纤维素分解细菌的分离和鉴定
2023年新教材高中生物微生物的基本培养技术能力提升练(无答案)新人教版选择性必修3
1.2.1 微生物的基本培养技术一、选择题1.下列关于纤维素分解菌分离和鉴定的叙述，正确的是（）A.要从土壤中将纤维素分解菌分离出来，应该将它们接种在含指示剂的鉴别培养基上B.分离分解纤维素的微生物时把纤维素作为唯一氮源C.对纤维素分解菌进行选择培养时，要选用液体培养基，原因是纤维素分解菌在固体培养基上不能生长D.刚果红染色法筛选纤维素分解菌使用的培养基属于鉴别培养基2.下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是（）A.培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌B.接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧C.接种后的培养皿要倒置，以防培养基污染D.菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基3.微生物培养过程中，要十分重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，请分析下列操作，错误的是（）①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢②接种操作要在酒精灯火焰附近进行③无菌繁殖脱毒苗时，植物的外植体要进行消毒④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌⑤培养基要进行高压蒸汽灭菌⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌.A.①③B.②④C.③⑤D.④⑥4.下列有关微生物实验室培养的叙述，不正确的是（）A.在熔化琼脂时，需要控制火力并不断搅拌，以免发生焦糊B.灼烧、高压蒸汽灭菌、紫外线照射等都属于无菌技术C.样品中活菌数量统计时，接种方法应采用平板划线法D.用平板培养基培养微生物时，应将平板倒过来放置5.广泛用于牛奶、奶酪、啤酒等产品的消毒方法是（）A.高压蒸汽灭菌B.巴氏消毒法C.酒精消毒D.火焰灼烧6.尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培养基时（）A.葡萄糖在培养基中含量越多越好B.尿素在培养基中含量越少越好C.尿素分解菌有固氮能力，故培养基中尿素为无机氮D.尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素为有机氮7.如下表所示为某微生物培养基的配方，请回答错误的是（）A.依物理性质，该培养基属于液体培养基B.依用途划分，该培养基属于选择培养基.C.根据培养基原料，所培养微生物的同化作用的类型是自养生物D.该培养基中的碳源是（CH2O）8.下列关于培养基的叙述正确的是（）A.配置培养基时要依据微生物的营养需求B.培养细菌时一般需调整pH为中性或酸性C.是碳源的物质不可能同时是氮源D.配置液体培养基的目的是为了观察菌落特征9.微生物的实验室培养过程中，培养基配制后的分装一般有两种：一种为分装至试管；一种分装至培养皿，称为倒平板。
纤维素分解菌的分离和鉴定
纤维素降解菌类的分离与鉴定系列实验一、实验背景纤维素是植物细胞壁主要成分，属于多糖类物质，是地球上数量最大的可再生资源。
如能利用微生物将其转化为生物产品或生物能源，即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。
由于在自然界中存在着大量产纤维素酶的细菌和真菌，因而纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用。
从20世纪40-50年代起，针对产纤维素酶的微生物的分离筛选就进行了大量的工作，并逐步建立起一套较完整的分离筛选方法。
迄今为止有关纤维素降解菌分离筛选的研究报导已有很多，如细菌中的生孢噬纤维菌属、噬纤维菌属及纤维单胞菌属等；放线菌由于能形成芽孢，与真菌相比较耐高温和各种酸碱度，故在高温阶段放线菌对分解木质素和纤维素起着重要的作用。
