诱导细胞凋亡的相关基因
细胞凋亡的途径
1.3 B粒酶信号途径介导的细胞凋亡
细胞毒性淋巴细胞，如细胞毒性T细胞，淋巴细胞因子激活的杀伤细胞LAK、自然杀伤细胞，可通过多种机制诱导靶细胞的凋亡。例如这些细胞表面表达的FasL可结合靶细胞表面的Fas，激活靶细胞的外部凋亡途径。此外，细胞毒性淋巴细胞还能向靶细胞传递一些毒性颗粒，其中包含TNF、B粒酶及另一种穿孔蛋白。TNF可介导细胞的外部凋亡途径，而穿孔蛋白通过在靶细胞表面形成膜间通道，利于B粒酶向靶细胞内部转移。进入细胞内部的B粒酶自身具备蛋白水解作用，可直接裂解并激活caspases，促进细胞凋亡，还能通过裂解BH3-only蛋白间接激活细胞凋亡的线粒体途径。且有研究显示，B粒酶通过BH3-only 蛋白介导的细胞凋亡效应强于其直接激活caspases效应。
凋亡细胞的诱导及检测
凋亡细胞的诱导及检测一、实验目的1、掌握培养细胞诱导凋亡的方法2、掌握凋亡细胞形态特征检测方法3、掌握基因组DNA特征及凋亡相关蛋白的检测方法4、熟悉PCR原理及技术5、熟悉凋亡相关知识、科研的基本思路二、实验内容1、培养细胞凋亡的诱导、凋亡细胞形态学、细胞增殖活力检查2、凋亡细胞的DNA ladder、caspase3活性检测3、培养细胞RNA的提取及定量、逆转录PCR4、PCR法扩增凋亡相关基因Bcl-2和Bax、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物三、实验步骤与操作第一天（8学时）理论知识讲解：凋亡诱导方法及诱导药物剂量计算（细胞加药后诱导期间讲解）实验内容及安排：1、培养细胞的凋亡诱导（实验教材p137，p144）约需2h2、倒置相差显微镜下观察凋亡细胞的形态变化（实验教材p145）3、培养细胞的Giemsa染色、吖啶橙荧光染色、碘化丙啶（PI）/Ho.33342荧光双染检测（实验教材p146-148）4、MTT法检测细胞内琥珀酸脱氢酶活性及细胞存活率计算方法（实验教材p137）操作步骤：1）凋亡诱导：用25ml培养瓶体外培养人肿瘤细胞株（BEL-7402细胞或HepG2），2～3d传一代。
a) 实验前一天将细胞以2ⅹ104/ml接种于预先放入盖玻片的24孔板中。
在试验前2～4 h加入凋亡诱导剂大蒜素（60 mg/L），37℃、5%CO2、饱和湿度条件下继续培养，用于细胞形态观察。
设正常对照组、大蒜素诱导组。
b) 实验前一天将细胞以每孔5×104密度接种于96孔板中，在对数生长期进行分组实验：设空白组、正常对照组、大蒜素诱导组（空白组未加任何处理、正常对照组加PBS），用于MTT法测定细胞内琥珀酸脱氢酶活性。
2）凋亡细胞形态观察：体外培养的正常肝癌BEL-7402细胞为上皮形细胞，多边形，胞体丰满，核大而明显，可见多个核仁，细胞之间边界清晰，折光性好。
60 mg/L大蒜素作用2～4 h，BEL-7402细胞出现典型的细胞凋亡形态变化：细胞体积缩小，染色质浓聚边集、裂解，细胞表面凸起多个小泡。
诱导肿瘤细胞凋亡的方法
诱导肿瘤细胞凋亡的方法肿瘤细胞是一种具有高度恶性的细胞，它们具有无限增殖能力和抗凋亡能力，这使得肿瘤细胞在体内不断增殖，最终导致癌症的发生。
因此，诱导肿瘤细胞凋亡是治疗癌症的重要手段之一。
本文将介绍几种诱导肿瘤细胞凋亡的方法。
1. 化学药物诱导肿瘤细胞凋亡化学药物是目前治疗癌症的主要手段之一。
化学药物可以通过干扰肿瘤细胞的DNA合成、蛋白质合成和细胞分裂等过程，诱导肿瘤细胞凋亡。
例如，顺铂、紫杉醇等化学药物可以通过干扰肿瘤细胞的微管聚合和DNA合成，诱导肿瘤细胞凋亡。
2. 光动力疗法诱导肿瘤细胞凋亡光动力疗法是一种新型的治疗癌症的方法。
光动力疗法通过将光敏剂注入肿瘤细胞内，然后用激光照射肿瘤细胞，使光敏剂发生光化学反应，产生活性氧，破坏肿瘤细胞的结构和功能，最终诱导肿瘤细胞凋亡。
3. RNA干扰诱导肿瘤细胞凋亡RNA干扰是一种新型的基因治疗方法。
RNA干扰可以通过特异性地靶向肿瘤细胞的基因，抑制肿瘤细胞的生长和增殖，最终诱导肿瘤细胞凋亡。
例如，siRNA可以靶向肿瘤细胞的Bcl-2基因，抑制Bcl-2的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡。
