免疫核糖核酸的制备及检定
核酸标准品制备
核酸标准品制备
核酸标准品制备是指根据已知浓度和纯度的核酸样品，制备出一系列不同浓度和纯度的标准品，用于验证和校准实验室测定核酸浓度的方法和仪器。
核酸标准品的制备一般包括以下几个步骤：
1. 核酸样品准备：选择已知浓度和纯度的核酸样品，如DNA 或RNA，并进行质量检测和纯化处理，以确保样品的质量和纯度。
2. 稀释：根据需要制备的不同浓度标准品，将核酸样品按照一定比例稀释，得到一系列浓度递增的稀释液。
3. 保存：将制备好的核酸标准品分装到适当的容器中，并储存于低温冰箱或液氮罐中，以防止降解和氧化。
4. 验证和校准：使用制备好的核酸标准品验证和校准实验室测定核酸浓度的方法和仪器。
需要注意的是，核酸标准品的制备需要严格控制样品的质量和纯度，避免污染和降解。
同时，制备过程中要注意配制溶液的严密，避免任何外源性核酸污染。
另外，制备的核酸标准品也需要经过严格的验证和校准，以确保其准确性和可靠性。
核酸制备的一般方法和原理
核酸制备的一般方法和原理核酸制备是分子生物学中的一个重要实验技术，用于在实验室中合成DNA和RNA。
核酸制备的一般方法包括聚合酶链反应（PCR）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、DNA合成和RNA合成等。
下面将介绍这些方法的原理和步骤。
PCR是一种可以在体外合成大量DNA片段的技术。
原理是通过循环反应来放大DNA片段的数量。
PCR的主要步骤包括DNA模板的变性、引物的连接、DNA 合成和循环反应。
首先，需要从细胞中提取DNA，并将其加热至95摄氏度，使双链DNA变性成为单链。
这个步骤被称为变性。
然后，在第一个循环中，混合DNA模板、引物和聚合酶。
引物是一小段具有互补碱基序列的DNA片段，用于在DNA模板上定位扩增的目标序列。
聚合酶则是一种酶类，具有在合成新DNA链上添加新碱基的功能。
接下来是DNA合成步骤，通过将DNA聚合酶与引物添加到变性的DNA模板中，让聚合酶按照引物的互补碱基序列合成新的DNA链。
PCR的最后一步是循环反应。
这个过程包括变性、连接和合成DNA的多个循环。
一般而言，前几个循环的温度较高，以变性DNA；接着的几个循环，温度会降低，以使引物连接到DNA模板上；最后的几个循环，温度会升高，以使聚合酶合成新的DNA链。
RT-PCR是一种可以将RNA转录成DNA的方法。
原理是通过逆转录酶将RNA 转录成DNA，并在PCR中进行扩增。
RT-PCR的主要步骤包括RNA提取、逆转录反应、PCR反应和扩增。
首先，需要从细胞中提取RNA，并使用酶类或化学试剂使RNA变性，以防止其进一步降解。
然后，需要逆转录反应将RNA转录成DNA。
逆转录酶是一种具有DNA聚合酶和RNA酶H活性的酶类，它能够合成DNA链，并通过降解RNA启动链来移除RNA。
接下来，PCR反应和扩增步骤与常规的PCR技术相似。
需要使用引物和聚合酶来合成新的DNA链，通过循环反应来放大RNA反转录成的DNA。
除了PCR和RT-PCR技术外，核酸制备还包括DNA合成和RNA合成。
酵母核糖核酸的提取及测定
酵母核糖核酸的提取及测定酵母核糖核酸的提取及测定⼀、实验背景及⽬的核糖核酸(RNA)和它的降解物核苷酸、核苷及其衍⽣物在⽣物化学、医药、⾷品添加剂、农业等领域有着⼴泛的应⽤。
⽐如能够促进作物的⽣长，在⽔稻、⼩麦、柑橘及多种蔬菜⽣产中应⽤，取得了明显的增产效果。
像鸟苷酸(GMP)和肌苷酸(IMP)还是强⼒助鲜剂，胞苷酸(CMP)和尿苷酸(UMP)可作为⽣产治疗癌症、肝炎及冠⼼病等药物的原料。
⽽利⽤微⽣物资源提取氨基酸、核苷酸等⽣物⼩分⼦，具有成本低、⾮化学合成、⽆毒、⽆害的特点。
[1] 随着啤酒等发酵⾏业的快速发展，产⽣了相应的⼤量发酵副产物，如何利⽤这些副产物，既做到不污染环境，还能产⽣良好的经济效益，⼀直是研究的热点。
⽽啤酒废酵母中RNA 含量达6%~8%，是⽣产RNA的较好原料，此外，抽提后的菌体蛋⽩质(占⼲菌体的50%)还具有很⾼的利⽤价值。
所以利⽤啤酒废酵母⽣产RNA形成了⾮常有益的产业链。
[2] 本实验⽬的就是学习从酵母中提取RNA的⽅法并掌握其测定⼿段。
⼆、实验原理微⽣物是⼯.业上⼤量⽣产核酸的原料，其中以酵母最为理想，酵母核酸中主要是RMA (2.67~10.0%)，DNA很少(0.03~0.516%)，菌体容易收集，RMA也易于分离。
RMA提制过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋⽩质分离，然后将菌体除去，再根据RNA等电点在pH2. 0~2.5的特点，将体系pH调⾄其等电点，使之沉淀，进⾏离⼼收集。
提取RNA的⽅法很多，在⼯业⽣产上常⽤的是稀碱法和浓盐法。