主要有诺卡氏菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属及小单胞菌属等；真菌中研究较多的是青霉属、根霉属、曲霉属等，其中以木霉属的菌株纤维素酶活较高。
以羧甲基纤维素钠和添加少量葡萄糖作为碳源，培养纤维素酶产生菌株，培养一定时间后，经刚果红染色和稀碱液固定，在菌落周围形成透明水解圈，根据透明圈的大小，快速定性鉴定纤维素酶产生菌酶活大小。
与传统纤维素酶活检测方法比较，本方法菌丝生长快，两天后菌落经染色，透明圈边缘清晰，直观性强，与酶活力成一定线性关系。
纤维素是世界上所有植物的组成部分，是地球上最为丰富且可再生的资源。
随着世界能源形势趋于恶化，环境问题日益加剧，利用纤维素生产有高附加值资源的以维持人类可持续发展的研究方向近年来逐步成为科学研究的热点方向。
利用微生物将纤维素、半纤维素降解转化为生物产品或生物能源即可缓解能源短缺、解决环境污染，又能形成新的产业。
因此分离和筛选高酶活性的菌株是有效利用纤维素物质的关键。
二、实验目的从目标试样中分离筛选出具有降解纤维素能力的菌株。
三、实验材料：1、样品的采集1）风干土样E4-1、E2-6、E2-6试样。
2）潮湿土样E4-1、E2-6、E2-6试样。
3）牛粪样品2份以上实验材料全部取自三教微生物实验室冰箱中；2、培养基1）CMC培养基2）LB培养基3）高氏1号培养基4）PDA培养基3、其他物品天平，称量纸，药匙，试管架，涂布器、摇床、烘箱、灭菌锅、瓶子、45ml无菌水（带玻璃珠），含9ml无菌水的试管，无菌培养皿，1ml及0.08ml移液管。
纤维素分解菌的筛选方法
纤维素分解菌的筛选方法
纤维素是一种重要的营养物质，是细菌中含量最丰富的有机物质，具有重要的生物学
功能，常被用于制备肥料和饲料等。
研究纤维素分解菌种类及其分解的反应特性，是研究
纤维素降解机理的重要基础。
纤维素分解菌的筛选方法主要有几种，包括淀粉膜电泳筛选，扩增隔离法，等电点筛选，微量培养筛选，补液筛选，微量测定等。
1. 淀粉膜电泳筛选：采用放大型电泳仪，用淀粉溶液构成膜，将单细胞菌悬浮液流
过该膜，其中纤维素分解菌可形成淀粉膜电泳状态，能在该膜中形成一定的结构，从而被
检测到。
2. 扩增隔离法：将一定浓度的纤维素溶液，与培养基或植物提取物按比例混合，在
适宜的条件下，加入适量的细菌，构成纤维素溶液底物，配制培养基，进行培养，根据培
养结果来筛选出对纤维素感兴趣的菌株。
3. 等电点筛选：利用膜膜过滤，在纤维素分解反应的同时，膜膜滤过的细菌会因等
电点变化而被选择。
4. 微量培养筛选：在不同营养条件和温度条件下，采用微量的纤维素细胞悬液，进
行培养，根据形态生长变化、颜色变化等特征，来判断哪些细菌对纤维素有分解能力。
5. 补液筛选：在细胞处理步骤中，常常采用补液筛选方法，利用纤维素溶液作为营
养基底，进行补液筛选，通过补液来影响纤维素分解速度，筛选具有良好分解能力的菌株。
6. 微量测定：取液量较小的细菌悬液，进行分离、培养，在相应的条件下，采用固
体纤维素的含量来微量测定纤维素分解菌的数量，从而筛选出纤维素分解菌菌株。
通过以上各种方法，可以有效筛选出纤维素分解菌的种类，从而更好的研究纤维素降
解的机理和分解效率。
分解纤维素的微生物的分离知识点
分解纤维素的微生物的分离知识点纤维素是植物细胞壁的主要结构成分，通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起，其结合方式和程度对植物源食品的质地影响很大。
你知道纤维素的微生物怎么分离的吗?下面店铺给你分享分解纤维素的微生物的分离知识点，欢迎阅读。
分解纤维素的微生物的分离知识点一、纤维素与纤维素酶1.纤维素的化学组成含C、H、O三种元素，是一种多糖。
纤维素的基本组成单位是葡萄糖，人体内没有纤维素酶，所以人体不能直接以纤维素为能源物质，但土壤中有分解纤维素的微生物，最终把纤维素分解成葡萄糖释放到无机环境。
2.纤维素的分布棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