4. 免疫治疗诱导肿瘤细胞凋亡免疫治疗是一种新型的治疗癌症的方法。
免疫治疗可以通过激活机体免疫系统，识别和攻击肿瘤细胞，最终诱导肿瘤细胞凋亡。
例如，CAR-T细胞治疗可以通过将患者的T细胞改造成能够识别和攻击肿瘤细胞的CAR-T细胞，最终诱导肿瘤细胞凋亡。
总之，诱导肿瘤细胞凋亡是治疗癌症的重要手段之一。
化学药物、光动力疗法、RNA干扰和免疫治疗等方法都可以诱导肿瘤细胞凋亡。
未来，随着科技的不断进步，相信会有更多更有效的方法诱导肿瘤细胞凋亡，为治疗癌症提供更多的选择。
IL-17A_基因敲除对氟诱导小鼠肝炎症反应和肝细胞凋亡的影响
畜牧兽医学报 2023,54(7):3108-3117A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.07.041开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):I L -17A 基因敲除对氟诱导小鼠肝炎症反应和肝细胞凋亡的影响赵阳飞,于洋欢,王金明,张建海,孙子龙,牛瑞燕,王俊东*(山西农业大学动物医学学院,太谷030801)摘 要:畜禽水和食物中广泛存在的氟严重威胁着畜禽的肝健康和动物性食品的安全㊂为阐明氟致肝损伤的内在机制,明确I L -17A 在氟诱导肝炎症反应和肝细胞凋亡中的调节作用,本研究将24只野生型C 57小鼠和12只I L -17A 基因敲除小鼠随机分为对照组㊁N a F 组㊁K O+N a F 组㊂同时,运用H E 染色观察肝的组织形态变化,并通过E L I S A ㊁流式细胞术㊁免疫组化检测肝中炎症细胞㊁炎症因子㊁凋亡的变化情况㊂结果显示,氟暴露诱导了肝组织结构损伤,增加了肝中炎症因子(T N F -α㊁I L -17A ㊁I N F -γ㊁I L -23㊁T G F -β)㊁M 2型巨噬细胞和树突状细胞的水平,并降低了I L -1β㊁自然杀伤细胞㊁γδT 细胞㊁C D 4+T 细胞水平和C D 4+T 细胞/C D 8+T 细胞比值㊂同时,凋亡检测结果显示,氟暴露增加了肝中凋亡细胞的数量和凋亡关键基因(C y t -c ㊁C a s pa s e 3)的蛋白表达水平㊂然而,与N a F 组相比,K O+N a F 组的肝损伤减轻,肝中炎症因子(T N F α㊁I L -17A ㊁I N F -γ㊁I L -23㊁T G F -β)和树突状细胞含量显著降低,I L -1β表达水平显著升高,且凋亡细胞数量㊁C y t -c 和C a s p a s e 3的蛋白表达水平显著降低㊂综上表明,I L -17A 基因敲除能够缓解氟诱导的炎症反应和肝细胞凋亡㊂本研究为氟中毒性肝损伤的研究和科学防治提供理论依据和新思路㊂关键词:氟中毒;I L -17A ;肝;炎症反应;凋亡中图分类号:S 856.9 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)07-3108-10收稿日期:2022-11-28基金项目:山西省应用基础研究计划(20210302124063)作者简介:赵阳飞(1991-),男,山西阳城人,讲师,博士,主要从事环境兽医学及动物营养代谢病研究,E -m a i l :z y f 91s k y @163.c o m *通信作者:王俊东,主要从事环境兽医学及动物营养代谢病研究,E -m a i l :w a n g jd 53@o u t l o o k .c o m E f fe c t s of I L -17A K n o c k o u t o n F l u o r i d e -I n d u c e d H e pa t i c I n f l a m m a t i o n a n d H e p a t o c y t e A p o pt o s i s Z H A O Y a n g f e i ,Y U Y a n g h u a n ,WA N G J i n m i n g ,Z H A N G J i a n h a i ,S U N Z i l o n g ,N I U R u i ya n ,WA N G J u n d o n g*(C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,S