理中汤古今不同用量对脾阳虚小鼠脏器系数影响-袁琛皓,董广通,孙伟越,等
北京中医药大学主任医师王玉英讲解古方今用
北京中医药大学主任医师王玉英讲解古方今用一、胃病1、脾胃虚寒脾胃虚寒的表现：不爱喝水、喜热恶寒、舌淡苔白、大便溏薄。
胃部寒凉的人最适合吃理中丸。
理中丸有温中、散寒止痛、健脾和胃的功效，已经有1800年的历史了。
理中丸君臣佐使配伍：君（干姜暖中、助阳、止呕、止泻）；臣（人参补气健脾）；佐（白术健脾燥湿）；使（甘草调和诸药、温中祛寒、健脾和胃）。
理中丸用红糖水送服效果更佳。
蜂蜜水有润肠通便的作用，这里不适合；红糖水有温补的作用，和理中丸在一起相得益彰。
饭前半小时服用理中丸效果最佳。
易上火的人不要长期吃理中丸，一般服用3-5天即可，老年人可以稍微延长服用时间。
附子理中丸在理中丸的基础上加了附子，暖胃力量更强。
2、胃热胃热的表现：胃脘胀痛、胃中灼热、不喜按压、口气浑浊、大便干燥、舌红苔黄。
保和丸缓解积食胃热效果好。
由朱丹溪发明，至今也有600余年的历史。
保和丸君臣佐使配伍：君（山楂消肉食）；臣（神曲帮助山楂消食）；佐（莱菔子消米面之积、半夏化痰消积、陈皮和胃理气健脾、茯苓健脾）；使（连翘清热）。
保和丸用温开水送服效果更好。
造成胃热的原因：辛辣油腻的食物、暴饮暴食、心情不好、总吃补药。
3、心情不好易气滞引发胃部胀痛香砂六君子丸（汤）也有200多年的历史。
能治疗脾胃不好、气滞胃胀。
饭后半小时服用为好。
木香可以帮助理气。
木香入肝、脾胃、三焦，可以行气止痛，调一身之气。
香砂六君子丸君臣佐使配伍：君（木香）、臣（砂仁、陈皮）；佐（人参、白术、甘草、茯苓）；使（半夏）。
[健康之路] 健康之路20151016视频和笔记:王玉英,古方今用解烦忧(一)二、咳嗽1、风寒感冒引起咳嗽受凉感冒初期的咳嗽吃通宣理肺丸合适。
通宣理肺丸有发表、散寒、宣肺、止咳的功效，适合初期的风寒咳嗽，饭后服用即可。
川贝枇杷露适合清肺热。
通宣理肺丸君臣佐使配伍：君(麻黄散寒、宣肺、止咳、平喘）；臣（紫苏药食两用、苦杏仁、桔梗、陈皮、半夏、前胡、茯苓）：佐（黄芩、枳壳）；使（甘草）。
中国古代医书 脾胃论
中国古代医书脾胃论.txt31岩石下的小草教我们坚强，峭壁上的野百合教我们执著，山顶上的松树教我们拼搏风雨，严寒中的腊梅教我们笑迎冰雪。
[中医古籍] 朝代：金元年份：公元1249年[公元年起] 11249<目录><篇名>序属性：天之邪气，感则害人五脏，八风之中，人之高者也；水谷之寒热，感则害人六腑，谓水谷入胃，其精气上注于肺，浊溜于肠胃，饮食不节而病者也；地之湿气，感则害人皮肤筋脉，必从足始者也。
《内经》说百病皆由上中下三者，及论形气两虚，即不及天地之邪，乃知脾胃不足，为百病之始，有余不足，世医不能辨之者，盖已久矣。
往者，遭壬辰之变，五六十日之间，为饮食劳倦所伤而殁者，将百万人，皆谓由伤寒而殁，后见明之辨内外伤及饮食劳倦伤一论，而后知世医之误。
学术不明，误人乃如此，可不大哀耶！明之既着论矣，且惧俗蔽不可以猝悟也，故又着《脾胃论》叮咛之。
上发二书之微，下祛千载之惑，此书果行，壬辰药祸，当无从而作。
仁人之言，其意博哉！\x己酉七月望日遗山元好问序\x<目录>卷上<篇名>脾胃虚实传变论属性：《五脏别论》云∶胃、大肠、小肠、三焦、膀胱，此五者，天气之所生也。
其气象天，故泻而不藏，此受五脏浊气，名曰传化之府，此不能久留，输泻者也。
所谓五脏者，藏精气而不泻也，故满而不能实；六腑者，传化物而不藏，故实而不能满。
所以然者，水谷入口，则胃实而肠虚，食下，则肠实而胃虚，故曰实而不满，满而不实也。
《阴阳应象大论》云∶谷气通于脾。
六经为川，肠胃为海，九窍为水注之气。
九窍者，五脏主之。
五脏皆得胃气，乃能通利。
《通评虚实论》云∶头痛耳鸣，九窍不利，肠胃之所生也。
胃气一虚，耳目口鼻，俱为之病。
《经脉别论》云∶食气入胃，散精于肝，淫气于筋。
食气入胃，浊气归心，淫精于脉。
脉气流经，经气归于肺，肺朝百脉，输精于皮毛。
毛脉合精，行气于腑，腑精神明，留于四脏。
大黄黄连泻心汤、理中丸对消炎痛型、醋酸涂抹型胃溃疡寒、热证模型大鼠血清COR含量的影响
大黄黄连泻心汤、理中丸对消炎痛型、醋酸涂抹型胃溃疡寒、热证模型大鼠血清COR含量的影响张洋;柴剑波;李胜志;高彦宇;肖洪彬;李冀【摘要】目的探讨消炎痛型、醋酸涂抹型胃溃疡中医寒、热证模型的形成机制及寒、热方剂对胃溃疡寒、热证模型的基本作用机理并进一步探讨方证相应的客观规律.方法采用寒、热因素结合腹腔注射消炎痛、醋酸涂抹法分别建立大鼠胃溃疡寒、热证动物模型,采用酶联免疫法检测各实验组受试大鼠血清COR的含量.结果各组模型中,热消组、单热组、热醋组、热假组与空白对照组比较,COR的含量明显升高(P＜0.05或P＜0.01).可见,各模型均以热因素表达明显,可作为溃疡热证的微观指征.寒性方剂大黄黄连泻心汤可显著降低热性模型的血清COR含量(P＜0.05或P＜0.01)；理中丸对血清COR的含量影响不显著(P＞0.05).结论通过“方证相应”理论验证了“病证结合”的胃溃疡寒、热模型复制成功,模型间血清COR含量的差异特异性出现在热模型上.寒性方剂大黄黄连泻心汤对热性溃疡的治疗作用,可通过抑制大鼠血清皮质醇的分泌而实现.【期刊名称】《中医药信息》【年(卷),期】2011(028)004【总页数】3页(P23-25)【关键词】大黄黄连泻心汤理中丸胃溃疡寒;热证皮质醇(COR)【作者】张洋;柴剑波;李胜志;高彦宇;肖洪彬;李冀【作者单位】黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040;黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040【正文语种】中文【中图分类】R285.5本研究是在“病证结合”理论基础上，将消化性溃疡病与中医寒、热证相结合，创建实验性胃溃疡寒、热证型动物模型，通过对寒、热证型规律观察揭示胃溃疡寒、热证证候实质，探究寒、热性质不同的方剂对相应模型的作用机制及方证相应规律。
秘方偏方：这是一个救命神方!
这是一个救命神方！小续命汤出自《备急干金要方》卷八，组方：麻黄桂心甘草（各二两）生姜（五两）人参川芎杏仁附子防己芍药黄芩（各一两）防风（一两半）上十二味，以水一斗二升，先煮麻黄三沸去沫．纳诸药，煮取三升，分三服；不愈更合三、四剂。
功效：祛风扶正。
主治：中风卒起，筋脉拘急，半身不遂，口目不正，舌强不能语，或神志闷乱等。
初涉此方读大学时看《备急干金要方》，得闻小续命汤，为“续命”所感，视为奇方！后学西医内科学，始知中风即现代所说的“脑血管意外”，既是血压高脑血管破裂，或是脑血管梗死，何来风邪？既无外风可言，用麻黄、防风，能有效乎？况且麻黄服用后容易出现血压增高，对于脑血管破裂之人，再投此方似乎不妥？然此方名为“续命”，当不为浪得虚名，唯其中妙处尚有不明之处，故本人对此方虽有敬重之心，实无尝试之胆啊！再闻此方去年读李可老中医的演讲稿，书中提到李老因小中风，服用几贴小续命汤后已无大碍，但不方便过来参加会议，其演讲稿由弟子代述……这句话引起了我的兴趣，难道这小续命汤真的疗效神奇？很多医家对中风的治疗从风论治，而王清任则以补阳还五汤立法，开活血化瘀治疗中风之门，将小续命汤与补阳还五汤比较起来，似乎没有更加有特点的地方，补益之力不及对方大剂量黄芪，活血之力就更加不及对方大量的活血化瘀药，何来“续命”之说？读懂“续命汤”半年前一个外地患者前来就诊，因脑血管瘤破裂致脑出血，术后两年留下左半身不遂的毛病，走路不稳，时常崴脚，左手五指关节活动障碍，肌力II级+，舌根白厚，略滑，双尺沉紧，关郁，寸部虚细弱无，四诊资料收集全后，开了如下几味药：制川乌、制草乌、丹参、桂枝、地龙、豨签草、黄芪、黄芩、赤芍、桃仁、红花、木香、生甘草。
同时叮嘱患者每天用手抓玻璃弹珠，加强功能锻炼。
十多天后，左侧肢体恢复不少，手指关节能自由活动，但精细度差，脉象虽然有所好转，但双寸仍然沉细，头经常发昏，如何加快治疗进程？思索之际，突然记起李老亲身体验小续命汤的事情，再结合病人的脉象，为什么偏瘫后重用麻黄，立即豁然开朗。
化栓通脉方调节自噬抗动脉粥样硬化的实验研究
2194 环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October 2023,Vol.16,No.11㊃基础研究㊃基金项目:国家中医心血管病临床医学研究中心专项科研基金(CMC2022010);国家自然科学基金联合基金(U22A20372)作者单位:100029 北京中医药大学研究生院[路爱梅(硕士研究生)㊁李洪峥(博士研究生)㊁彭煜暄(硕士研究生)];中国中医科学院西苑医院心血管科[杨文文(博士研究生)㊁魏玥(硕士研究生)㊁曲华㊁付长庚],老年病科(龙霖梓);北京了未元中医药研究有限公司(吴汉涛)作者简介:路爱梅(1996-),2021级在读硕士研究生㊂研究方向:中西医结合心血管疾病研究㊂E⁃mail:570633591@ 通信作者:付长庚(1981-),博士,主任医师,博士生导师㊂研究方向:中西医结合心血管疾病研究㊂E⁃mail:fucgbs@化栓通脉方调节自噬抗动脉粥样硬化的实验研究路爱梅 李洪峥 杨文文 彭煜暄 魏玥 龙霖梓 曲华 吴汉涛 付长庚【摘要】 目的 观察化栓通脉方对ApoE 基因敲除(ApoE knockdown,ApoE -/-)小鼠动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的影响,并初步研究其抗AS 的作用机制㊂方法 10只8周龄C57BL /6J 小鼠设为对照组,全程普通饲料喂养;43只同品系ApoE -/-小鼠高脂饲料喂养8周制备体内AS 模型㊂造模成功后随机分为4组:模型组㊁辛伐他汀组(3mg /kg)㊁化栓通脉方低剂量组(6g /kg)㊁化栓通脉方高剂量组(12g /kg)㊂第9周各组开始相应药物灌胃,对照组和模型组采用等体积生理盐水,连续灌胃6周后分离血清和主动脉㊂使用全自动生化分析仪测定各组血清总胆固醇(total cholesterol,TC)㊁甘油三酯(triglyceride,TG)㊁低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL⁃C)㊁高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL⁃C)水平;采用ELISA 法检测各组血清白细胞介素(interleukin,IL)⁃1β㊁γ干扰素(interferon gamma,IFN⁃γ)㊁IL⁃10㊁IL⁃4水平;采用油红O 染色评价整体主动脉内膜斑块分布情况并测定相对斑块面积;采用苏木素 伊红染色评价主动脉窦斑块病理形态并量化斑块区域;采用Russell⁃Movat 染色分析小鼠主动脉窦斑块成分;采用免疫荧光染色检测小鼠主动脉窦组织溶酶体关联膜蛋白2(lysosomal associated membrane protein 2,LAMP2)㊁轻链蛋白3A /B(light chain 3A /B,LC3A /B)㊁P62蛋白的表达㊂结果 化栓通脉方调节血脂效果较为突出,可明显降低AS 小鼠血清TC㊁TG㊁LDL⁃C 水平,提升HDL⁃C 水平,高㊁低剂量组都显示出显著的优势(P <0.01);相比于模型组,化栓通脉方高剂量组血清中IL⁃1β㊁IFN⁃γ含量显著降低,斑块面积㊁泡沫细胞和胶原纤维相对占比明显减小,P62蛋白表达显著减少,IL⁃10㊁IL⁃4含量显著升高,LAMP2㊁LC3A /B 表达明显增加,差异具有统计学意义(均P <0.05)㊂结论 化栓通脉方可显著调节AS 小鼠血脂和炎症因子水平,减少主动脉组织中泡沫细胞㊁胶原纤维和斑块的生成,通过促进LC3A /B㊁LAMP2的表达和P62的降解,调控细胞自噬,从而延缓AS 的发生发展㊂【关键词】 化栓通脉方; 动脉粥样硬化; 自噬; 降脂; 抗炎【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2023.11.006Experimental study of Huashuan Tongmai decoction regulating autophagy against atherosclerosis LU Aimei ,LI Hongzheng ,YANG Wenwen ,PENG Yuxuan ,WEI Yue ,LONG Linzi ,QU Hua ,WU Hantao ,FU ChanggengThe Graduate School of Beijing University of Chinese Medicine ,Beijing 100029,China Corresponding author :FU Changgeng ,E⁃mail :fucgbs@【Abstract 】 Objective To observe the effect of Huashuan Tongmai decoction on atherosclerosis环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.112195 (AS)in ApoE knockout(ApoE knockdown,ApoE-/-)mice,and to study the mechanism of action againstAS.Methods 108-week⁃old C57BL/6J mice were treated as the control group and fed general diet,and43ApoE-/-mice