纤维素产生于植物的光合作用，地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨。
研究土壤中分解纤维素的微生物将给我们的生活带来很大变化。
3.纤维素酶的组分纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶三种组分。
前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
二、纤维素分解菌的筛选1.方法刚果红染色法，常用的有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。
2.原理(1)含纤维素的培养基中加入的刚果红，可与纤维素形成红色复合物。
(2)当纤维素被纤维素酶分解后，形成的纤维二糖、葡萄糖不和刚果红发生这种反应，红色复合物就无法形成，培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
三、实验设计1.实验流程土壤取样→选择培养(此步可省略)→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。
2.土壤取样采取土样时，可以选择富含纤维素的环境。
3.选择培养(1)目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离得到所需要的微生物。
(2)操作方法：将土样加入装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2_d，直至培养液变混浊，也可重复选择培养。
纤维素菌分离和鉴定的方法
纤维素菌分离和鉴定的方法一、概述纤维素由于其特殊的生化性质，一直是微生物学和食品工业研究的关注焦点。
特别是纤维素的分解，除了传统的化学方法，生物法也是目前广泛采用的技术之一。
对纤维素酶活性和产酶微生物的分离和鉴定，是纤维素生物技术研究的重要内容。
纤维素分解酶是产生于微生物体内的一类酶，广泛存在于真菌和细菌中，可划分为纤维素酶和半纤维素酶两大类，规律的利用这些微生物菌种，开发新型的纤维素分解酶。
纤维素的微生物分解菌种较多，其中许多菌种能分泌出多种细胞外酶，如单糖的转化酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡萄糖氧化酶、木糖酶、果糖酶和葡聚糖酶等。
多种新型有机物的产生依赖于工业生产中微生物的应用技术，目前各国纤维素降解的菌株和发酵产物分离和鉴定方法越来越多。
纤维素菌的分离可采用筛选、稀释和富集等方法。
实际应用中，常用的分离方法有：（一）厌氧富集法：根据纤维素菌能够在厌氧条件下进行生长和代谢的特点，采用富集培养方法，利用耐氧性微生物限制氧气的供应，引起产生厌氧性纤维素分解菌类，然后推广领域固定化、发酵和应用。
可根据繁殖时间将厌氧富集法分为短时间富集法和长时间富集法。
（二）筛选法：在纤维素富含的自然环境或人工培养环境中进行筛选。
先用一些微生物菌株做为预培养菌种，加入富含纤维素的培养基，通过短期采取接种、稀释、摇动等处理方式，寻找纤维素分解酶活力最高的培养物，然后进行分离纯化、性质鉴定。
（三）稀释法：将样品依一定比例进行稀释，将稀释后的液体均匀地均匀的加入纤维素培养基中，用深层培养的方式进行发酵，进行分离鉴定纯化。
稀释法适用于富含纤维素且菌株较多的培养基的菌群筛选。
（一）形态学特征鉴定法：根据菌株的形态学特征进行鉴定。
此方法是最基本也是最重要的鉴定方法之一。
菌株的形态学特征包括形状、结构、颜色和大小等，进一步对分离的菌株进行正确定义。
常用的形态学特征包括：形态特征、结构特征、色素特征和大肠杆菌。
（二）生理生化特征鉴定法：通过菌株的生长特性在不同培养基中的表现，或菌体在不同生长条件下表现的生化过程，如碳源利用情况，氮源利用情况，温度和pH值的影响等，进行鉴定。
纤维素分解微生物的分离与鉴定
环境微生物技术实验总结报告一、国内外研究进展：①纤维素资源据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.8×1011 t，这些植物物质所含的能量相当于全球人类每年能量消耗量的20倍，食物中所含能量的200倍。