h a n x i A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,T a i gu 030801,C h i n a )A b s t r a c t :T h e f l u o r i d e w i d e l y p r e s e n t i n w a t e r a n d f o o d o f l i v e s t o c k a n d p o u l t r y s e r i o u s l y th r e a t -e n s t h e l i v e r h e a l t h o f l i v e s t o c k a n d p o u l t r y a n d t h e s a f e t y of a n i m a l f o o d .T o e l u c i d a t e t h e i n t e r -n a l m e c h a n i s m o f f l u o r i d e -i n d u c e d l i v e r i n j u r y ,a n d c l a r i f y t h e r eg u l a t o r y ro l e o f I L -17A i n f l u o r -i d e -i n d u c e d l i v e r i n f l a mm a t i o n a n d h e p a t o c y t e a p o p t o s i s ,t h i s s t u d y r a n d o m l y di v i d e d 24w i l d -t y p e C 57m i c e a n d 12I L -17A k n o c k o u t m i c e i n t o c o n t r o l ,N a F ,a n d K O+N a F g r o u ps .I n a d d i -t i o n ,H E s t a i n i n g ,E L I S A ,f l o w c y t o m e t r y ,a n d i mm u n o h i s t o c h e m i s t r y we r e u s e d t o d e t e c t t h e c h a n g e s of m o r p h o l og y ,i n f l a mm a t o r y c e l l s ,i n f l a mm a t o r y f a c t o r s ,a n d a p o pt o s i s i n t h e l i v e r .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t f l u o r i d e e x p o s u r e i n d u c e d l i v e r m o r p h o l o g y d a m a ge ,i n c r e a s e d t h e c o n -t e n t of i n f l a mm a t o r y f a c t o r s (T N F -α,I L -17A ,I N F -γ,I L -23,T G F -β)a n d t h e l e v e l s o f M 2m a c -7期赵阳飞等:I L-17A基因敲除对氟诱导小鼠肝炎症反应和肝细胞凋亡的影响r o p h a g e s a n d d e n d r i t i c c e l l s,d e c r e a s e d t h e l e v e l s o f I L-1β,n a t u r a l k i l l e r c e l l s,γδT c e l l s,C D4+Tc e l l s a nd t he r a t i o of C D4+T c e l l s/C D8+T c e l l s i n t h e l i v e r.I n a d d i t i o n,t h e r e s u l