WB常见问题及处理方法

WB常见问题及处理方法

问题描述可能原因验证或解决办法

无信号一抗和二抗不匹

配

1.二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自

兔，二抗为抗兔抗体）。

没有足够的一抗

或二抗结合目标

蛋白

1.降低一抗的稀释度（二抗一般确认体系之后

不调）；

2.使用效价高的一抗；

3.延长抗体孵育时间，一抗4℃过夜，二抗室

温1-2h；

4.在孵育一抗或者二抗的时候，几张膜叠在一

起，导致孵育不充分；

5.一抗和二抗量不足，或者膜飘浮在表面，导

致孵育不充分。

封闭液与一抗或

二抗有交叉反应

1.选择合适的封闭液（例如磷酸化抗体选择

BSA溶液进行封闭）；

2.选择合适的一抗，二抗的稀释液（建议选择

成分比较清楚的BSA或者明胶）。

一抗不识别检测

物种的蛋白

1.参考说明书，此抗体是否适合这个物种；

2.分析比对免疫原序列和蛋白序列，保守性强

的可以尝试；

3.设置能检测的阳性对照。

抗原量不足

1.检测样本中目的蛋白表达较少；

2.每泳道蛋白上样量少，总蛋白量不低于

20-30μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照；

3.磷酸化抗体检测优先使用BSA进行封闭。

4.使用相应的刺激，使目的蛋白表达丰度提高。

组织中目的蛋白

含量低

1.选择特异表达目的蛋白的组织；

2.组织新鲜，及时提取，尽快使用；

3.使用相应的蛋白酶抑制剂。

转膜不充分或电极插反没转成功1.根据目的蛋白的分子量，选择合适的转膜条件；

2.转膜结束后，用丽春红对膜进行染色，分析转膜效果（也可对残留胶进行考染，观测转膜效率）；

3.转膜时电极插反，导致转膜失败

4.选择相应的转膜液，

5.膜孔太大，转膜条件过大，目的蛋白转过。

洗膜过度 1.降低洗膜强度（洗膜时间，次数和温度）。

过度封闭使目标蛋白不能显色1.减少封闭时间，考虑封闭温度；

2.更换封闭剂，使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶粉的抗体稀释液，代替5%脱脂奶粉、

显色液失活 1.检测使用的显色液是不是有效，特别是ECL

显色中，ECL-B特别容易失效。

激发光波长选择

不合适 1.对于不同荧光标记的二抗，选择合适的激发

光波长。

显色方式的选择1.ECL显色比DAB显色灵敏度高5-10倍；

2.ECL发光液分普通，灵敏，超敏，在信号上有明显的差异；

3.延长曝光和显色时间。

背景高未进行非特异性

封闭或封闭不充

分

1.延长封闭条件（一般室温1h）；

2.考虑更换合适的封闭剂（例如使用5%脱脂奶

粉）；

3.封闭的时候几张膜在一起，导致封闭不充分。

4.提高封闭液中，脱脂奶粉或者BSA的浓度。一抗浓度过高 1.调整抗体的稀释比。

抗体孵育温度过

高

1.改变抗体孵育的方式（由原来的室温孵育改

为4℃孵育）。

二抗与封闭剂非特异性结合或反

应1设置阴性对照（不加一抗）。

2.降低二抗的孵育时间（室温超过2h以，非特异性结合大大增加）。

一抗或二抗与封闭剂有交叉反应1.更换合适的封闭液（有时候脱脂奶粉的效果封闭比较好）

2.当用脱脂奶粉封闭背景较高时，选择BSA进行封闭(脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景)。

未结合蛋白质洗涤不充分1.提高洗涤强度（洗涤的时间和洗涤的次数）

2.两次洗涤的过程中，尽量把TBST倒尽。

膜的选择导致的

高背景1.由于NC膜和PVDF膜与蛋白结合的原理不同，选择合适的膜。（例如选择PVDF膜可以增加洗膜强度）

背景有黑色斑点1.胶片曝光；

2.显影液定影液失效；

3.显色时间太长；

4.封闭液中牛奶没有溶，有颗粒性成分。

封闭后的实验操作过程中膜干燥1.在孵育过程中防止膜变干，在任何步骤都保证膜有充分的反应液。

细胞传代次数过多，使其蛋白表达

不同1.在使用细胞进行样品准备时，尽量选用传代次数少的没问题的细胞，传代次数多，有些蛋白可能发生表达的不同。

多带现象

体内表达的蛋白

样本具有多种修

饰形式如乙酰化、

甲基化、烷基化、

磷酸化、糖基化等

1.查阅相应的网站（例如：uniprot），查看相

应的转录本信息；

2.参考其他抗体的网站信息，查询目的蛋白的

分子量，和表达情况；

3.选择合适的组织样本，检测相对应的转录本。蛋白样本降解

1.提取的样品时间长，发生明显降解；

2.提取蛋白的时候，加入蛋白酶抑制剂。

3.样品保存得当，尽量在室温的时间减少；

一抗浓度过高，高

浓度时常出现多

条蛋白带

1.增加一抗的稀释比例；

2.降低一抗和二抗的孵育时间；

二抗浓度过高，高

浓度产生非特异

性结合

1.一般二抗体系清楚，不调二抗的稀释比例，

降低二抗的孵育时间；

2.降低抗体浓度，增加二抗对照（不加一抗）；

3.选择适当的孵育时间，一般为室温60分钟，

时间过长易出现非特异性的条带。

条带为非特异性

条带

1应用封闭多肽来区分特异性和非特异性条带，

只有特异性条带能被封闭从而消失；

2.对于磷酸化的抗体，选择去磷酸化的样本作

为阴性对照；

3.选择多种刺激样本或者组织特异性高表达的

样本作为阳性对照，特异性低表达的为阴性对

照。

靶蛋白形成多聚

体

1.对于易于形成多聚体的蛋白，在SDS-PAGE

电泳上样前，煮沸10分钟而不是5分钟，使蛋

白解聚。