were fed high⁃fat diet for8weeks to prepare in vivo AS model.After successful modelmaking,they were randomly divided into4groups:model group,Simvastatin group(3mg/kg),low dosegroup(6g/kg),and high dose group(12g/kg)of Huashuan Tongmai decoction.On week9,the controlgroup and the model group were received volume saline intragastric administration,the other groups weretreated with the drug intragastric administration,and serum and aorta were obtained after continuous gavagefor6weeks.The serum levels of TC,TG,LDL⁃C,and HDL⁃C in each group were determined by an automatic biochemical analyzer;the serum levels of IL⁃1β,IFN⁃γ,IL⁃10,and IL⁃4in each group were measured by ELISA;oil red O staining was used to evaluate the overall aortic endometrial plaque distribution and determine the relative plaque area;the method of Hematoxylin⁃eosin(HE)staining wasused to evaluate the aortic sinus plaque pathological morphology and quantify the plaque areas;the plaque components of the mouse aortic sinus were analyzed by Russell⁃Movat staining;the expression of LAMP2,LC3A/B,and P62in mice aortic sinus tissues were detected by immunofluorescence staining.Results The effect of Huashuan Tongmai decoction was prominent,which could significantly decreased the levels ofTC,TG,and LDL⁃C,and increased the level of HDL⁃C in AS mice serum,both the high and the low dosegroups showed significant advantages(P<0.01);compared with the model group,the high dose groupwas decreased significantly in the levels of IL⁃1βand IFN⁃γ,plaque area,the relative proportion of foamcells and collagen fibers,and the expression of P62,meanwhile,increased significantly in the levels ofIL⁃10and IL⁃4,and the expression of LAMP2and LC3A/B(P<0.05).Conclusion Huashuan Tongmai decoction can significantly regulate serum lipids and inflammatory factors in AS mice,reduce the generationof foam cells,collagen fibers and plaques in aortic tissue,and regulate cell autophagy by promoting the expression of LC3A/B and LAMP2and depressing the expression of P62,thus delaying the occurrence and development of AS.【Key words】 Huashuan Tongma decoction; atherosclerosis; autophagy; lipid⁃lowering; anti⁃inflammation 2019年全球疾病负担研究结果表明,以缺血性心脏病和卒中为主的动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease,ASCVD)是引起全球人口死亡的首要原因,占全球总死亡人数的三分之一[1],给人类健康带来严重的危害㊂动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是ASCVD的病理基础,其成因复杂,其中脂质代谢紊乱㊁免疫和炎症贯穿AS病变始终[2⁃3]㊂自噬是在自噬相关基因的调控下,利用溶酶体自我降解后再利用,维持细胞能量稳态的过程[4],对AS的调控更具有双向作用 在AS早期内皮通过自噬调节脂质代谢㊁减轻炎症反应,从而抑制斑块的形成,晚期随着斑块的进展而变得功能失调[5]㊂因此,维持自噬的动态平衡对抑制AS的恶性发展极为重要㊂化栓通脉方是本课题组根据临床治疗AS患者总结而来的经验方,用于改善冠状动脉㊁颈动脉粥样硬化斑块,临床疗效确切㊂但其在动物体内研究中,是否具有抗AS效应及其作用机制有待进一步研究㊂有鉴于此,本实验从血清脂蛋白㊁炎症因子㊁斑块面积等方面,综合评价化栓通脉方调节ApoE 基因敲除(ApoE knockdown,ApoE-/-)小鼠主动脉粥样硬化斑块的效应,并初步探索其是否通过调控自噬而发挥抗AS作用㊂1 材料与方法1.1 实验动物及实验环境8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠10只,同品系ApoE-/-小鼠43只,体质量(22±2)g,购于斯贝福(北京)生物技术有限公司[许可证号:SCXK(京) 2019⁃0010]㊂小鼠饲养于北京了未元医药科技公司动物实验中心[许可证号:SYXK(京)2022⁃0007],温度(22±2)℃,湿度(50±10)%,明/暗周期(12/12)小时㊂动物自由进食㊁饮水㊂动物伦理审查批号:SYXK2022⁃0007㊂高脂饲料(83.5%基础饲料+15%猪油+1.5%胆固醇)和普通饲料均由北京华阜康生物科技有限公司[许可证号:SCXK(京)2019⁃0008]提供㊂实验过程中,动物灌胃致死3只,剔除各组离群2196 环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.11值,各组统计数量均为7只㊂1.2 实验药物辛伐他汀片(杭州默沙东制药有限公司,规格:20mg/片,批号:U04517)㊂化栓通脉方药物组成及剂量:金银花15g㊁山楂15g㊁鸡血藤15g㊁制何首乌15g㊁生白芍7.5g㊁生甘草4g㊂中药饮片皆购于九州通医药集团股份有限公司,经北京中医药大学吴嘉瑞教授鉴定,均符合2020版‘中国药典“要求㊂辛伐他汀片用生理盐水配置成混悬液,浓度为0.3mg/mL㊂化栓通脉方各药物按组方比例,称取715g,用2000mL蒸馏水煎煮2次,然后浓缩至715mL的中药混悬液,每毫升含生药量1g,浓度为1g/mL,4℃保存,备用㊂用药剂量参考公式:高剂量给药剂量=成人(70kg)临床常用量×12(按人 小鼠体表面积折算等效剂量系数)㊂以成人(70kg)每日金银花15g㊁山楂15g㊁鸡血藤15g㊁制何首乌15g㊁生白芍7.5g㊁生甘草4g,共71.5g,生药计算高剂量组小鼠每日等效剂量为12g/kg,高㊁低剂量组给药剂量按2∶1设置,低剂量组小鼠每日给药剂量为6g/kg㊂辛伐他汀片成人给药剂量为每日20mg,换算获得辛伐他汀组小鼠每日灌胃剂量为3mg/kg㊂1.3 主要试剂与仪器白细胞介素(interleukin,IL)⁃1β㊁γ干扰素(interferon gamma,IFN⁃γ)㊁IL⁃10㊁IL⁃4ELISA试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司,批号分别为EK201BHS⁃96㊁EK280/3⁃96㊁EK210/4⁃96㊁EK204HS⁃96);油红O染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号G1016);苏木素 伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号G1120);Russell改良Movat五色染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,批号G3701);抗⁃SQSTM1/ P62兔pAb㊁抗⁃LAMP2兔pAb㊁抗LC⁃3A/B兔pAb (武汉赛维尔生物科技有限公司,批号分别为GB11239⁃1㊁GB11330㊁GB11124)㊂台式高速冷冻离心机(大龙,型号D3024R),酶标检测仪(美国BioTeK公司,型号Epoch),全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科技,型号分别为Chemray240㊁420㊁800),荧光显微镜(宁波舜宇仪器有限公司,型号2204926),光学显微镜(DMi1,型号Leica),组织切片机(浙江省金华市科迪仪器公司,型号KD⁃ST5500)㊂1.4 动物分组㊁给药及取材适应性喂养1周,10只C57BL/6J小鼠作为对照组,全程采用普通维持饲料喂养㊂43只ApoE⁃/⁃小鼠采用高脂饲料喂养8周后,随机抽取3只取材,主动脉窦病理切片HE染色显示:主动脉管腔狭窄,内膜明显增厚,有明显斑块形成,提示早期AS体内模型建立成功㊂造模后的ApoE-/-小鼠随机分为4组:模型组㊁辛伐他汀组(3mg/kg)㊁化栓通脉方低剂量组(6g/kg)㊁化栓通脉方高剂量组(12g/kg),每组10只,继续高脂饲料喂养,用药组同时予以相应药物灌胃,对照组和模型组予等体积生理盐水灌胃以保证组间一致性,每日灌胃1次,连续6周㊂最后一次灌胃后,禁食㊁不禁水12小时㊂用3%戊巴比妥钠腹腔麻醉,球后静脉(眼眶静脉丛)取血,室温静置2小时,4℃4000r/min离心10分钟,分离上层血清,-80℃下冻存㊂取血后打开小鼠胸腔及腹腔,经PBS充分灌流,整体分离自主动脉根部至髂总动脉分叉处主动脉,并剥离周围多余结缔组织和脂肪组织,投入液氮或组织固定液中保存,用于后续相关实验㊂1.5 指标检测1.5.1 酶标法测定小鼠血脂水平 每组取7只小鼠,使用全自动生化分析仪测定各组小鼠血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)㊁甘油三酯(triglyceride,TG)㊁低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL⁃C)㊁高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL⁃C)的水平㊂1.5.2 ELISA法检测血清炎症因子水平 每组取7只小鼠,根据ELISA试剂盒说明书操作,检测小鼠血清中IL⁃1β㊁IFN⁃γ㊁IL⁃10㊁IL⁃4的水平㊂1.5.3 大体油红O染色测定整体主动脉相对斑块面积 每组取3只小鼠,在光学显微镜下将小鼠主动脉纵剖面固定,水洗,油红O染色后将血管平铺于黑色橡胶板,迅速拍照,利用Image J软件分析以主动脉相对斑块面积来评价主动脉斑块严重程度㊂相对斑块面积(%)=主动脉斑块面积/血管内膜总面积×100%㊂1.5.4 HE染色评价主动脉窦病理形态 每组取3只小鼠,4%多聚甲醛固定主动脉于4℃冰箱24小时,梯度脱水后石蜡包埋,并连续切片(5μm),HE 常规染色后封片拍照,于光学显微镜下检测AS小鼠主动脉窦病理形态的变化,测量并计算斑块面积占血管内膜面积百分比㊂相对斑块面积(%)=斑块环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.112197面积/内膜总面积×100%㊂1.5.5 Russell⁃Movat染色评价主动脉窦斑块成分 每组取3只小鼠,主动脉石蜡切片处理,切片厚度5μm,连续切片至观察到3个主动脉瓣完全融合开始留取10张切片,切片脱蜡至水,经五色法染液进行染色,脱水封片,在光学显微镜下观察主动脉窦斑块各成分变化,染色后的细胞核和弹性纤维呈黑色,胶原纤维呈红色,泡沫细胞呈淡紫色,蛋白聚糖呈蓝色㊂测量并计算斑块内泡沫细胞及胶原纤维的占比㊂1.5.6 免疫荧光法评价主动脉窦溶酶体关联膜蛋白2(lysosomal associated membrane protein2, LAMP2)㊁轻链蛋白3A/B(light chain3A/B,LC3A/ B)㊁P62蛋白的表达 每组取3只小鼠,主动脉窦石蜡切片,常规脱蜡㊁水化㊁抗原修复后,血清室温封闭30分钟,滴加一抗4℃孵育过夜,PBS浸洗3次,次日滴加荧光二抗25℃避光孵育1小时,PBS浸洗3次,滴加DAPI避光孵育5分钟复染细胞核,PBS 浸洗4次,最后用含抗荧光的淬灭剂封片㊂使用荧光显微镜观察主动脉窦的LAMP2㊁LC3A/B㊁P62蛋白荧光表达,并采集图像,利用Image J分析处理数据㊂1.6 统计学方法实验所得数据为计量资料,使用SPSS24.0统计软件进行处理㊂数据经检验均符合正态分布且方差齐,以均数±标准差(x±s)表示㊂多组间比较采用单因素方差分析,两两比较用LSD法,P<0.05表示差异具有统计学意义㊂2 结果2.1 化栓通脉方对小鼠血脂水平的影响相比于对照组,模型组小鼠血清中TC㊁TG㊁LDL⁃C水平明显升高,HDL⁃C水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);相比于模型组,辛伐他汀组和化栓通脉方低㊁高剂量组血清中TC㊁TG㊁LDL⁃C水平均显著降低,HDL⁃C水平均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)㊂见表1㊂2.2 化栓通脉方对小鼠血清炎症因子水平的影响与对照组相比,模型组血清中IL⁃1β㊁IFN⁃γ含量显著上升,差异具有统计学意义(P<0.01), IL⁃10㊁IL⁃4含量也有所升高,但无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,化栓通脉方高剂量组血清中IL⁃1β㊁IFN⁃γ含量显著降低,IL⁃10㊁IL⁃4含量显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);化栓通脉方低剂量组较模型组IFN⁃γ含量降低,IL⁃4含量升高,差异有统计学意义(P<0.01),IL⁃1β含量降低, IL⁃10含量升高,差异无统计学意义(P>0.05)㊂见表2㊂表1 各组AS模型小鼠血脂水平比较(x±s,mmol/L)组别鼠只TC TG LDL⁃C HDL⁃C对照组7 2.75±0.160.66±0.030.36±0.03 1.99±0.10模型组724.74±0.96b 4.17±0.34b15.28±1.50b 1.43±0.30a 辛伐他汀组717.88±2.90bc 2.21±1.07bc11.13±1.66bc 2.96±0.82bc 化栓通脉方低剂量组718.74±2.23bc 2.06±0.45bc11.82±2.23bc 2.83±0.31bc 化栓通脉方高剂量组718.21±1.37bc 1.44±0.35ac10.17±2.16bc 3.39±0.52bc 注:与对照组相比,a P<0.05,b P<0.01;与模型组相比,c P<0.01㊂表2 各组AS模型小鼠血清炎症因子比较(x±s,pg/mL)组别鼠只IL⁃1βIFN⁃γIL⁃10IL⁃4对照组70.61±0.3153.44±21.3435.66±18.26 1.30±0.31模型组7 5.97±1.65a214.70±87.64a72.92±28.44 2.89±0.85辛伐他汀组7 3.93±2.06ab129.80±95.78b90.36±28.06a7.64±5.92化栓通脉方低剂量组7 4.79±2.05a61.71±21.39b93.33±33.28a11.81±4.02ab 化栓通脉方高剂量组7 2.03±0.74b61.89±23.34b140.80±59.54ab22.24±7.69ab 注:与对照组相比,a P<0.05;与模型组相比,b P<0.01㊂2198 环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.112.3 化栓通脉方对小鼠整体主动脉斑块面积的影响主动脉大体油红O染色显示,对照组小鼠主动脉血管壁大体光滑㊁平整,呈半透明状,见有少量点状斑块散在分布;高脂饲料喂养14周,模型组小鼠主动脉管腔病理性扩增,管壁存在大量的红染的点片状脂质斑块,且多分布在主动脉弓及血管分叉处㊂相比对照组,模型组主动脉窦部斑块面积明显增加(P<0.01);相比模型组,化栓通脉方低㊁高剂量组小鼠主动脉窦部斑块面积均明显减少(P<0.01)㊂见图1及表3㊂2.4 化栓通脉方对小鼠主动脉窦病理形态的影响主动脉窦HE染色显示,对照组小鼠主动脉内膜光滑完整,内膜下无明显泡沫细胞和脂质沉积形成,中层平滑肌细胞排列整齐;模型组小鼠主动脉内膜增厚明显,内膜下可见大量泡沫细胞和脂质沉积,中层平滑肌细胞增殖且排列紊乱;与模型组相比,化栓通脉方高剂量干预后,小鼠主动脉窦内膜厚度㊁泡沫细胞数量及脂质沉积明显减轻(P<0.01)㊂见图2,表4㊂表3 各组小鼠AS模型小鼠斑块面积占比(大体油红O染色)(x±s)组别鼠只主动脉相对斑块面积占比(%)对照组3 1.98±0.98模型组312.55±4.05a辛伐他汀组3 2.65±0.99b化栓通脉方低剂量组3 6.46±3.31b化栓通脉方高剂量组3 2.75±0.29b注:与对照组相比,a P<0.05;与模型组相比,b P<0.01㊂注:A对照组;B模型组;C辛伐他汀组;D化栓通脉方低剂量组;E化栓通脉方高剂量组㊂图1 各组AS模型小鼠主动脉大体油红O染色结果注:A对照组;B模型组;C辛伐他汀组;D化栓通脉方低剂量组;E化栓通脉方高剂量组㊂图2 各组AS模型小鼠主动脉窦HE染色结果(×100)环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.112199表4 各组小鼠AS模型小鼠斑块面积及成分占比(x±s)组别鼠只主动脉窦相对斑块占比(HE染色,%)泡沫细胞占比(Movat染色,%)胶原纤维占比(Movat染色,%)对照组3000模型组351.00±4.00a17.00±2.00a18.33±2.08a 辛伐他汀组336.80±1.76ab12.00±2.94ab9.75±3.50ab 化栓通脉方低剂量组332.40±7.96ab13.80±3.56a11.33±0.58ab 化栓通脉方高剂量组325.67±10.40ab11.00±4.00ab8.33±1.53ab 注:与对照组相比,a P<0.05;与模型组相比,b P<0.01㊂ 主动脉窦Russell⁃Movat染色结果显示,对照组内膜未见明显斑块,内皮细胞结构完整,弹力纤维弯曲连续,富有弹性,中膜血管平滑肌排列整齐,周围分布少量胶原纤维和网状纤维结构;模型组可见内膜斑块显著突向管腔,斑块内部有大量泡沫细胞和脂质堆积,斑块表面有大量炎症细胞浸润黏附,平滑肌细胞大量增生,排列紊乱,血管中膜失去连续性,弹力纤维绷直㊁失去弹性,胶原纤维㊁网状纤维排布错乱㊂化栓通脉方干预后主动脉窦Movat染色显示:斑块炎症细胞浸润黏附有所减轻,脂质堆积有所减少,胶原纤维结构稳定,覆盖包裹在脂质表面,血管中膜连续性较模型组有所改善(P<0.05),表明化栓通脉方促进斑块稳定,减少AS的发展㊂见图3,表4㊂2.5 化栓通脉方对小鼠主动脉窦自噬相关蛋白表达的影响免疫荧光结果显示,与对照组相比,模型组小鼠主动脉中LAMP2㊁LC3A/B㊁P62的表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,化栓通脉方高剂量干预后,AS模型小鼠主动脉窦中LAMP2㊁LC3A/B表达升高(P<0.01),P62的表达降低(P>0.05)㊂见图4,表5㊂3 讨论在AS的中医药防治中,瘀与毒是导致易损斑块形成及破裂的主要病理因素㊂稳定斑块和血栓属于 内阻瘀血”,各种炎症因子属于 内生毒邪”,瘀为常,毒为变,由常生变,因瘀致毒,毒瘀互结,AS 易损斑块在瘀血基础上 毒邪”致病,治当以解毒化瘀[6⁃9]㊂化栓通脉方以金银花为君,解毒清热,直击病本;山楂行气散瘀化浊,鸡血藤祛瘀养血通络,制何首乌㊁白芍养血益精,敛阴止痛,共为臣药;甘草清热解毒,调和诸药㊂上述药物合用,共奏解毒化瘀㊁养血通络之效㊂注:A对照组;B模型组;C辛伐他汀组;D化栓通脉方低剂量组;E化栓通脉方高剂量组㊂图3 各组AS模型小鼠主动脉窦Movat染色结果(×100)表5 各组AS模型小鼠主动脉窦自噬蛋白表达情况比较(x±s)组别鼠只P62LC3A/B LAMP2对照组3 1.98±0.987.04±0.2938.23±8.04模型组312.55±4.05b10.60±2.7866.13±16.30a 辛伐他汀组3 2.65±0.99ac14.27±3.93b108.60±15.36bc 化栓通脉方低剂量组3 6.46±3.31b8.66±0.6573.54±8.85b 化栓通脉方高剂量组3 2.75±0.29b17.05±2.34bc109.80±8.34bc 注:与对照组相比,a P<0.05,b P<0.01;与模型组相比,c P<0.01㊂2200 环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October 2023,Vol.16,No.11注:A 对照组;B 模型组;C 辛伐他汀组;D 化栓通脉方低剂量组;E 化栓通脉方高剂量组㊂图4 各组AS 模型小鼠主动脉窦免疫荧光染色结果(×100) 现代药理学研究指出,化栓通脉方通过多成分㊁多靶点㊁多途径,发挥抗AS 作用 金银花㊁山楂㊁鸡血藤㊁白芍都具有抗炎㊁抗氧化㊁抗血小板聚集的作用[10⁃12],山楂还可调节血脂代谢及改善血管内皮功能,鸡血藤可调节造血系统[13⁃14],制何首乌可补血㊁抗衰老㊁降血脂[15],白芍可通过调节免疫㊁抑制细胞凋亡㊁促进胆固醇流出等途径抗AS [16⁃17]㊂由此可知,化栓通脉方中药物成分可能通过抑制斑块内炎症反应㊁改善脂质代谢和血流动力学,从而降低斑块恶化破裂风险㊂故本研究旨在通过探讨化栓通脉方对ApoE -/-小鼠抗AS 的作用及其机制,为其临床应用提供理论依据和数据支撑㊂3.1 化栓通脉方通过降脂㊁抗炎实现抗AS 作用AS 是一种慢性炎症性血管疾病,脂质代谢紊乱与炎症因子升高会导致血管内皮功能受损,引起血管内壁脂质堆积及斑块和血栓的形成,与AS 的生成与发展密切相关[3,18],促炎和抗炎机制的平衡决定着AS 的结局,是病情转化和恶化的关键[19]㊂有鉴于此,调节血脂代谢㊁抑制炎症反应在AS 的治疗中占有重要地位㊂本研究表明,化栓通脉方可调节血清脂蛋白㊁炎症因子水平㊂研究结果指出,相比于模型组,高㊁低剂量化栓通脉方组血清中TC㊁TG㊁LDL⁃C 水平均显著下降,HDL⁃C 水平显著上升,促炎因子IL⁃1β㊁IFN⁃γ含量降低,抑炎因子IL⁃10㊁IL⁃4含量升高,斑块面积㊁泡沫细胞和胶原纤维相对占比明显减小,且随化栓通脉方浓度升高而存在一定差异㊂由此表明,化栓通脉方可能通过调节血脂代谢㊁降低血清炎症因子水平,减少主动脉斑块面积,实现抗AS 作用㊂3.2 化栓通脉方抗AS 作用可能与诱导细胞自噬有关自噬是细胞自身的分解代谢机制,对AS 具有重要影响,其水平主要通过自噬标志物(自噬体和自噬溶酶体)和自噬蛋白标志物的水平进行评价[20⁃21]㊂自噬体作为自噬过程的标志性结构,是检测自噬的唯一金标准,而LC3是最可靠的自噬体标志物,其表达水平与自噬体数量呈正相关;LAMP2是溶酶体标志物,其表达水平与自噬溶酶体亦呈正相关;P62是自噬的特异性底物,其表达水平与自噬潮呈负相关㊂本研究免疫荧光结果显示,模型组较对照组具有高水平的LC3A /B㊁LAMP2共定位,表明自噬的募集是对新兴斑块的应激反应㊂化栓通脉方组较模型组LC3A /B㊁LAMP2的表达上调㊁P62的表达下调,且高剂量组比低剂量组自噬蛋白表达更为显著,表明化栓通脉方可增加自噬通量,升高自噬水平,起到抗AS 作用,并与剂量呈相关关系㊂综上所述,化栓通脉方可能通过诱导细胞自环球中医药2023年11月第16卷第11期 Global Traditional Chinese Medicine,October2023,Vol.16,No.112201噬,调节脂质代谢㊁减弱炎症反应,从而抑制斑块形成与进展,达到防治AS的作用,具体机制通路有待进一步实验验证㊂参考文献[1] Roth G A,Mensah G A,Johnson C O,et al.Global burden ofcardiovascular diseases and risk factors,1990⁃2019:update fromthe GBD2019study[J].J Am Coll Cardiol,2020,76(25):2982⁃3021.[2] Wolf D,Ley K.Immunity and Inflammation inAtherosclerosis[J].Circ Res,2019,124(2):315⁃327.[3] LU Y,CUI X,ZHANG L,et al.The Functional Role ofLipoproteins in Atherosclerosis:Novel Directions for Diagnosisand TargetingTherapy[J].Aging Dis,2022,13(2):491⁃520.[4] Kim K H,Lee M S.Autophagy⁃a key player in cellular andbodymetabolism[J].Nat Rev Endocrinol,2014,10(6):322⁃337.