纤维素是构成植物细胞的基本成分，纤维素占全球植物总干重的30%一50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物，它存在于所有植物当中。
在生物界中，结合于有机体中的碳达27×1010t，在自然界有机体中构成纤维素的碳约占40%，据此估算，在植物界中纤维素的总量约达26.0×1010t，而且自然界中的植物原料是年复一年地不断生长和更新的，可以说，纤维素在自然界中是一种最丰富的可再生的有机资源。
纤维素是一种不能被大多数动植物直接利用的多糖物质。
但对人类来说只要能将其降解成小分子物质，纤维素就会成为一种有广阔应用前景的资源。
而且这种潜在的资源数量是惊人的，其中的大多数作为绿色植物的成分在维持生态平衡中起作用而不宜利用，但是仍有数量可观的纤维素由人类生活和生产产生，它们主要存在于农作物秸秆和城市垃圾之类的废弃物中。
灾荒或战乱造成的粮食危机依然是正存在的和潜在的威胁;随着全球经济的飞速发展，地球上石油、煤炭的储量正以惊人的速度减少，能源危机成了世界大多数国家所面临的一个严峻问题;由于对资源的破坏性开采和利用，人类赖以生存的环境正在不断地恶化，对可再生资源利用的研究与开发的可持续发展战略己在世界各国逐步展开。
如何处理和利用废弃纤维素将成为一个十分紧要的问题。
②农业废弃物资源的利用现状植物纤维素资源的开发利用对解决粮食和能源短缺以及环境污染问题有极其深远的意义。
我国的纤维素资源极为丰富，每年的农作物秸秆产量达5.7x107吨，约相当于北方草原年打草量的50倍。
但是，农作物秸秆产生数量多且产生时间集中(每年到收获季节农村就会有大量的秸秆产生)，而我国的农作物秸秆主要用于燃料、畜禽饲料与自然堆肥，不仅利用效率低，而且随着农村生活水平的提高，农作物秸秆成为农村固体废弃物的主要来源。
纤维素分解细菌的分离和鉴定
ｃｎｔ ｃｅ ａｅ ｎｇｎｔ ｉａｃ ｎｌｓ ．Ｉ ｕｔＴ ｒｅｓ ａ ｅ ｌ ｉｅｔ ｅ ｅＰｅ ， ｎ ｂｓｄ ｏ ｅｓｖｒｌ ｈｎｔ ｉ ｃａａｔｒ， ｏｓｕ ｔ ｂｓｄｏ ｅｅｉ ｄｓ ｎｅａａ ｉ １ ｒ ｄ ｃ ｔ ｙ ｓ ｓｉｌｈｅ ｔ ｉ ｗ ｒ ａ ｄｎｉ ｄｔ ｂ ｓ Ⅲ ａｅ ｎｔ ｅａ ｐ ｅｏｙ ｃ ｈｒｃ ｓ ｒｎ ｓ ｅ ｌ ｉ ｆ ｏ Ｄ ｈ ｅ ｐ ｅ
ｐ ｔ ａ， ｕＭ ＷＨ１ ＷＨ１ 和 ２还需进 一步鉴定 。
关键词 纤维 素降解细 菌； 离； 分 鉴定 中图 分类 号 Ｓ ８ 文献标识 码 Ａ １ ２
文章编 号 ０ １ — ６ １ ｏ９ ０ — ３５ — ４ ５７ ６ １（ ０ ）９ ０９６ ０ ２
Ｉ ｌｔ ｎａ ｔＩｅｔ ｍａｏ ｆ ｆｅｅｔＣ ｎ ｌｓ－ ｓ ａｉ ｎｉ ｄｎｉ ｔ ｎｏ ｔ ｉ ｅｕｏｅ￣ ｏ ｏ ｆ ｉ Ｅ＇ ｎ ￣ ｌ ｅｅｉ ｌｔ ａ ａ ｒ Ｕ Ａ ｈ ｔａ （ ｒ ｅＣｌ ｇ ｆ ｈｎ ｏｇＵ ｉ ｒ ｔ ａ Ｗｅ ａ， ｉａ，ｈｎｏ ｇ ６２９ ｓｉ ｌ Ｍａｉ ｏｌ ｅｏ ａｄｎ ｎｖ ｓｙ ｔ ｉ ｉＷｅ ｉＳａｄｎ ４０ ） ｅ ｎ ｅ Ｓ ｅ ｉ ｈ ｈ ２
ｇａ ｉｇｂ ｃｅｉ ＷＨ１， Ｈ３ ａ ｄＷ Ｈ１ ｒ ｓｈｔｄ ｆ ｍ ｅ ｃｍｐ ｓｓｔｒｕ ｈ ｓｌｃｉｅｃ ｔｒ ｏ ｄｔ ｎ ．Ｔ ｎ ｅｔ ａｅ ｔｅ ｐ ｙｏ ｅ ｅｉ ｏ ｉｏ ｆ ｒｄｎ ａ ｔｒ ａ， Ｗ ｎ ２ｗｅｅ ｉ ｏ ｅ ｒ ｔ ｏ ｏ ｔ ｈｏ ｇ ｅｅ ｔ ｕ ｕｅ ｃｎ ｉｏ ｓ ｏ ｉｖｓｉ ｔ ｈ ｌｇ ｎ ｔ ｐ ｓｔ ｎ ｏ ｏ ｈ ｖ ｌ ｉ ｇ ｈ ｃ ｉ ｈ ｓ ｔａｎ ， ６ ｔｅｅｓｒｉｓ ｔｅ ｌ Ｓ 正Ｉ ｓｑ ｅ ｃ ｓｗｅｅ ｃｏ ｅ ｈ ＮＡ ｅ ｕ ｎ ｅ ｒ ｌｎｄ．ｓｑ ｅ ｃｄ ａ ｄ ｃｍｐ ｒｄ ｗｉ ｏｅ ｏ ｌｔ ｔ ｉｓ １ ｌ ｕａ ｈ ｌｇ ｎ ｔ・ｄ ｎ ｒｇａ ｗｅｅ ｅ ｕ ｎ ｅ ｏ ａｅ ｔ ｔ ｓ ｆｒ ａｅ ｓｒ ｎ ．１】 ｍｏｅ ｌｒｐ ｙｏｅ ｅｉ ｅ ｄｏ ｒｍ ｒ ｎ ｈ ｈ ｅ ｄ ａ ｅ ｃ （
微生物分离纤维素降解菌的筛选与分离