稀碱法利⽤碱使细菌细胞壁⽔解，使RNA释放出来，浓盐法是在加热条件下，利⽤⾼浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来，RNA 钠盐易溶于⽔，在含盐的菌体溶液中，RVA 有较⾼的溶解度。
⼆者均通过控制温度使蛋⽩质变性沉淀，通过离⼼将RNA及蛋⽩质和酵母菌体分离，进⽽在等电点沉淀RNA，从⽽达到提取⽬的。
本实验采⽤浓盐法(10% NaCl),是⾷品医药卫⽣领域制备RNA 制剂的经典⽅案。
实验三酵母核糖核酸(RNA)的提取
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2.磷酸的鉴定：取试管两只，分别标明测 定管与对照管，然后依次加入下列各试剂：
管号
RNA水解 5％H2SO4 钼酸铵试剂 液
测定管 0.2ml
不加
5滴
VC 5滴
对照管 不加
0.2ml
5滴
5滴
放置数分钟，观察两管颜色有何不同。 磷酸+钼酸铵——磷钼酸+Vc——钼蓝
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实验三 酵母菌RNA的提取、鉴定及
定量测定
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1
一、实验目的
• 掌握稀碱（NaOH）法分离酵母RNA的原理 与方法
• 了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。
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2
二、实验原理
• （一）目前常用的RNA的制备方法 • 浓盐法：是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁
的通透性，使核酸从细胞内释放出来。成本低、适于大规模 操作。
3.核糖的鉴定：取试管两只，分别标明测定管与 对照管，然后依次加入下列各试剂。
管 号 RNA水解液 5％H2SO4 3，5-二羟甲苯
测定管 4滴
不加
6滴
对照管 不加
4滴
6滴
将两试管放入沸水浴内加热10分钟，比较两管之颜色。
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4.脱氧核糖的鉴定：取两试管分别标明测定管与 对照管，然后依次加入下列各试剂。
管 号 RNA水解液 5％H2SO4 二苯胺
测定管 4滴
不加
6滴
对照管 不加
4滴
6滴
将两试管同时放入沸水浴内，加热10分钟后，比较两 管之颜色。
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思考题
5酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
4000rpm 4000g RCF = 1.119×10－5×(rpm)2 r
其中r 表示离心机转轴中心与离心管中心的距离单位为cm。由于离心管 的位置由转子（rotor）决定，因此r 必须由查阅相关转子的参数而得。
N N
OH OH 核苷-5´-磷酸
酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA， 含量为干菌体的2.67%-10.0%，而DNA含量仅 为0.03%-0.516%。
工业上制备RNA多选用成本低、适于大规 模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提 取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核 苷酸的原料，其工艺比较简单。
下次实验：
蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）
使用注意：配平！ 离心参数调节：转头，转速和离心时间
核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）
由核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核 酸,因含核糖而得名。
RNA的种类：mRNA，tRNA和rRNA，另外 snRNA（2006年诺贝尔医学奖）。
O-
OP O O-
N H2C O N
实验四
酵母RNA的分离及其组分鉴定 （离心技术）
实验目的
1、学习稀碱法提取酵母RNA粗制品的原理 和方法。 2、了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分 的方法。 3、学习离心机的使用方法。
离心机原理和应用
离心就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力， 加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮 力密度的物质分离开 。