[5] Ouimet M,Ediriweera H,Afonso M S,et al.microRNA⁃33Regulates Macrophage Autophagy in Atherosclerosis[J].Arterioscler Thromb Vasc,Biol,2017,37(6):1058⁃1067. [6] 徐浩,史大卓,殷惠军,等. 瘀毒致变”与急性心血管事件:假说的提出与临床意义[J].中国中西医结合杂志,2008,28(10):934⁃938.[7] 史大卓,徐浩,殷惠军,等. 瘀”㊁ 毒”从化 心脑血管血栓性疾病病因病机[J].中西医结合学报,2008,6(11):1105⁃1108.[8] 张莹,马晓娟,史大卓.冠心病瘀毒理论与血小板 血栓 炎症网络[J].中国中西医结合杂志,2018,38(3):375⁃378. [9] 王铭铭,李平,李瑞杰,等.基于心脉癥瘕谈慢性冠脉综合征的中医病因病机[J].环球中医药,2023,16(1):103⁃106. [10] 熊乐文,金莹,王彦予,等.金银花酚酸类化学成分㊁药理活性及体内代谢研究进展[J].中成药,2022,44(3):864⁃871.[11] 吴娇,王聪,于海川.金银花中的化学成分及其药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2019,25(4):225⁃234. [12] 杜叶青,段治康,董舒卉,等.基于网络药理学的金银花活性成分抗炎作用机制的研究[J].中国药物化学杂志,2019,29(2):96⁃102.[13] 秦双双,朱艳霞,韦坤华,等.鸡血藤的本草沿革与黄酮类成分及其药理学研究进展[J].中国中药杂志,2018,43(11):2216⁃2223.[14] 王春丽,潘春柳,姚李祥,等.鸡血藤的化学成分和药理作用研究进展[J].现代中药研究与实践,2021,35(2):96⁃102. [15] 林艳,肖榕,李春,等.生/制/发酵何首乌化学成分㊁药理作用及肝毒性研究进展[J].中药新药与临床药理,2018,29(5):661⁃672.[16] 杨山景,封安杰,孙越,等.白芍总苷的药理作用及机制研究进展[J].中国现代应用药学,2021,38(13):1627⁃1633. [17] 徐佳新,许浚,曹勇,等.中药白芍现代研究进展及其质量标志物的预测分析[J].中国中药杂志,2021,46(21):5486⁃5495.[18] Soehnlein O,Libby P.Targeting inflammation in atherosclerosis⁃from experimental insights to theclinic[J].Nat Rev DrugDiscov,2021,20(8):589⁃610.[19] Bäck M,Yurdagul A Jr,Tabas I,et al.Inflammation and itsresolution in atherosclerosis:mediators and therapeuticopportunities[J].Nat Rev Cardiol,2019,16(7):389⁃406. [20] XU F,LI X,HUANG X,et al.Development of a pH⁃responsivepolymersome inducing endoplasmic reticulum stress and autoph⁃agyblockade[J].Sci Adv,2020,6(31):eabb8725. [21] HAN B,HE C.Targeting autophagy using saponins as atherapeutic and preventive strategy against humandiseases[J].Pharmacol Res,2021,166:105428.(收稿日期:2023⁃06⁃22)(本文编辑:张楠)。
四君子汤治疗酒精性肝损伤的效果及其机制
讨四君子 汤 调 节 肠 道 菌 群 治 疗 ALD 的 疗 效,为 四
君子汤治疗酒精性肝病提供实验依据。现将结果报
以及脾指数,肝指数 = 肝脏湿质量/体质量 ×100% ,
告如下。
1.
6 小鼠血清生化指标检测
取各组小鼠眼球所取血液,分离血清,并使用全
1 材料与方法
oana
lzLeabharlann ethechange
si
ni
n
t
e
s
t
i
na
lf
l
o
r
aby16SrDNAgenes
equenc
i
ng.Af
t
e
rane
s
t
he
s
i
a,b
l
oodwa
sc
o
l
l
e
c
t
ed
y
f
r
omt
hec
an
t
hus,ands
e
r
um wa
sc
o
l
l
e
c
t
edf
o
ri
n
t
e
s
t
i
na
lpe
rme
ab
i
l
韩亚斐3
周泉3
陈雪红1
吕秋兰3
姚如永3
(
1 青岛大学基础医学院医学药理学系,山东 青岛 266071; 2 青岛大学附属医院中医科; 3 青岛大学附属医院医学研究中心)
[摘要] 目的
探讨四君子汤治疗酒精性肝损伤的效果及其机制。方法
益经汤对环磷酰胺所致卵巢早衰小鼠的治疗作用研究
广东药科大学学报Journal of Guangdong Pharmaceutical University Jan, 2024, 40(1)益经汤对环磷酰胺所致卵巢早衰小鼠的治疗作用研究牛逸琳1，陈烁1，陈雨诗1，何冬梅2，尹永芹1（1.广东药科大学，广东广州 510006； 2.惠州市中医医院，广东惠州 516001）摘要：目的探究中药复方益经汤对环磷酰胺（CTX）所致卵巢早衰（POF）小鼠的治疗作用。
方法腹腔注射CTX 建立POF小鼠模型，随机分为模型组、阳性对照组、益经汤低、高剂量组和空白组，每组6只，灌胃给药 30 d。
检测小鼠动情周期、体质量，卵巢、子宫指数和组织形态变化；ELISA检测血清中雌二醇（E）、促卵泡刺激素（FSH）、促黄体2生成素（LH）、抗缪勒氏管激素（AMH）、孕酮（PROG）的浓度；免疫组织化学法（IHC）检测卵巢PI3K、AKT、FOXO3A 蛋白表达水平。
结果益经汤干预模型小鼠后，动情周期趋向正常，高剂量组体质量、卵巢指数、子宫指数皆显著升高（P<0.05）；卵巢体积增大，初级和次级卵泡数量增多，细胞纤维化改善；子宫内膜增厚，恢复子宫腺上皮细胞排列；阳性对照组和益经汤高剂量组血清E、AMH、PROG均升高（P<0.05，P<0.01），FSH、LH显著下降（P<0.01）。
2益经汤组和阳性对照组PI3K、AKT、FOXO3A蛋白表达皆显著降低（P<0.01）。
结论益经汤可有效改善动情周期，、AMH、PROG和降低FSH、LH的表达，机制可能与下调PI3K、AKT和恢复卵巢和子宫的功能，可提高血清E2FOXO3A 蛋白表达有关。
关键词：益经汤；卵巢功能；动情周期；性激素中图分类号： R285.5 文献标识码： A 文章编号： 2096-3653（2024）01-0001-07DOI: 10.16809/ki.2096-3653.2023091402Study on the therapeutic effect of compound Yijing decoction on cyclophosphamide-induced premature ovarian failure in miceNIU Yilin1, CHEN Shuo1, CHEN Yushi1, HE Dongmei2*, YIN Yongqin1*(1.Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China; 2.Huizhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Huizhou 516001, China)*Corresponding author HEDongmei,Email:***************;YINYongqin,Email:****************** Abstract: Objective To explore the therapeutic effect of traditional Chinese medicine compound Yijing decoction on cyclophosphamide (CTX)-induced premature ovarian failure (POF) in mice. Methods The POF mouse model was established by intraperitoneal injection of CTX, and was randomly divided into the model group, positive control group, low and high doses of Yijing decoction groups, and blank group, with 6 mice in each group. The drug was administered by gavage for 30 d. The estrous cycle, body weight, ovarian and uterine indices, and, FSH, LH, AMH and changes in ovarian and uterine tissues of mice were measured. The concentration of serum E2PROG were detected with ELISA. The levels of ovarian PI3K, AKT, and FOXO3A protein were detected by immunohistochemistry (IHC). Results After intervention with Yijing decoction in mice with POF, the estrus cycle tended to be normal. The body weight, ovarian index, and uterine index significantly increased in the high-dose group mice (P<0.05). The ovarian volume and the number of primary and secondary follicles were increased, and the phenomenon of interstitial and fibrosis was improved. The endometrium was significantly thickened, and the arrangement of endometrial glandular epithelial cells was restored. The levels of serum E, AMH and PROG were2increased in both the positive control group and the high-dose Yijing decoction group (P<0.05, P<0.01), while levels of FSH and LH were significantly decreased (P<0.01). Meantime, the expression of PI3K, AKT and收稿日期：2023-09-14基金项目：广东省惠州市中医医院博士工作站科研项目（BSGZZ03）；广东省中医药局科研项目（20242050）作者简介：牛逸琳（1998－），女，硕士研究生，研究方向为中药学，Email：**********************通信作者：何冬梅（1978－），女，博士，主治中医师，主要从事妇产科临床工作，Email：***************尹永芹（1977－），女，博士，教授，主要从事中药及天然药物活性成分研究，Email：******************。
解毒活血方灌肠对溃疡性结肠炎小鼠结肠炎症及肠道菌群的影响
