土壤，用无菌水将得到的样品经适
当稀释, 在28℃下培养1d，稀释10-6、10-7、10-8三个浓度，分别接
种于鉴别培养基中培养, 每组3个平行，在37℃下培养2-3 d，然后
进行初筛，重复以上步骤，直至获得纯的菌株。
最后镜检。
3.试验方法：1. 取样
先从树林中取10g土壤(10—15cm深)。
用灭菌的塑料袋盛装。
2．饥饿培养
秤取10g土壤，置于250ml的装有90ml无菌水的锥形瓶中，摇匀，
在37℃下培养1d。
3.梯度稀释
所需仪器：试管（8支）、洗耳球、移液管。
需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装9ml蒸馏水）、移液
管。
用移液管从饥饿培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌
水的试管中充分混匀。
然后用移液管从此试管中吸取1ml加入另一
盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1,10-2,10-3,
10-1,10-2,10-310-4,10-5,10-6,10-7,10-8不同稀释度的土壤溶液。
4.选择培养
○1刚果红培养基的制备
所需要的仪器有：500ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、摇床、
培养基，用2层纱布加棉花做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包
裹两层报纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
灭菌后，
倒9个灭菌平板，凝固后待用。
○2涂布平板
将上述已倒培养基的9个平板底面分别用记号笔写上10-6、10-7、10-8
3种稀释度（每个稀释度划3个平板）。
然后用移液管分别由10-6、
10-7,10-8三管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平
板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。
38℃倒置培养2-3d，至菌落长出，产生纤维素酶的菌落周围将会出现透明圈。
○3菌落形态观察
○4划线分离
PDA培养基的制备方法
马铃薯200g
纤维素（cmc）若干克
琼脂15-20g
蒸馏水1000ml
马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后纱布过滤，再加琼脂，融化后不足水至1000ml。
121℃灭菌30min.
待凝固后，从以上涂布的9个平板当中取出1个菌落周围的透明圈比较大的平板。
用接种环挑取菌落在平板培养基上进行梯度划线。
连续做3个平行，置于38℃下培养。
重复以上步骤,进行连续3次纯化培养。
直至获得纯的菌株。
○5斜面培养
选取透明圈大且降解能力强的菌株以待划线时使用。
如上面制备PDA培养基，将其倒入1支灭菌试管里，每管约倒入1/3的培养基，倾斜置放，30min之后，带其凝固，用接菌环挑去少量菌落划线培养，做3个平行。
置于38℃下，培养2-3d。
直至长出菌落。
5.镜检
所需仪器或试剂：菌种的平板培养物、番红、显微镜、酒精灯、载玻片、接种针、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、蒸馏水等。
操作步骤：
制作（挑取、印染）---染色（番红）---静置10min---冲洗（蒸馏水）---加片（盖玻片）---镜检
结果：从形态和印片染色看，该菌属于放线菌。