t s o f a p o p t o s i sd e t e c t i o n s h o w e d t h a t f l u o r i d e e x p o s u r e i n c r e a s e d t h e a p o p t o t i c c e l l s a n d t h e p r o t e i n e x p r e s s i o n l e v e l s o f k e y a p o p t o s i s g e n e s C y t-c a n d C a s p a s e3i n t h e l i v e r.H o w e v e r,c o m p a r e d w i t h t h e N a F g r o u p,t h e l i v e r i n j u r y w a s a l l e v i a t e d,t h e c o n t e n t s o f i n f l a mm a t o r y f a c t o r s(I N F-γ,T N F-α, T G F-β,I L-23,I L-17A)a n d d e n d r i t i c c e l l s w e r e s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d,a n d t h e n u m b e r o f a p o p-t o t i c c e l l s a n d t h e p r o t e i n e x p r e s s i o n l e v e l s o f C y t-c a n d C a s p a s e3w e r e s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d i n t h e l i v e r o f K O+N a F g r o u p.I n s u mm a r y,I L-17A k n o c k o u t a l l e v i a t e d f l u o r i d e-i n d u c e d i n f l a m-m a t o r y r e s p o n s e a n d h e p a t o c y t e a p o p t o s i s.T h i s s t u d y p r o v i d e s t h e o r e t i c a l b a s i s a n d n e w i d e a s f o r t h e r e s e a r c h a n d t h e s c i e n t i f i c p r e v e n t i o n/t r e a t m e n t o f f l u o r o t o x i c l i v e r i n j u r y.K e y w o r d s:f l u o r o s i s;I L-17A;l i v e r;i n f l a mm a t o r y r e s p o n s e;a p o p t o s i s*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:WA N G J u n d o n g,E-m a i l:w a n g j d53@o u t l o o k.c o m由于地理因素和环境因素的影响,氟广泛存在于人畜生活的水和食物中㊂长期过量的氟暴露能够导致人畜氟中毒㊂畜禽氟中毒导致繁殖率㊁生产性能㊁使用价值降低,使其成为威胁我国畜牧业发展的潜在因素[1-2]㊂肝作为机体重要的解毒和代谢器官,前期研究氟能够导致肝结构和功能的损伤[3]㊂肝损伤能够导致机体物质代谢紊乱和有害物质的蓄积,进而影响畜禽的生产性能和动物性食品安全㊂因此,深入探究氟致肝损伤的致病机理寻找可能的治疗靶点对于维持畜牧业的可持续发展和动物性食品安全具有重要意义㊂I L-17作为T h17细胞分泌的促炎因子,其家族包含I L17A~F㊂I L-17家族中I L-17A含量最多,且生物活性最强,通常所说的I L-17即I