环球中医药2023年6月第16卷第6期 Global Traditional Chinese Medicine,June 2023,Vol.16,No.61057 ㊃基础研究㊃基金项目:国家自然科学基金(81873214);北京中医药大学基本科研业务费青年教师项目(2019JYBJS179);北京中医药大学第三附属医院2022年度培育项目(BZYSY⁃2022⁃PYQN⁃04)作者单位:100700 北京中医药大学东直门医院脾胃科[胡蓝烁(硕士研究生)㊁杨先照㊁张雯];北京中医药大学第三附属医院脾胃科(王建云㊁江海燕㊁刘元㊁思璎桀㊁王新月);北京中医药大学中医学院(刘果)作者简介:胡蓝烁(1997-),2020级在读硕士研究生㊂研究方向:中医药防治脾胃病㊂E⁃mail:hulanshuo@通信作者:王建云(1983-),博士,副主任医师㊂研究方向:中医药防治消化系统疾病㊂E⁃mail:wjydemail@解毒活血方灌肠对溃疡性结肠炎小鼠结肠炎症及肠道菌群的影响胡蓝烁 杨先照 王建云 江海燕 刘果 刘元 张雯 思璎桀 王新月【摘要】 目的 探讨解毒活血方灌肠对溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)小鼠结肠炎症的抑制作用及对肠道菌群组成㊁多样性和代谢功能的影响㊂方法 80只雄性C57BL /6小鼠,随机分为正常组㊁模型组㊁西药组㊁中药组,每组20只㊂自由饮用3%葡聚糖硫酸钠溶液7天建立UC 模型,造模成功后西药组以浓度为1.33g /kg 美沙拉秦灌肠剂灌肠,中药组以生药浓度为12.24g /kg 混悬液灌肠,模型组㊁正常组给予生理盐水灌肠㊂干预14天后计算小鼠疾病活动指数(disease activity index,DAI),测量结肠长度,观察结肠黏膜形态作黏膜损伤指数(colonic mucosa damage index,CMDI),结肠组织行苏木精 伊红(hematoxylin⁃eosin,HE)染色行组织学损伤评分(colon his⁃topathological score,CHS)㊂留取小鼠结肠内粪便,采用16S rRNA 测序技术检测粪便肠道菌群丰度㊁多样性及代谢功能的变化㊂结果 (1)与正常组相比,模型组DAI 升高(P <0.01)㊁结肠长度缩短(P <0.05),CMDI㊁CHS 升高(P <0.01);与模型组比较,中药组及西药组DAI 下降,结肠长度增加(P <0.05),中药组CMDI㊁CHS 降低(P <0.05)㊂(2)经16S rRNA 技术测序后共得到9628个操作分类单元(operational taxonomic units,OTU),包括11个门,109个属㊂厚壁菌门㊁拟杆菌门㊁疣微菌门㊁变形菌门和放线菌门丰度>10%,为优势菌群㊂各组间菌群比较显示,与正常组比较,模型组Allobaculum 菌㊁Turicibacter 菌㊁双歧杆菌㊁梭状芽孢杆菌㊁Mucispirillum 菌㊁消化链球菌㊁萨特氏菌㊁肠球菌OTU 升高(P <0.05,P <0.01),AKK 菌㊁Arthromitus 菌㊁乳杆菌OTU 降低(P <0.01)㊂与模型组比较,西药组双歧杆菌㊁AKK 菌OTU 升高(P <0.05,P <0.01),肠球菌㊁梭状芽孢杆菌㊁萨特氏菌OTU 降低(P <0.05,P <0.01);中药组Turicibacter 菌㊁双歧杆菌㊁AKK 菌㊁Allobaculum 菌OTU 升高(P <0.05,P <0.01),肠球菌㊁乳杆菌㊁梭状芽孢杆菌㊁Mucispirillum 菌㊁萨特氏菌OTU 降低(P <0.05,P <0.01)㊂与西药组比较,中药组双歧杆菌㊁Turicibacter 菌OTU 升高(P <0.05,P <0.01),消化链球菌㊁萨特氏菌㊁乳杆菌㊁Mucispirillum 菌OTU 降低(P <0.05,P <0.01)㊂与正常组比较,模型组Alpha 多样性指数Observed OTUs㊁Chao1下降(P <0.05),Beta 多样性距离Bray Curtis㊁Weighted Unifrac㊁Unweighted Unifrac 缩小(P <0.01);与模型组比较,中药组Bray Curtis 增大(P <0.01),Observed OTUs㊁Chao1升高(P <0.05),西药组Bray Curtis㊁Unweighted Unifrac 增大(P <0.05);与西药组比较,Chao1㊁Bray Curtis 增大(P <0.05)㊂与正常组比较,模型组碳水化合物代谢降低㊁AMPK 信号通路表达㊁脂类㊁萜类㊁聚酮代谢降低(P <0.05,P <0.01),氨基酸㊁维生素㊁辅酶代谢㊁多糖生物合成与代谢升高(P <0.01)㊂与模型组比较,西药组AMPK 通路表达㊁碳水化合物㊁多糖生物合成与代谢升高(P <0.05),萜类㊁聚酮代谢降低(P <0.05);中药组AMPK 通路表达㊁碳水化合物㊁脂类㊁萜类㊁聚酮代谢升高(P <0.05,P <0.01),氨基酸㊁维生素㊁辅酶代谢,多糖生物合成与代谢降低(P <0.05)㊂与西药组比较,中药组脂类㊁萜类㊁聚酮代谢升高(P <0.01),维生素㊁辅酶代谢,多糖生物合成与代谢降低(P <0.05,P <0.01)㊂结论 解毒活血方灌肠能显著改善1058 环球中医药2023年6月第16卷第6期 Global Traditional Chinese Medicine,June2023,Vol.16,No.6结肠炎症,可能与增加肠道益生菌,抑制病原菌及机会致病菌生长,提高肠道微生物的多样性,调整菌群代谢功能有关㊂【关键词】 溃疡性结肠炎; 解毒活血方; 灌肠治疗; 肠道菌群; 小鼠模型【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1674⁃1749.2023.06.001Effect of Jiedu Huoxue recipe enema on colonic inflammation and intestinal flora in ulcerativecolitis miceHU Lanshuo,YANG Xianzhao,WANG Jianyun,JIANG Haiyan,LIU Guo,LIU Yuan,ZHANG Wen,SI Yingjie,WANG XinyueBeijing University of Chinese Medicine Dongzhimen Hospital,Beijing100700,ChinaCorresponding author:WANG Jianyun,E⁃mail:wjydemail@【Abstract】 Objective To observe the effects of Jiedu Huoxue recipe(JDHXR)enema on colonic inflammation,the composition,diversity and metabolic function of intestinal microbiota in ulcerative colitis(UC)mice.Methods 80male C57BL/6mice were randomly divided into normal group,model group,Chinese medicine group and western medicine group.Mice were administered with3%dextran sulfatesodium for7days to construct the UC model.After successful modeling,1.33g/kg mesalazine and12.24g/kg JDHXR enema were administered in the western medicine and the Chinese medicine group independently.Normal saline enema were given in the model group and the normal group.After14days of intervention,the colonic length was measured,while the disease activity index(DAI),colonic mucosadamage index(CMDI)and colon histopathological score(CHS)were calculated.Colonic fecal was detectedby16S rRNA sequencing technology to find the changes of fecal intestinal flora abundance,diversity and metabolic function in each group.Results (1)Compared with the normal group,the levels of DAI,CMDI and CHS were increased(P<0.01),while colon length was shortened in the model group(P<0.05).Compared with the model group,the levels of DAI,CMDI and CHS were decreased with longercolon length in the TCM group and the western medicine group(P<0.05).(2)A total of9628operational taxonomic units(OTUs)were obtained by16S rRNA sequencing,including11phyla and109genera. Bacteroidetes,Verrucomicrobia,Proteobacteria and Actinobacteria were dominant bacterial community with abundance were more than10%.Compared with the normal group,the OTU of Allobaculum,Turicibacter, Bifidobacterium,Clostridium,Mucispirillum,Peptostreptococcaceae,Sutterella and Enterococcus were increased(P<0.05,P<0.01),while the OTU of Akkermansia,Arthromitus and Lactobacillus decreased(P<0.01)in the model pared with the model group,the OTU of Bifidobacterium and Akkermansia increased(P<0.05,P<0.01),while the OTU of Enterococcus,Clostridium and Sutterellawere decreased(P<0.05,P<0.01)in the western medicine group.In the Chinese medicine group,theOTU of Turicibacter,Bifidobacterium,Akkermansia and Allobaculum increased(P<0.05,P<0.01),while the OTU of Enterococcus,Lactobacillus,Clostridium,Mucispirillum and Sarteria were decreased(P<0.05,P<0.01).Compared with the western medicine group,the OTU of Bifidobacteria and Turicibacter were increased(P<0.05,P<0.01),while the OTU of Peptostreptococcaceae,Sutterella, Lactobacillus and Mucispirillum in the Chinese medicine group were decreased(P<0.05,P<0.01). Compared with the normal group,Alpha diversity index Observed OTUs and Chao1decreased(P<0.05),while Beta diversity distance Bray Curtis,Weighted Unifrac and Unweighted Unifrac were decreased(P<0.01)in the model pared with the model group,the Observed OTUs and Chao1were increased in the Chinese medicine group(P<0.01),while Bray Curtis and Unweighted Unifrac were increased in the western medicine group(P<0.05).Compared with the western medicine group,Chao1and Bray Curtis increased(P<0.05).Compared with the normal group,carbohydrate metabolism,AMPKsignaling pathway expression,lipid,terpenoids and polyketides metabolism were decreased(P<0.05,P<0.01),while amino acid,vitamin,coenzyme metabolism and polysaccharide biosynthesis and metabolism were increased(P<0.01)in the model pared with the model group,AMPKsignaling pathway expression,biosynthesis and metabolism of carbohydrates and polysaccharides were环球中医药2023年6月第16卷第6期 Global Traditional Chinese Medicine,June2023,Vol.16,No.61059 increased(P<0.05),while the metabolism of