核酸的提取操作和鉴定
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
（二）基因组DNA的提取－ CTAB法 CTAB提取缓冲液的经典配方
破碎组织细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取 纯化
III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
1、材料准备
基因组DNA的提取
➢ 最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
➢ 提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞）
➢ 组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成DNA降解
差速离心法原理
➢ 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速 进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
（二）基因组DNA的提取－ CTAB法
CTAB法原理
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
RNA（核糖核酸）
存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬 菌 体，其或只含DNA，或只含有RNA。
二、DNA提取的几种方法
(一） 非基因组DNA的提取 ➢ 质粒DNA的提取
• 碱裂解法 • 煮沸法
➢ 线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
核酸疫苗的制备工艺研究
核酸疫苗的制备工艺研究
核酸疫苗是一种新型的疫苗，其制备工艺包括以下主要步骤：
1. 选择适当的DNA或RNA质粒：核酸疫苗使用的DNA或RNA质粒必须具有目标抗原的基因序列，并且在质粒表达时能够产生目标抗原。
2. 质粒扩增：通过细菌发酵或其他方法，扩增目标DNA或RNA质粒。
3. DNA或RNA质粒纯化：通过离心、滤膜等方法将目标DNA或RNA质粒从细菌细胞中分离出来。
4. 质粒修饰：将质粒加入适当的启动子、信号序列、多聚尾等序列，以提高表达效率。
5. 表达载体构建：将修饰后的质粒插入表达载体中，形成重组表达载体。
6. 细胞培养：将重组表达载体转染到适当的细胞系中，进行培养。
7. 目标抗原表达：在细胞培养的过程中，目标抗原基因被表达，并且可以被细胞分泌或者表面展示。
8. 疫苗制备：根据需要将目标抗原从细胞中提取或者进行纯化，加入适当的辅
助物质进行疫苗制备和包装。
9. 疫苗质量检测：通过疫苗抗原性、疫苗纯度、细菌、真菌和病毒的检测，确保疫苗符合质量标准。
通过以上步骤，核酸疫苗可以得到高效、可靠的制备和生产。
核酸的制备和提取
第9页
（1）核酸中糖
RNA为D-核糖，DNA为 D-2-脱氧核糖，二者都 是β 型。差异：2 位羟基是否脱氧。
核酸的制备和提取
第10页
（2）碱基：
a、嘌呤碱：腺嘌呤（Ade)、鸟嘌呤(Gua)
b、嘧啶碱：胞嘧啶(Cyt)、尿嘧啶(Ura)、胸腺嘧 啶(Thy)
核酸的制备和提取
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（3）核苷：
核糖核酸（RNA）分成以下几类：
1、信使RNA（mRNA） 2、转移RNA（tRNA） 3、核糖体RNA（rRNA） 4、其它非编码RNA (snRNA, microRNA)
核酸的制备和提取
第7页
（二）、核酸分布：
1、DNA分布：
真核生物细胞核，线粒体亦含有DNA. 原核生物集中于核区，核外质粒 病毒含有DNA或RNA.
•识别氨基酸——其 3’末端 腺苷酸可与一氨基酸共价 连接
•识别密码子——反密码子 与mRNA中密码子碱基配 对。
核酸的制备和提取
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6、rRNA
rRNA 占 RNA 总 量 80% 以 上，核糖体由大小两个 亚基组成，大小亚基分 别几个rRNA和数十种蛋 白质组成。
rRNA与几十种蛋白质组成 细 胞 颗 粒 —— 核 糖 体 是 细胞内合成蛋白质工厂。 核糖体上催化肽键合成 是rRNA，蛋白质只是维 持rRNA构象，起辅助作 用。
早期研究仅将核酸看 成是细胞中普通化学 成份，没有些人注意 到它在生物体内有什 么功效；
核酸的制备和提取
F.Miescher
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核酸作为遗传物质发現过程