L-17A[4]㊂前期研究发现氟暴露后肝中I L-17A显著升高㊂I L-17A的高表达将导致中性粒细胞的募集和免疫细胞的慢性浸润[5]㊂同时,I L-17A可通过I L-17A受体通路促进细胞因子的产生,导致自身免疫和组织损伤[6]㊂最近的研究发现,I L-17A能够调节多种细胞的凋亡过程[7]㊂凋亡作为清除受损和有害细胞的程序性死亡过程,其与炎症反应密切相关㊂凋亡能够促进炎症病灶受损细胞的清除,而炎症反应过程中产生的炎症因子能够促进凋亡的增加[8-9]㊂然而,炎症反应和凋亡在氟诱导肝损伤中的相互作用关系,及I L-17A在该过程中的调节作用尚不清楚㊂为此,本研究建立I L-17A基因敲除氟中毒小鼠模型,运用H E染色㊁E L I S A㊁流式细胞术㊁免疫组化等技术检测肝的组织形态变化㊁炎症细胞含量㊁炎症因子水平和凋亡情况,进而探究氟对肝炎症反应和凋亡的影响,并明确I L-17A在该过程中的调节作用㊂1材料与方法1.1试验材料C57小鼠和I L-17A基因敲除小鼠购自南模生物有限公司;氟化钠购自S i g m a公司;H E染色试剂盒和B C A蛋白检测试剂盒购自索莱宝科技有限公司;E L I S A试剂盒购自西唐生物科技有限公司;J C-1和A n n e x i n V购自碧云天生物技术研究所;流式细胞抗体购自B D P h a r m i n g e n公司;免疫组化一抗和二抗购自武汉三鹰生物科技有限公司㊂1.2动物模型24只野生型8周龄C57成年雄性小鼠随机分为对照组和N a F组,12只8周龄I L-17A基因敲除雄性小鼠作为K O+N a F组(体重20~25g)㊂对照组饮用去离子水,N a F组和K O+N a F组饮用50m g㊃L-1N a F的去离子水[5]㊂标准实验室条件下按照试验分组饲养12周㊂饲养结束后眼球采血,断颈处死小鼠,收集肝样品㊂1.3H E染色小鼠处死后立即取适量大小肝组织固定于4%多聚甲醛㊂固定后的组织块进行冲洗㊁脱水㊁透明㊁浸蜡㊁包埋㊁切片制成5μm的石蜡切片㊂然后,石蜡切片经过脱蜡至水㊁苏木精(5m i n)和伊红(1 m i n)浸染㊁脱水㊁透明㊁封片㊂最后400倍镜下随机挑选10个区域观察组织中的异常病理变化并记录,并根据记录综合评定每组肝的损伤情况㊂肝的组织形态㊂1.4透射电镜透射电镜用于观察肝的超微结构变化㊂快速切9013畜牧兽医学报54卷取2mm3的新鲜肝组织放入预冷的2.5%戊二醛溶液中固定2h㊂组织块经乙醇和丙酮常规脱水,环氧树脂包埋㊂然后,用超薄切片机制作50~70n m 切片,并用醋酸铀染色液(30m i n)和柠檬酸铅染色液(10m i n)染色㊂最后,用透射电镜观察肝超微结构㊂1.5E L I S A检测用预冷的P B S洗涤肝,并切取适量组织加入到10倍体积的P B S中㊂组织匀浆后,4ħ离心(12000g,15m i n),吸取上清备用㊂然后,B C A测定蛋白浓度,并按照E L I S A试剂盒说明书步骤检测匀浆液中炎症因子(I L-6㊁T N F-α㊁I L-17㊁T G F-β㊁I N F-γ㊁I L-1β㊁I L-23)的含量㊂最后,计算每m g肝组织匀浆液中炎症因子含量=炎症因子含量/蛋白浓度㊂1.6流式细胞检测本研究分别用C D3+/C D4+㊁C D3+/C D8+㊁C D68㊁C D11c㊁C D56㊁C C1㊁γδT C R流式抗体标记C D4+T细胞㊁C D8+T细胞㊁巨噬细胞㊁树突状细胞㊁自然杀伤细胞㊁肥大细胞㊁γδT细胞㊂小鼠处死后,取新鲜肝组织制备细胞悬液㊂细胞悬液经过滤和洗涤后,用裂解液破碎红细胞㊂随后用流式抗体(1ʒ100)孵育30m i n(对于胞内蛋白在抗体孵育前进行固定和破膜)㊂洗涤3次后上机(B D L S R F o r t-e s s a细胞分析仪),并使用F l o w J o处理数据㊂1.7免疫组化石蜡切片常规脱蜡至水,3%H2O2消除内源性过氧化物酶,并用柠檬酸钠-E D T A抗原修复液100ħ修复15m i n㊂P B S洗涤后,兔抗鼠一抗(C a s p a s e3和C y t-c,1ʒ100)4ħ孵育过夜,生物素化的山羊抗兔二抗(1ʒ1500)室温下孵育1h㊂然后,用D A B显色(试验过程中防止组织干燥),并用中性树脂封片㊂最后,用普通显微镜观察和图像分析软件(I