terpenoids and polyketones decreased(P<0.05)in thewestern medicine group.The AMPK signaling pathway expression,metabolism of carbohydrates,lipids, terpenoids and polyketides were increased(P<0.05,P<0.01),while metabolism of amino acids,vitamins and coenzymes,and polysaccharide biosynthesis and metabolism were decreased(P<0.05)in theChinese medicine pared with the western medicine group,metabolism of lipids,terpenoids and polyketides were increased(P<0.01),metabolism of vitamins and coenzymes and biosynthesis and metabolism of polysaccharides were decreased(P<0.05,P<0.01)in the Chinese medicine group.Conclusion JDHXR enema can reduce colon inflammation,which may be related to increase intestinal probiotics,inhibit the growth of pathogenic bacteria and opportunistic pathogens,improve the diversity ofintestinal flora and adjusting the metabolic function of bacterial community.【Key words】 Ulcerative colitis; Jiedu Huoxue recipe; Intestinal flora; Enema therapy; Murine model 溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种发病机制尚未完全明确的慢性非特异性结直肠炎症性疾病㊂目前认为,肠道微环境改变后产生持续异常的免疫反应可能是导致UC发生和发展的重要原因[1]㊂肠道菌群失调导致的肠道微环境改变主要表现为肠道菌群种类㊁数量㊁比例㊁定位及生物学特性上的变化,通过干预肠道内的菌群可以对UC起到治疗作用[2]㊂解毒活血方为笔者团队灌肠治疗UC的临床验方,亦是北中医三院脾胃病科的协定处方,在减轻UC症状㊁长时间诱导缓解㊁减少复发方面具有良好的临床疗效[3⁃4]㊂以往实验研究表明,解毒活血方灌肠能够下调与肠道微生物识别㊁免疫反应密切相关的Toll样受体4信号通路相关蛋白的表达,调整促炎因子与抗炎因子水平[5]㊂在前期研究的基础上,本课题组继续以葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)建立的UC小鼠模型为研究对象,延长给药及观察时间,观察解毒活血方灌肠对小鼠肠道微生态的物种㊁丰度㊁多样性及代谢功能的影响㊂1 材料与方法1.1 实验动物C57BL/6小鼠,SPF级,7周龄,雄性,体质量(21.2±1.5)g,实验动物购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,实验动物合格证号:SCXK(京) 2019⁃0010㊂本实验经北京永欣康泰科技发展有限公司实验动物中心伦理委员会批准(批准号: YXKT2022L008)㊂动物在温度(25±2)℃,湿度45%㊁12小时光照实验环境下自由饮水和进食,适应性喂养1周㊂1.2 实验药物本实验使用解毒活血方(黄连10g㊁黄柏10g㊁苦参10g㊁五倍子10g㊁三七3g㊁白及3g)购自北京中医药大学第三附属医院药房,由北京康仁堂药业有限公司提供(批号:黄连配方颗粒20039981,黄柏配方颗粒21028681,苦参配方颗粒21021431,五倍子21007911,三七配方颗粒21019521,白及配方颗粒21007453)㊂药物加蒸馏水充分混匀后,按照60kg成人和20g小鼠等效剂量换算比例1∶10,浓缩成含生药6.12g/mL的灌肠液,灭菌分装后于4℃冰箱保存㊂美沙拉秦灌肠液(德国Dr.Falk Pharma GmbH公司生产,规格: 4g/支,批号:H20150127)㊂1.3 主要试剂与仪器DSS(美国MP Biomedicals公司生产,规格:100 g/瓶,批号:021*******);OMEGA⁃soil DNA抽提试剂盒(美国Omega Bio⁃Tek公司生产,批号:D5265⁃01);2%琼脂糖凝胶(西班牙Bioweste公司生产,规格:100g/瓶,批号:111860);FastPfu Polymerase(北京全式金生物技术有限公司生产,批号:M20105); AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(美国Axygen公司生产,批号:RH185765);TruSeq TM DNA Sample Prep Kit (美国Illumina公司生产,批号:15055162); NEXTFLEX®Rapid DNA⁃Seq Kit建库试剂盒(美国Bioo Scientific公司生产,批号:5144⁃01);MiSeq Reagent Kit v3测序试剂盒(美国Illumina公司生产,批号:15055256)㊂移液器(德国Eppendorf公司,型号:Eppendorf N13462C);微型离心机(合肥艾本森科学仪器有限公司,型号:ABSON MiFly⁃6);小型离心机(德国Eppendorf公司,型号:Eppendorf5430R);超微量分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司,型号: NanoDrop2000);电泳仪(北京市六一仪器厂,型号:1060 环球中医药2023年6月第16卷第6期 Global Traditional Chinese Medicine,June2023,Vol.16,No.6DYY⁃6C);PCR仪(美国ABI公司,型号:ABI GeneAmp®9700);MISEQ测序仪(美国Illumina公司,型号:Illumina Miseq);旋涡混合器(海门其林贝尔仪器制造有限公司,型号:QL⁃901);粉碎研磨仪(上海万柏生物科技有限公司,型号:TL⁃48R)㊂1.4 分组给药与组织取材80只小鼠采用随机数字表法分为正常组㊁模型组㊁西药组㊁中药组,每组20只㊂各组小鼠均予SPF 级动物标准饮食喂养㊂模型组㊁西药组㊁中药组小鼠自由饮用蒸馏水配置的3%DSS溶液,连续7天,制备UC小鼠模型[5]㊂小鼠逐渐出现大便次数增多伴脓血㊁体质量下降㊁进食减少等表现,造模7天后各组动物随机选取2只验证造模成功㊂造模成功后,各组动物给予灌肠处理,每日1次,连续14天㊂根据小鼠体重换算灌肠剂量为0.02mL/g,中药组按12.2g/kg予解毒活血方混悬液灌肠,西药组按1.33g/kg给予美沙拉秦灌肠剂灌肠,模型组及正常组给予相同体积的生理盐水灌肠㊂给药14天后,经水合氯醛麻醉后在无菌操作台上打开小鼠腹腔,剖取肛门至盲肠末端的整个结肠组织,于吸水纸上展开并测量长度,沿肠系膜纵向剪开,取结肠中的小鼠粪便置于无菌管内放置-80℃冰箱内冻存,结肠组织经0.9%氯化钠注射液清洗后放置4%多聚甲醛溶液中固定备用㊂1.5 指标检测1.5.1 一般情况观察及疾病活动指数(disease activity index,DAI) 实验期间每天观察并记录各组小鼠体质量㊁饮食饮水量,观察各组小鼠精神状态㊁活动度㊁毛色光泽程度及排便次数㊁大便性状㊁便血情况㊂小鼠体重下降百分比:不变为0分,下降1%~5%为1分,5%~10%为2分,10%~15%为3分,大于15%为4分㊂大便性状:正常为0分,软但成形为1分,未成形便为2分,半成型和稀便之间为3分,稀便为4分㊂血便:潜血阴性为0分,潜血阳性为1分,便中带血为2分,便中带血和血便之间为3分,血便为4分㊂小鼠体质量㊁大便性状和便血情况评分总和为DAI㊂1.5.2 结肠长度测量及黏膜损伤指数(colonic mucosa damage index,CMDI)评分 测量从小鼠肛门至盲肠的结肠长度,纵向剪开结肠后用放大镜观察结肠黏膜形态,进行黏膜损伤指数评分[6],黏膜损伤指标包括粘连(0分:无粘连;1分:结肠与周围组织轻度粘连,易剥离;2分:结肠与周围组织重度粘连,剥离困难),溃疡形成及炎症(0分:无溃疡及炎症;1分:局部充血,无溃疡;2分:1处溃疡不伴肠壁充血或增厚;3分:1处溃疡伴炎症;4分:≥2处溃疡伴炎症;5分:≥2处溃疡和/或炎症>1cm;6~8分:溃疡和/或炎症≥2cm,病变范围每增加1cm,计分加1),腺瘤样占位(0分:无腺瘤;1分:1处腺瘤;2分:≥2处),计算各项总和㊂1.5.3 结肠组织学损伤指数(colon histopathological score,CHS)评分 将固定48小时的结肠组织按照脱水㊁包埋㊁切片(厚度4μm)㊁常规HE染色的顺序制作病理切片,光学显微镜下观察各组小鼠结肠组织病理改变,并进行组织学损伤评分,组织学指标包括溃疡㊁炎症㊁肉芽肿㊁纤维化及病变深度,其中炎症㊁纤维化按有无及轻重,溃疡按无㊁溃疡<3mm㊁溃疡≥3mm分别计0㊁1㊁2分,病变深度按无及达黏膜下层㊁肌层㊁浆膜层分别计0㊁1㊁2㊁3分,各项相加得总分[7]㊂1.5.4 小鼠肠道菌群的16S rRNA测序 (1)DNA 抽提和PCR扩增:采用Omega soil试剂盒从冻存的小鼠粪便中提取DNA,使用NanoDrop2000检测DNA浓度和纯度,1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量㊂以338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG -3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)为引物对V3-V4可变区进行PCR扩增,扩增程序为:95℃预变性3分钟,27个循环(95℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸30秒),最后72℃延伸10分钟㊂扩增体系为20μL,包括4μL 5×FastPfu缓冲液,2μL2.5mM dNTPs,0.8μL引物(5μM),0.4μL FastPfu聚合酶,10ng DNA模板㊂(2)文库构建和Illumina Miseq测序:使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行纯化,Tris⁃HCl洗脱,2%琼脂糖电泳检测,利用QuantiFluor TM⁃ST进行检测定量㊂根据Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE2×300的文库㊂构建文库步骤:连接 Y”字形接头,使用磁珠筛选去除接头自连片段, PCR扩增进行文库模板的富集,氢氧化钠变性后产生单链DNA片段,利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序㊂1.5.5 小鼠肠道菌群差异分析 用Qiime tools import插件,将测序所得的原始序列fastq文件,导入为可进行QIIME2后续处理的文件格式㊂运用QIIME2dada2插件进行质控㊁修剪㊁去噪㊁拼接,并环球中医药2023年6月第16卷第6期 Global Traditional Chinese Medicine,June 2023,Vol.16,No.61061 去除嵌合体后,得到最终的特征序列表格[8]㊂使用QIIME2feature⁃classifier 插件将ASV 的代表序列比对到预先训练好的13_8版本99%相似度的GREENGENES 数据库(根据338F /806R 引物对将数据库修剪到V3V4的区域),得到物种分类信息表[9],用QIIME2feature⁃table 插件剔除所有污染性的线粒体和叶绿体序列,完成各组小鼠肠道菌群的数据质控和物种注释㊂1.5.6 小鼠肠道菌群多样性分析 使用QIIME2core⁃diversity 插件计算多样性矩阵,采用特征序列水平Alpha 多样性指数中observed OTUs㊁Chao1指数来评估小鼠肠道菌群物种组成的丰富度和均匀度㊂同时应用R 软件包 mixOmics”,偏最小二乘判别分析(PLS⁃DA)计算Beta 多样性指数,包括Bray Curtis㊁unweighted UniFrac㊁weighted UniFrac 指数),评估包括优势菌群及稀有菌群在内的各组小鼠肠道微生物群落结构间的差异性[10]㊂1.5.7 小鼠肠道菌群代谢功能预测分析 采用PICRUSt 软件对小鼠肠道微生物群体可能的功能组成进行推断,构建微生物全谱系的基因功能预测谱[11],并通过KEGG㊁MetaCyc 和EC 数据库对功能基因进行注释,对各组小鼠肠道微生物代谢功能进行注释㊂1.6 统计学方法采用SPSS 24.0对数据进行统计分析,符合正态分布或近似正态分布的计量资料以均数±标准差(x ±s )表示㊂方差齐者多组间比较采用单因素方差分析,两两组间比较采用LSD 检验㊂不符合方差齐性检验的数据采用非参数检验㊂P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结果2.1 各组小鼠排便与体质量变化 造模后各组小鼠均出现大便次数增多㊁便质不成形㊁大便带血等排便异常,同时伴有活动量及进食减少㊁体重减轻㊁体毛脱落㊂经过14天治疗后,西药组㊁中药组血便减少,大便逐渐成形,进食量增加,精神状态改善,体重较前恢复㊂对照组小鼠大便性状及排便次数同前,进食量及体重继续下降㊂实验过程中,造模期间各组小鼠无死亡,治疗期间中药组灌肠死亡1只㊂2.2 各组小鼠结肠长度㊁DAI㊁CMDI㊁CHS 评分与正常组比较,模型组小鼠结肠长度缩短(P <0.05),DAI㊁CMDI㊁CHS 评分升高(P <0.01);与模型组比较,中药组及西药组小鼠结肠长度增加(P <0.05)㊁DAI 降低(P <0.01),中药组CMDI㊁CHS 评分降低(P <0.05);与西药组比较,中药组DAI㊁CMDI 评分降低(P <0.01,P <0.05)㊂见表1㊂2.3 结肠组织病理组织学改变正常组小鼠结肠组织结构完整,未见溃疡及坏死,结肠黏膜上皮完整,可见明显的隐窝和大量杯状细胞㊂模型组小鼠黏膜层完整性受损,溃疡突破黏膜肌层,可见隐窝萎缩和杯状细胞大量减少,黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润㊂西药组小鼠结肠黏膜可见散在浅溃疡,仍有较多炎性细胞浸润,可见隐窝脓肿㊂中药组小鼠可见大量杯状细胞,结肠黏膜及黏膜下层少见炎性细胞浸润,隐窝结构恢复㊂见图1㊂表1 各组小鼠结肠长度㊁DAI㊁CMDI㊁CHS 比较(x ±s )组别鼠只结肠长度(cm)DAI(分)CMDI(分)CHS(分)正常组20 6.11±0.150.07±0.130.00±0.000.05±0.22模型组20 4.91±0.11a 2.62±0.41b 5.55±1.84b 2.50±0.51b 西药组20 5.38±0.11ac 1.02±0.57bd5.10±1.02b 1.90±0.55bc 中药组195.41±0.14ac0.23±0.14bdf4.00±1.33bce1.70±0.46bc注:与正常组比较,a P <0.05,b P <0.01;与模型组比较,c P <0.05,d P <0.01;与西药组比较,e P <0.05,f P <0.01㊂注:A 正常组;B 模型组;C 西药组;D 中药组㊂图1 各组小鼠结肠组织HE 染色(×300)1062 环球中医药2023年6月第16卷第6期 Global Traditional Chinese Medicine,June2023,Vol.16,No.62.4 各组小鼠肠道菌群门属水平主要物种相对丰度比较经16S rRNA技术测序后共得到9628个操作分类单元(operational taxonomic units,OTU),包括11个门,109个属㊂在门水平,厚壁菌门与拟杆菌门为优势菌群(总体丰度分别为49.23%㊁34.90%),其次为疣微菌门㊁变形菌门和放线菌门㊂在属水平,总体丰度大于10%的优势菌群依次为拟杆菌属㊁乳杆菌属㊁梭菌属㊁Turicibacte菌属㊁Allobaculum菌属㊁AKK菌属(总体丰度依次为19.2%㊁16.6%㊁12.2%㊁11.6%㊁10.4%㊁10.2%),见表2㊂其中,正常组优势菌群为乳杆菌属及AKK菌属;模型组拟杆菌属㊁梭菌属为优势菌群,与正常组比较,丰度升高(P<0.05,P<0.01);西药组拟杆菌属及Allobaculum菌属为优势菌群,与模型组比较,丰度升高(P<0.05);中药组以拟杆菌属㊁梭菌属㊁Turicibacter㊁Allobaculum菌属为优势菌群,与西药组比较,拟杆菌属丰度降低(P<0.05),Allobaculum㊁Turicibacter菌属丰度升高(P<0.05,P<0.01)㊂见表3㊂2.5 各组小鼠肠道菌群组间OTU差异比较 对各组小鼠肠道菌群相对丰度均>1%者进行组间差异性分析㊂与正常组比较,模型组Allobaculum菌OTU升高(P<0.05),Turicibacter菌㊁双歧杆菌㊁梭状芽孢杆菌㊁Mucispirillum菌㊁消化链球菌㊁萨特氏菌㊁肠球菌OTU升高(P<0.01);AKK 菌㊁Arthromitus菌㊁乳杆菌OTU降低(P<0.01)㊂与模型组比较,西药组双歧杆菌㊁AKK菌OTU升高(P<0.05,P<0.01),肠球菌OTU降低(P<0.05),梭状芽孢杆菌㊁萨特氏菌OTU降低(P<0.01);中药组Turicibacter菌OTU升高(P<0.05),双歧杆菌㊁AKK 菌㊁Allobaculum菌OTU升高(P<0.01),乳杆菌㊁梭状芽孢杆菌㊁Mucispirillum菌㊁萨特氏菌OTU降低(P<0.01),肠球菌OTU降低(P<0.05)㊂与西药组比较,中药组双歧杆菌㊁Turicibacter菌OTU升高(P<0.05,P<0.01),乳杆菌㊁Mucispirillum菌OTU 降低(P<0.01),消化链球菌㊁萨特氏菌OTU降低(P<0.05)㊂见表4~5,图2㊂表2 各组小鼠肠道菌群门水平主要物种相对丰度比较(x±s,%)组别鼠只厚壁菌门拟杆菌门疣微菌门变形菌门放射菌门正常组2047.68±13.3739.74±17.830.95±2.918.63±8.88 1.38±0.80模型组2049.12±11.2032.23±14.7111.55±10.42b 3.30±1.61b 1.25±1.06西药组2044.78±10.5439.84±18.299.18±7.91b 4.83±4.68a 2.01±1.07中药组1955.30±10.3227.75±11.58ad8.55±8.21b 4.94±6.21 2.81±2.98ac 注:与正常组比较,a P<0.05,b P<0.01;与模型组比较,c P<0.05;与西药组比较,d P<0.05㊂表3 各组小鼠肠道菌群属水平主要物种相对丰度比较(x±s,%)组别鼠只拟杆菌属乳杆菌属梭菌属Turicibacter菌属Allobaculum菌属AKK菌属正常组20 6.43±5.0733.58±18.33 3.54±2.44 2.32±1.76 3.20±3.2311.54±10.41模型组2012.27±11.05a9.96±12.14b10.98±5.79b9.53±5.24b 5.62±4.18a0.95±0.25b 西药组2024.04±19.96ac 6.54±5.77b9.40±5.79b7.43±6.27b10.14±6.27bc8.54±8.19中药组1914.23±12.19ae 3.05±8.93bc12.30±8.09b17.26±5.52bdf13.93±2.40bde9.18±7.12注:与正常组比较,a P<0.05,b P<0.01;与模型组比较,c P<0.05,d P<0.01;与西药组比较,e P<0.05,f P<0.01㊂表4 各组小鼠肠道菌群组间OTU差异比较(x±s,个)组别鼠只Turicibacter菌Arthromitus菌双歧杆菌乳杆菌梭状芽孢杆菌Mucispirillum菌正常组2048.00±20.20115.50±250.71 2.75±4.746939.90±3788.539.10±14.69 1.05±0.03模型组201970.30±1083.23a 2.50±3.36a173.10±188.69a2057.75±2510.87a174.35±11.72a73.20±120.14a 西药组201534.95±1294.00a 1.60±1.50a328.30±337.63ab1044.80±1845.92a73.40±31.20ac39.30±73.97a 中药组193566.67±1143.88abe 3.00±4.32a402.22±163.12acd135.50±118.95ace86.55±21.36ac7.61±13.28ace 注:与正常组比较,a P<0.01;与模型组比较,b P<0.05,c P<0.01;与西药组比较,d P<0.05,e P<0.01㊂环球中医药2023年6月第16卷第6期 Global Traditional Chinese Medicine,June 2023,Vol.16,No.61063 表5 各组小鼠肠道菌群组间OTU 差异比较(x ±s ,个)组别鼠只消化链球菌Allobaculum 菌萨特氏菌AKK 菌肠球菌正常组2052.75±213.51273.15±667.1211.35±24.852386.00±2152.46 1.35±1.41模型组20839.45±913.34b 1160.15±865.58a206.70±207.50b 196.90±152.31b91.80±15.75b西药组20967.35±852.15b 2095.00±1295.80b98.21±94.75bd 1767.05±1695.69d 77.65±38.72bc 中药组19616.11±307.61be2879.67±2154.63bd60.44±57.68bde1895.60±1634.36d70.67±31.86bc注:与正常组比较,a P <0.05,b P <0.01;与模型组比较,c P <0.05,d P <0.01;与西药组比较,e P <0.05㊂注:cladogram 图由内到外,对应界门纲目科属不同的分类层级,层级间连线代表所属关系㊂每个圆圈节点代表一个物种,节点为黄色代表在分组间差异不显著,不为黄色则代表该物种是对应颜色分组的特征微生物(在该分组丰度显著较高)㊂有颜色的扇形区域为特征微生物的下属分类区间㊂图2 各组小鼠肠道菌群组间OTU 层属差异cladogram 图2.6 各组小鼠肠道菌群多样性比较与正常组比较,Alpha 多样性指数ObservedOTUs㊁Chao1下降(P <0.05),Beta 多样性距离BrayCurtis㊁Weighted Unifrac㊁Unweighted Unifrac 缩小(P <0.01);与模型组比较,中药组Bray Curtis 增大(P <0.01),Observed OTUs㊁Chao1升高(P <0.05),西药组Bray Curtis㊁Unweighted Unifrac 增大(P <0.05);与西药组比较,Chao1㊁Bray Curtis 增大(P <0.05)㊂见表6㊂2.7 各组小鼠微生物群落代谢功能预测比较与正常组比较,模型组碳水化合物代谢降低(P <0.05),AMPK 信号通路表达㊁脂类㊁萜类㊁聚酮代谢降低(P <0.01),氨基酸㊁维生素㊁辅酶代谢㊁多糖生物合成与代谢升高(P <0.01)㊂与模型组比较,西药组AMPK 通路表达㊁碳水化合物㊁多糖生物合成与代谢升高(P <0.05),萜类㊁聚酮代谢降低(P <0.05);中药组AMPK 通路表达㊁碳水化合物代谢升高(P <0.05),脂类㊁萜类㊁聚酮代谢升高(P <0.01),氨基酸㊁维生素㊁辅酶代谢㊁多糖生物合成与代谢降低(P <0.05)㊂与西药组比较,中药组脂类㊁萜类㊁聚酮代谢升高(P <0.01),维生素㊁辅酶代谢降低(P <0.05),多糖生物合成与代谢降低(P <0.01),见表7㊂1064 环球中医药2023年6月第16卷第6期 Global Traditional Chinese Medicine,June2023,Vol.16,No.6表6 各组小鼠肠道菌群Alpha及Beta多样性差异比较(x±s)组别鼠只Alpha多样性Beta多样性Observed OTUs chao1Bray Curtis Weighted Unifrac Unweighted Unifrac正常组20233.55±46.21231.57±46.240.84±0.050.16±0.020.61±0.04模型组20180.65±38.83a184.77±38.82a0.62±0.08b0.13±0.03b0.53±0.05b 西药组20182.30±36.05a187.44±35.92a0.66±0.06bc0.14±0.03a0.55±0.06b 中药组19198.61±56.89c209.82±36.82ce0.71±0.05bde0.15±0.020.58±0.05c 注:与正常组比较,a P<0.05,b P<0.01;与模型组比较,c P<0.05,d P<0.01;与西药组比较,e P<0.05㊂表7 各组小鼠肠道微生物群落代谢功能预测比较(x±s)组别鼠只AMPK通路碳水化合物脂类氨基酸维生素㊁辅酶萜类㊁聚酮多糖生物合成正常组209.49±1.7310.92±0.43 5.02±0.279.27±0.868.93±0.71 2.62±0.157.38±1.86模型组207.50±1.23b10.41±0.35a 4.46±0.22b10.26±0.32b9.72±0.59b 2.13±0.15b7.78±2.01b 西药组208.99±1.18c10.81±0.31c 4.47±0.18b10.17±0.38b9.61±0.58b 2.02±0.18bc8.48±2.02bc 中药组199.33±2.05c10.79±0.45c 4.93±0.12df9.75±0.48ac9.14±0.45ce 2.80±0.17df7.41±1.64cf 注:与正常组比较,a P<0.05,b P<0.01;与模型组比较,c P<0.05,d P<0.01;与西药组比较,e P<0.05,f