微生物分离纤维素降解菌的筛选与分离纤维素是一种广泛存在于自然界中的有机化合物，它是植物细胞壁的主要组成部分。
纤维素具有高度的生物降解性，然而，其高度结晶性和复杂的结构使其难以被常规的酶解系统降解。
在生物领域中，微生物分解是一种有效且环保的方法，因此，筛选和分离纤维素降解菌对于提高纤维素降解效率具有重要意义。
一、筛选纤维素降解菌的方法1.1 培养基的选择筛选纤维素降解菌的第一步是选择合适的培养基。
常用的纤维素降解培养基包括CMC（羧甲基纤维素钠）、Avicel（微晶纤维素）、Whatman No.1滤纸等。
这些培养基能够提供纤维素降解菌所需的碳源和营养物质，有利于菌群的生长和繁殖。
1.2 筛选方法传统的筛选方法是利用纤维素作为唯一的碳源，在培养基中培养环境中的微生物，通过测定产酶能力来判断纤维素降解菌的存在。
常用的方法有：（1）红色亚甲基纤维素（RAC）将纤维素培养基添加亚甲基蓝等指示剂，在纤维素降解区域由蓝色转变为红色，表明纤维素被降解。
（2）半定量筛选利用葡萄糖法测定纤维素降解能力。
在培养基中添加不同浓度的纤维素，观察菌落的生长情况和菌液中的葡萄糖含量，评估纤维素降解能力。
（3）放射标记纤维素将放射性同位素标记在纤维素分子上，通过测定纤维素的解脱率来评估菌株的降解能力。
二、纤维素降解菌的分离与鉴定2.1 分离方法从自然环境中分离纤维素降解菌是筛选过程的关键步骤之一。
常用的分离方法包括：（1）稀释平板法将适当稀释的样品在纤维素培养基上均匀涂布，经过一段时间后，将生长的菌落分离并培养纯种。
（2）可溶性物质包埋法将样品与纤维素培养基搅拌均匀，接种到含有纤维素的胶状物上，培养一段时间后，可分离出纤维素降解菌。
2.2 鉴定方法为了确定分离的菌株是否为具有纤维素降解能力的菌株，需要进行鉴定。
常用的鉴定方法包括：（1）形态学鉴定观察菌落的形态、颜色和菌落边缘等特征，使用显微镜观察细胞的形状和结构。
（2）生理生化特性鉴定测定菌株的氧耗、氧释等生理特征，通过测定菌株对不同碳源和氮源的利用情况来判断其代谢特性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
纤维素分解细菌的分离和鉴定一．实验目的：1.研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定．2.采用低温培养的方法从秸秆堆肥中筛选出3株分解纤维素的细茵。
3.通过PCR克隆这3株茵的16s rDNA并与相似菌株做比对．进一步构建分子进化树．来研究其分类情况。
4.综合其个体形态、茵落形态、生理生化特征、16S rDNA发育树构建结果等分类依据。
二．实验原理：细菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。
应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。
由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。
将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。
用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，计数并且观察。
三、实验仪器：1、材料试验材料为背阴处长时间堆放的秸秆堆肥表层；2、培养基：初筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基”。
：啦嘞1．00 g，MgS04·7H20 0．30 g，NaCl 0．10 g，F'eCl3O．0l g，NaN03 2．50 g，CaCi2 0．10 g，琼脂18．00 g，蒸馏水l000lnl，pH值7．0～7．2．121℃灭菌20min。
无淀粉滤纸(浙江富阳纸厂)用浓度l％的醋酸浸泡一夜后用浓度2％的Na-2C03水溶液洗至中性，晾干备用。
把上述处理过的滤纸剪成直径约为8 ca的圆形滤纸片．放在干净的平皿中，用报纸包好．采用湿热的方法灭菌；3、复筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基：啦P04 1．009，m．庐04‘7H200．309。