➢ 20世纪初，德国生理学家柯塞尔(Kossel)证实了核酸是 由四种不一样碱基所组成；美国科学家列文(Levene) 又确定了核酸有两种,即DNA和RNA；
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免疫核糖核酸的制备及检定
(一) 原理
免疫核糖核酸(iRNA)是用某种抗原免疫动物后，从免疫动物的免疫活性细胞中提取出
来的RNA。它具有传递相应抗原特异性免疫信息的能力，因而注入体内后，可发挥对该抗
原的免疫清除作用。
iRNA的免疫学作用机理目前尚无定论，一般认为iRNA具有直接模板作用，即iRNA
以mRNA的形式在受体细胞中起模板作用，从而合成与免疫反应有关的蛋白质，使正常非
致敏的淋巴细胞转变成致敏淋巴细胞。另外，也有人认为iRNA具有逆转录作用、免疫调控
作用及“超抗原”作用等。
(二) 材料与方法
1 动物免疫
(1) 抗原制备：根据欲制备的免疫核糖核酸的目的不同，采用不同的抗原。
如欲制备抗乙肝iRNA，可采用乙肝疫苗，每20μg乙肝疫苗，加1ml弗氏不完全佐剂(液体
石蜡8ml加羊毛脂2ml)及卡介苗45mg，充分混匀并乳化合格后备用。
(2) 动物选择及免疫：大量制备时，多选用绵羊或山羊，小量制备时，可选用家兔或豚鼠，
所用动物应健壮无病。免疫方法为背部及两肘窝多点皮下注射上述乳化疫苗，同时腹腔注射
10μg乙肝疫苗，其后每周腹腔注射20μg，共4次。
(3) 效价测定及脏器采取：第4次免疫后1周，静脉采血，分离血清，用ELISA测效价，如效
价在1∶800以上即合格。处死动物，采取脾脏及淋巴结，置－20℃保存备用。
2 iRNA的提取(热酚法)
(1) 粗提：将脾脏及淋巴结去掉结缔组织及被膜，用生理盐水洗净，切碎，洗去血液，挤干。
每200g组织加200ml盐水，置高速组织捣碎机中制成匀浆(以8000～10 000r/min匀浆两次，
每次1～2min)。
向上述匀浆中加入苯酚溶液(苯酚1800ml加水200ml)200ml及01%SDS1000ml，混匀，置60℃
水浴振荡10min，置冰浴冷却10min，以3500r/min离心30min，取上清液置冰浴中。
(2) 精制：在上述上清中加入半量苯酚溶液，室温下剧烈振荡10min，以3500r/min离心20min，
取水相。加2～3倍体积95%酒精，置冰箱(普通或低温冰箱均可)过夜。以3500r/min离心30min，
弃上清，取沉淀。取少许沉淀，溶于适量水中，测DNA含量及蛋白质，合格后可做下步。
3 除菌、分装及冻干取上述沉淀，加适量三馏水溶解，取少量用紫外分光光度计测RNA含
量，按测定结果，将上述溶液用三馏水稀释至约2mg/ml。加倍量6%右旋糖酐，混匀。用微
孔滤膜滤过除菌，分装(1mg/支)，冻干，封口，待检。
(三) 检定
1 pH值取本品2支，溶于10ml馏水中，其pH值应为68～80。
2 吸收度取本品溶于馏水中，用紫外分光光度计检测，其OD260/OD280应不小于20。
3 DNA含量测定用标准DNA作对照，以紫外法测定，DNA含量不大于5%。
4 RNA含量测定取本品3支，分别溶解于50ml馏水中，按《中国药典》二部附录法测定，三
支含量均应在095mg以上。
5 异常毒性取本品，以注射用生理盐水制成05mg/ml溶液，家兔可静脉注射，应无异常反应。
6 无菌检查取本品3支，溶于6ml无菌水中，分别接种于普通培养基，厌氧培养基及霉菌培
养基，培养1周，应无菌生长。
7 活性测定采用白细胞粘附抑制试验。其原理为正常白细胞在体外培养时，可粘附于玻璃表
面，而用iRNA处理过的白细胞，其粘附于玻璃表面的能力则被抑制，测知该粘附抑制率，
即知iRNA活性。方法为：取绵羊抗凝血，分离白细胞，将白细胞调 节为在血细胞计数板
上每大格内含40～80个细胞的浓度。取细胞悬液，加等体积iRNA溶液，37℃水浴后，移入
血细胞计数板，置37℃温育后，用盐水冲洗、计数。同时作正常白细胞(不加iRNA)对照。
计算白细胞粘附抑制率，如大于20%为合格。
(四) 注意事项
1 温度对iRNA活性影响较大。提取过程须加热时，应严格控制温度及时间。提取间歇时，
应置冰浴中。
2 严格控制RNA酶。RNA酶分布广泛，如污染RNA酶可将iRNA降解而失去活性。因此，
各步均应严格控制，如器皿泡洗后，应干热灭菌，操作者应带手套，提取过程中，可加入
RNA酶抑制剂等。
3 RNA的提取主要有热酚法及冷酚法两种，前者产率高，但易引起RNA的变性和降解；冷
酚法(0～4℃)不易引起RNA的变性和降解，但产率较低。
4 苯酚为冰状固体，如颜色变红，是为氧化之故，应废弃。苯酚加热融化后，方可配制，配
制时，配制者应注意防护。如苯酚配制后须较长时间存放，应加入8羟基喹啉以抗氧化。
上海越研生物科技有限公司提供
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