P<0.01㊂3摇讨论鉴于UC具有迁延难愈,邪气较甚,深伏难解的特点,结合中医毒邪学说与络病学说,针对 毒邪深伏㊁络病难愈”的特征[15],课题组认为UC存在毒邪内聚,蕴结肠腑,入血入络的微观病机[16]㊂邪气蕴结不解谓之毒,UC易感个体因先天禀赋差异,加之外感六淫㊁饮食不节㊁情绪失调㊁过度劳累等因素,导致脾胃功能失常,水湿滞留肠间,久羁不去,化生湿热㊂虽然现代医学对于UC的发病机制尚未明确,但肠道微生态菌群与结肠炎症的相关性问题已成为业界专家关注的焦点㊂已有研究证实,肠道微生物在维持宿主黏膜屏障结构的完整㊁营养代谢㊁免疫调节及对病原体的防御等方面均具有重要作用㊂肠道微生物种群的多样性㊁空间或数量发生改变,益生菌数量减少㊁病原菌过度生长等肠道菌群失调可能是导致UC发生和发展的关键因素[2]㊂肠道内益生菌减少,条件致病菌增多,并由此引发炎症反应及代谢障碍可以视作毒邪化生的表现㊂目前研究发现,乳杆菌㊁Turicibacter菌㊁AKK 菌㊁Arthromitus菌㊁双歧杆菌为常见的肠道益生菌,在构建宿主肠道屏障㊁维持肠道菌群生态平衡㊁阻止致病菌对肠道的入侵和定植㊁控制内毒素㊁调节机体免疫力㊁提高营养利用度上均具有重要作用[17⁃21]㊂拟杆菌㊁梭菌㊁消化链球菌㊁肠球菌为人与鼠肠道的基石菌群,能够吸收和降解膳食中人体不能够降解的多种植物多糖,参与脂肪代谢,调节细菌毒素的产生并增强宿主固有的免疫反应等,但同时也是机会致病菌,可以产生毒素,引起炎症,诱发或加重感染[21⁃24],其中萨特氏菌㊁Allobaculum菌㊁Mucispirillum菌对肠道炎症有促进作用[25⁃27]㊂肠道微生物还可以通过发酵不能被宿主小肠吸收利用的食物残渣和上皮细胞分泌的内生黏液来发挥代谢作用[28]㊂一方面,肠道内微生物可将各种多糖㊁寡糖,代谢为短链脂肪酸,为结肠上皮细胞提供能量来源,还能调节葡萄糖代谢,降低血糖与血脂[29]㊂另一方面,肠道内微生物在厌氧的条件下也能代谢肽和蛋白质产生短链脂肪酸,但同时会生成如氨㊁胺㊁苯酚㊁吲哚等有害物质,即腐败作用[30]㊂此外,肠道细菌还参与了多种维生素的合成以及钙㊁镁㊁铁等离子的吸收,参加萜类及聚酮代谢,发挥抗炎㊁抑菌及维持细胞稳定的作用[31]㊂本研究中,UC模型小鼠疾病活动指数升高㊁结肠长度缩短,结肠黏膜及组织学损伤评分均反映了小鼠的结肠炎症情况㊂经药物干预后,美沙拉秦及解毒活血方灌肠均有有效减轻小鼠结肠炎症,解毒活血方治疗作用更为显著㊂肠道菌群失调可能是UC的发病机制之一,本实验采用16S rRNA技术对UC小鼠肠道菌群进行分类测序后发现,各组小鼠均以厚壁菌门㊁拟杆菌门㊁变形菌门㊁放线菌门㊁疣微菌门为优势菌群,与既往研究结果一致[32]㊂在属水平,模型组小鼠肠道中的益生菌Arthromitus菌减少,而梭菌属㊁消化链球菌属㊁萨特氏菌属㊁肠球菌等机会致病菌属增多,增加了结肠炎症发生的几率;西药组及中药组小鼠肠道内双歧杆菌属增多,梭状芽孢杆菌㊁肠球菌属㊁萨特氏菌属等机会致病。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
45第16卷 第6期 2014 年 6 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 16 No. 6 Jun .，2014理中汤首见于医圣张仲景所著的《伤寒论》，功善健脾益气、温阳散寒，由干姜、人参、白术、炙甘草组成，是临床常用的方剂之一。
原书记载该方用于治疗自利不渴、畏寒肢冷、倦怠乏力、腹痛呕吐等。
然其成书距今已有1700余年，对于方中药物的具体用量，自古以来就有争议。
根据出土的汉代文物及现代有关学者考证，认为东汉时期的1两应为现在的15.625 g [1]。
尽管如此，从古至今流传已久的1两为3 g 的说法依然影响甚远。
为此，本文通过观察古今不同用量对脾阳虚小鼠脏器系数的影响，为探究伤寒方剂用量换算提供实验依据。
1 材料与方法1.1 实验动物SPF 级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量 25~30 g，购自山东中医药大学动物中心。
1.2 药物实验中所需的党参、干姜、白术、炙甘草均购自山东中医药大学中鲁医院。
药材经山东中医药大学中药鉴定教研室老师鉴定，符合《中华人民共和国药典》（一部）2000年版相关规定。
理中汤古方用量按照《伤寒论》原著为党参45 g，干姜45 g，白术45 g，炙甘草45 g，按照人与小鼠体表面积换算公理中汤古今不同用量对脾阳虚小鼠脏器系数影响袁琛皓，董广通，孙伟越，高永贵，张文婧，王欣，郭炜（山东中医药大学，山东 济南 250355）摘 要：目的：探讨理中汤古今不同用量对脾阳虚小鼠脏器系数的影响。
方法：将40只SPF 级昆明种小鼠，雌雄各半，随机分为空白组、模型组、古方组、今方组，每组10只。
除空白组外，其余各组采用注射利血平注射液的方法制备小鼠脾阳虚模型。
造模成功后，古方组、今方组分别灌胃相应的药液，空白组、模型组灌胃等容积的蒸馏水，每日1次，连续给药5 d。
给药结束后，称取小鼠体质量，处死小鼠，摘取肝、脾、肾、胸腺，称重并按照公式计算脏器系数。
结果：连续给药5 d 后，与模型组相比，古方组小鼠的肝脏系数显著降低（P <0.01）；古方组与今方组的肝脏系数无显著性差异。
结论：理中汤古方组可以显著降低脾阳虚小鼠的肝脏系数，而理中汤今方组效果不明显；理中汤古今不同用量对脾阳虚小鼠脾、肾、胸腺的脏器系数无明显影响。
关键词：理中汤；古今用量；脏器系数中图分类号：R256.3 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2014) 06- 0045- 02收稿日期：2013-12-27基金项目：山东省名老中医药专家刘持年教授传承工作室建设项目；国家级大学生创新创业训练计划项目（201310441090）；山东中医药 大学大学生创新创业训练平台立项资助项目（2013-56）作者简介：袁琛皓（1992-），男，山东淄博人，2010级本科学生，研究方向：方剂临床应用及疗效客观化研究。
通讯作者：郭炜（1979-），男，山西阳泉人，讲师，博士，研究方向：方剂临床应用及疗效客观化研究。
E-mail：gw1946@。
Effect of Lizhong Decoction with Different Dosages in Ancient and ModernTimes on Organ Coefficients of Spleen Yang Deficiency MiceYUAN Chenhao，DONG Guangtong，SUN Weiyue，GAO Yonggui，ZhANG Wenjing，WANG Xin，GUO Wei（Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji'nan 250355，Shandong，China）Abstract：Objective ：To investigate how the organ coefficients of the spleen Yang deficiency mice wereaffected by Lizhong Decoction with different dosages in ancient and modern times. Method ：40 SPF Kunming mice，half male and half female，were divided into 4 groups（the ancient dosage group，the modern dosage group，the blank group，the model group）randomly. The mice model of spleen Yang deficiency was established by injecting Reserpine except the blank group. The ancient dosage group and the modern dosage group were treated with Lizhong Decoction of ancient dosage and modern dosage respectively once a day. The model group and the blank group were treated with the same dose distilled water once a day. After 5 days treatment，all the mice were killed and the organ coefficients of liver，spleen，kidney and thymus were analyzed. Results ：After 5 days treatment，the liver coefficients in the ancient dosage group were significantly decreased compared with that in the model group.（P <0.01）. There was no marked difference between the ancient dosage group and the modern dosage group in the liver coefficients. Conclusion ：The ancient dosage group could reduce the liver coefficients significantly，while the modern dosage group has a little effect. Lizhong Decoction with different dosages in ancient and modern times makes no significant influence on the organ coefficients of spleen，kidney and thymus.Key words：Lizhong Decoction；different dosages in ancient and modern times；organ coefficients DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2014.06.016 辽宁中医药大学学报 16卷式，得出小鼠的用药量为0.05 g/10 g；理中汤今方用量为党参9 g，干姜9 g，白术9 g，炙甘草9 g，按照人与小鼠体表面积换算公式，得出小鼠的用药量为0.01 g/10 g。
将制备好的药液冷却后，放入冰箱4 ℃保存备用。
1.3 实验分组取小鼠40只，雌雄各半。
随机分为空白组、模型组、古方组、今方组，每组10只。
除空白组外，其余3组小鼠按照0.25 mg/(kg·d)腹腔注射利血平注射液制备脾阳虚模型，连续注射7 d[2]。
7 d后，脾阳虚体征出现，造模成功。
古方组、今方组小鼠分别灌服相应的药液，空白组、模型组小鼠灌胃等容积的蒸馏水，1次/d，持续5 d[3]。
1.4 脏器摘取与称量小鼠连续给药5 d后称取体质量，颈椎脱臼处死，立即摘取肝脏、脾脏、肾脏、胸腺，除去器官周围的脂肪结缔组织，吸尽脏器表面血液，用精密电子天平称量脏器质量。
按照脏器系数公式计算。
脏器系数计算公式：脏器系数=脏器质量/体质量×100%。
1.5 统计学处理采用spss17.0进行分析，应用单因素方差分析各组间主要脏器系数的差异。
2 结 果2.1 一般状态观察空白组小鼠状态良好，毛发光泽；模型组小鼠行动缓慢，皮肤枯槁；古方组与今方组给药后状态良好。
2.2 各组小鼠主要脏器系数比较见表1。
表1 理中汤古今用量对小鼠脏器系数影响的比较（n=10，x—±s）组别肝脏脏器系数脾脏脏器系数胸腺脏器系数肾脏脏器系数空白组 4.962±0.587*0.374±0.087 0.258±0.113** 1.402±0.214模型组 5.502±0.5600.439±0.1970.159±0.061 1.343±0.174古方组 4.819±0.663**0.400±0.1710.157±0.045 1.337±0.185今方组 5.098±0.4540.405±0.1370.178±0.052 1.348±0.149注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
3 讨 论根据全国中西医结合虚证老年病防治学术会议制定的“中医虚证参考标准”[4]及北京师范大学造脾虚模型标准[5]：①大便溏泄；②食少纳呆；③消瘦，体重减轻；④神态萎靡，毛色无光泽；⑤蜷缩聚堆；⑥易疲劳。
第①、②项为主症，第③~⑥项为兼项，具备两项主症及两项兼症时，即可认为脾虚造模成功。
本实验采用注射利血平注射液制备脾阳虚小鼠模型成功后，主要表现为蜷缩聚堆，动作缓慢，大便溏泄，食量减少。
模型组小鼠脾阳虚表现尤为典型，因未采取相应治疗，证候改善较差，而古方组和今方组小鼠给药后脾阳虚症状均得到明显改善。
脏器系数又称为脏体比，是指实验动物某脏器的质量与其体质量的比值。
正常情况下，实验动物的各脏器与体重比值比较恒定。
若实验动物染毒或发生病变时，受损脏器质量可以随之发生改变，故而影响脏器系数随之发生变化。
脏器系数数值的变化亦有不同的意义，若数值增大则表示脏器发生充血、水肿或增生肥大等情况；若数值变小则表示脏器发生萎缩及其他退行性改变。