NaO 0．109．FeCl30．01g，NaN03 2．50 g．CaCl20．10g，羧甲基纤维素钠lO．00 g，琼脂18．00g，蒸馏水10130ml，pH值7．0—7．2，121℃灭菌20 min。
4、牛肉膏蛋白胨固体培养基；5、生理生化特征鉴定培养基。
四、实验步骤：1、菌种分离菌种初筛。
将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。
用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，15℃下培养10 d。
重复此操作至菌种初步纯化。
2、菌种复筛。
用接种环从已初步纯化的初筛平板上滤纸水解透明圈的菌落处，刮取菌种在复筛平板上划线，15℃下培养7 d，得到单菌落。
将分离纯化的单菌落回接到初筛培养基上，观察其对滤纸的分解。
将分离到的单菌落接种到牛肉膏蛋白胨培养基上。
15℃下培养7 d,4℃保留菌种或用作各种鉴定。
3、菌种形态观察个体形态观察。
对细菌进行革兰氏染色、荚膜染色和芽孢染色，观察结果；进行牛肉膏蛋白胨半固体培养基(含琼脂O．4％)穿刺接种，观察游动性；对菌体形态进行镜检，菌体大小采用数字显微图像处理软件MIE测量。
4、菌落形态观察。
在复筛培养基上15℃下培养7 d，进行菌落形态观察。
5、菌株最适温度与ph的测定将筛选菌株分别在II、15、20、25、29、37℃下涂布培养5 d(密度不可过高)，至少选取加个单菌落测量其直径，绘制3株菌的单菌落平均直径随温度的变化曲线，作为最适生长温度的参考。
同样．不同pH梯度下涂布培养5 d，测量单菌落平均直径，绘制其随pH的变化曲线，作为最适生长pH的参考。
6、生理生化特征鉴定采用“1．2．4”所述的生理生化反应鉴定培养基对筛选的3株菌进行鉴定。
7、16srDNA鉴定菌株VCR模板制备㈣9。
取培养3 d的平板单菌落悬于50m无菌蒸馏水中，于100℃水浴5—10 min，取出立即放置冰上，保存。
16S rDNA的PaR扩增与测序。
采用上海生工生物工合成的l对16S rDNA引PCR扩增条件：94℃预变性5 rain，94℃变性45 s．50℃退火45 s，72℃延伸，50 lll反应体系30个循环后再72℃延伸5 min。
8、序列比对与系统发育树的构建。
将测得的16S rDNA序列在Genlhnk上进行BLA．gI"比对，对获得的同源序列进行序列分析。
取同源性较高的不同种的模式序列(Type Strain)用MEGA 4。
10：进行多序列比对并构建系统发育树。
五、结果与分析：1、菌株的筛选通过菌株的初筛、复筛和同接试验，共分离出15种具有纤维素降解活性的菌株。
其中的13株细菌，分别命名为WHI—WHl3。
测量15℃下培养10 d的滤纸分解圈．WHl2平均为7．0咖．WH3为5．5 rrlin，Will为5．0 ml'n，其他菌株均在3．0 mm以下。
选取菌株Will、WH3、WHl2继续研究。
菌株wHl2对滤纸分解能力最强．15℃下培养10 d．该2、菌种形态观察结果1个体形态观察结果、通过染色，光镜(10×100)下进行形状观察和半固体培养基穿刺接种运动性观察．采用数字显微图像处理软件MIE对菌体大小进行测量，结果见表l。
3株菌均为革兰氏阴性杆菌，有荚膜．不产生芽孢．均呈杆状。
穿刺接种显示细菌沿穿刺线扩散，说明细菌口，能有鞭毛。
3、菌落形态观察结果。
对3株菌在复筛培养基上15℃下培养7 t，3株菌具有不同的菌落形态。
在复筛培养基上均为浅颜色，但在滤纸培养基上Will菌落为鲜绿色．WI-13为棕黄色。
WHl2为桔黄色。
生理生化结果显示，3种菌均能利用葡萄糖；能产生胞外呈阳性。
脂酶，但都不明显；能利用多种碳源。
WH!和WI-112能水解2．4培养特征测定结果明胶，即分泌胞外的蛋白酶；WH3和Wttl2则能水解蛋白胨中的色氨酸．产生吲哚反应；Will和WH3分解匍萄糖产酸，能使溴甲酚紫变黄(PH值5．2)但不能使甲基红变红(pH值=4．2)。
grill能分解硫代硫酸钠产生硫化氢。
4、最适生长温度。