m a g e-P r o P l u s)分析光密度值㊂1.8数据统计数据用 xʃs 表示,并用G r a p h P a d P r i s m6分析数据的显著性㊂通过O n e-w a y a n a l y s i s o f v a-r i a n c e(A N O V A)分析,随后进行T u k e y检验㊂P<0.05表示具有统计学意义㊂2结果2.1I L-17A基因敲除对氟诱导的肝组织形态和超微结构损伤的影响通过H E染色和透射电镜观察组织病理学和超微结构变化(图1)㊂结果显示,对照组小鼠的肝形态结构正常,肝索排列紧密且有规则,线粒体和内质网形态正常,无明显异常㊂然而,氟暴露后肝中炎症细胞浸润增加,肝细胞间隙增大,颗粒变性㊁空泡变性㊁核固缩㊁核溶解肝细胞数量增多,线粒体畸形和脊损伤增加,内质网扩张和破碎增加㊂与N a F组相比,I L-17A基因敲除后肝组织结构损伤减轻,核固缩和核溶解细胞数量减少,炎症细胞浸润降低,畸形线粒体数量降低,内质网损伤减轻㊁数量增多㊂结果表明,I L-17A缓黄色箭头:炎症细胞;蓝色剪头:颗粒变性;黄色箭头:空炮变性;橙色箭头:核固缩;紫色箭头:核溶解;N.细胞核;M.线粒体;E.内质网Y e l l o w a r r o w:i n f l a mm a t o r y c e l l s;B l u e a r r o w:p a r t i c l e d e n a t u r a t i o n;Y e l l o w a r r o w:v a c u o l a r d e n a t u r a t i o n;O r a n g e a r r o w: n u c l e a r s o l i d i f i c a t i o n;P u r p l e a r r o w:k a r y o l y s i s;N.N u c l e a r;M.M i t o c h o n d r i a;E.E n d o p l a s m i c r e t i c u l u m图1H E染色(400ˑ,n=6)和透射电镜结果(20000ˑ,n=3)F i g.1T h e r e s u l t s o f H E s t a i n i n g(400ˑ,n=6)a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y(T E M,20000ˑ,n=3) 01137期赵阳飞等:I L-17A基因敲除对氟诱导小鼠肝炎症反应和肝细胞凋亡的影响解了氟诱导的肝组织形态和超微结构损伤㊂2.2I L-17A基因敲除对氟诱导肝炎症因子表达改变的影响本研究运用E L I S A检测炎症反应过程中关键炎症因子(I L-6㊁T N F-α㊁I L-17㊁T G F-β㊁I N F-γ㊁I L-1β㊁I L-23)在肝中的含量(图2)㊂与对照组相比, N a F组肝中T N F-α㊁I L-17㊁I N F-γ㊁I L-23㊁T G F-β的含量显著升高(P<0.05,P<0.01),I L-1β的含量显著降低(P<0.01),然而,与N a F组相比,K O+ N a F组肝中T N F-α㊁I L-17㊁I N F-γ㊁I L-23㊁T G F-β的含量显著降低(P<0.05,P<0.01),I L-1β的含量显著升高(P<0.01)㊂I L-6含量在N a F组和K O+ N a F组无显著变化㊂这些结果表明,I L-17A基因敲除缓解了氟诱导的肝炎症因子表达改变㊂与对照组相比,*.P<0.05,**.P<0.01;#.P<0.05,与N a F组相比,##.P<0.01;下同*.P<0.05,**.P<0.01,v s c o n t r o l g r o u p;#.P<0.05,##.P<0.01,v s N a F g r o u p;T h e s a m e a s b e l o w 图2肝炎症因子E L I S A检测结果(n=8, xʃs)F i g.2E L I S A d e t e c t i o n r e s u l t s o f h e p a t i c i n f l a m m a t o r y f a c t