在不同温度下培养，3株菌的培养曲用单菌落测量生长曲线虽不典型，。
但也能表现出菌的最适生长温度。
WHI和WH3在20℃左右菌落直径最大。
5、菌种鉴定上述试验结果表明3株菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。
应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。
由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。
Will、WH3和WHl2都未发现类似菌落特征。
故认为3株菌属假单胞菌类。
根据3株菌生化反应特征，氧化酶反应阳性和分解蛋白质，确定不属于黄单胞菌属和滑动单胞菌属，故可能为假单胞菌属和葡糖杆菌属。
6、16srDNA饼姨鉴定结果BLAST比对。
比对结果显示菌株Will的16S rDNA测试结果为I 442个碱基，共有198条序列最大相似度(Max ldent)在99％以上，几乎均鉴定为假睢胞菌属，涉及到已鉴定的12个种。
当前普遍观点认为：16SrDNA序列同源性大于99％，可以认为属于同一种；小于98％，则可认为属于不同的种；16S rDNA序列同源性小于95％，则可认为属于不同属：¨-I 3『。
由于假单胞菌属菌种相对较复杂，相似度为99％仍不能鉴定到种，但可以确定的是Will属于假单胞菌属，同时可进一步通过构建系统发育树寻求wHl与其他种可能的进化关系。
菌株WH3的16s rDNA测试结果为：l 443个碱基(Gen．Bank序列号：H262367)。
BLASI"GenBank 的基因序列后，分析确定WH3为假啦胞菌属。
菌株WHl2的16S rDNA测得l 439个碱基(GenBank序列号：H262368)。
BLAST GenBank的基因序列后分析确定WHl2。
仍为假单胞菌属。
7、系统发育树。
通过构建同属不同种序列的系统发育树可进一步鉴定菌株的种型。
通过在Ge删数据库的BLAST．选取同属已鉴定的所有不同种12条模式种序列。
通过MEGA 4的CLUbTALW 进行多序列比对并构建系统发育树。
由于这12条序列具较高的同源性(均在99％以上)，即进化距离较短，宜采用最小演化长度法(Minim,,,n Evolmion)构建L1 4。
，．经自举法(1kmtstmp Method)检验，该树基本正确。
一般认为，当一个给定的内部树枝的自举值为95％或者更高．才认为树枝结构正确-14一二所以不能鉴定WHI具体足Pseudornor船属的哪一种，为验汪假没的正确性，随机取假单胞菌科(Pseu(b咖哪Iaccac)的4个属(Pseudomonas、Xan thomonas、Zoogloea和C．1uconobacter)的菌株构建发育树，验证发现Will属于假单胞菌属的可信度为100％，则暂定Will名为Pseudomonas sp．strain Will。
与WH3 BLAST显示的共3个不同种．参考WHI，同样选择各个种的16S rDNA序列，采用MEGA 4通过最小演化长度法构建系统发育树，选取不同种各一条模式种基因序列，采用MF_EA4通过最小演化长度法构建系经自举法检验，发育树构建基本正确。
WI-112与WHI情况相似，很难据此确定为何种．但确定认为WHl2属假单胞菌属(Pseudomonas)，暂定名为Pmudomonas sp．血dill WHl20。
8、结论与讨论综合以上结果，菌株Will、WH3和WHl2经初步鉴定可能为假单胞菌属和(或)葡糖杆菌属的种，通过16S rDNA分析进一步确定该3株细菌均属假单胞菌WH3为恶臭假单胞菌。
未曾有关其降解纤维素的报道。
试验对其做的相关特性鉴定．个别鉴定结果不同：其所述生长温度有一定降低，最适生长pH值6．5偏酸性，个别生化试验结果不同。
筛选条件的不同町能会产生条件诱导，使菌株发生了变化，正在对其有关的纤维素酶进行提取。
结论有待进一步验证。
WHl2虽与Will、WH3同属假单胞菌属，且16S rDNA序列差别不大(与WH3两两对比相似度98％)，但各方面性状表现差别很大。
假单胞菌属如此之小的16S rDNA差别致使各种反应现象差别之大的原因，很值得深入探讨。