o r s(n=8, xʃs)2.3I L-17A基因敲除对氟诱导肝C D4+T细胞和C D8+T细胞水平改变的影响本研究用流式细胞术检测了肝中C D4+T细胞和C D8+T细胞㊂如图3所示,氟暴露后肝C D4+T 细胞和C D4+T细胞/C D8+T细胞比值显著降低(P<0.05)㊂然而,与N a F组相比,I L-17A基因敲除显著增加了肝中C D4+T细胞和C D4+T细胞/ C D8+T细胞比值(P<0.05)㊂C D8+T细胞在N a F组和K O+N a F组中无显著差异㊂2.4I L-17A基因敲除对氟诱导肝炎症细胞水平改变的影响本研究通过流式细胞术检测肝中树突状细胞㊁巨噬细胞㊁肥大细胞㊁自然杀伤细胞㊁γδT细胞含量观察I L-17A基因敲除对氟诱导肝炎症细胞水平改变的影响(图4)㊂结果显示,与对照组相比,N a F组肝中自然杀伤细胞和γδT细胞显著降低,M2型巨噬细胞和树突状细胞显著升高(P<0.05)㊂I L-17A 基因敲除后肝中树突状细胞与N a F组相比显著降低(P<0.05)㊂同时,K O+N a F组中的γδT细胞和M2型巨噬细胞与对照组比无显著差异㊂上述结果表明,I L-17A基因敲除缓解了氟诱导的肝炎症细胞水平改变㊂2.5I L-17A基因敲除对氟诱导肝细胞凋亡的影响为探究I L-17A基因敲除对氟诱导的肝细胞凋1113畜 牧 兽 医 学 报54卷图3 C D 4+T 细胞和C D 8+T 细胞含量流式检测结果(n =6, x ʃs )F i g .3 T h e f l o w c y t o m e t r y re s u l t s of C D 4+T c e l l a n d C D 8+T c e l l c o n t e n t s (n =6, x ʃs )亡的影响,本研究运用流式细胞术和免疫组化检测了凋亡肝细胞数和凋亡标志蛋白C a s p a s e 3和C y t -c 的蛋白表达水平㊂A n n e x i n V 和P I 双染法是流式细胞术检测细胞凋亡的经典方法,流式结果如图5所示,与对照组相比,N a F 组中肝细胞凋亡率显著增加(P <0.05)㊂然而,与N a F 组相比,K O+N a F组中肝细胞凋亡率显著降低(P <0.05)㊂与流式结果相似,免疫组化结果显示(图6,表1),与对照组相比,N a F 组肝中C a s p a s e 3和C yt -c 的蛋白表达水平极显著增加(P <0.01),而I L -17A 基因敲除显著降低了C a s p a s e 3和C yt -c 蛋白表达与N a F 组相比(P <0.05,P <0.01)㊂结果表明,I L -17A 基因敲除减轻了氟诱导的肝细胞凋亡㊂表1 肝C a s p a s e 3和C y t -c 蛋光密度值统计结果(n =5, x ʃs )T a b l e 1 T h e o p t i c a l d e n s i t y v a l u e s t a t i s t i c a l r e s u l t s o f C a s p a s e 3a n d C yt -c p r o t e i n i n t h e l i v e r (n =5, x ʃs )蛋白名称P r o t e i n n a m e s对照组C o n t r o l g r o u pN a F 组N a F g r o u pK O+N a F 组K O+N a F g r o u pC a s p a s e 30.1775ʃ0.00130.1906ʃ0.0025**0.1835ʃ0.0021#C yt -c 0.1160ʃ0.00290.1834ʃ0.0052**0.1529ʃ0.0046##3 讨 论氟中毒是一种广泛分布于世界许多国家和地区的人畜共患性地方病,中国是受其危害较为严重的国家之一[10]㊂氟中毒主要是由于长期慢性的氟暴露引起,并造成机体多种组织和器官的损伤㊂肝是氟中毒的重要靶器官,氟能够损伤肝的结构和功能,进而影响机体的物质代谢和有害物质的蓄积[1]㊂在一项关于美国青少年血氟含量与肝功能相关性调查的研究发现血清氟含量与肝功能呈负相关,氟暴露影响肝功能,反过来肝功能损伤会影响氟的吸收和代谢过程,这样的恶性循环进一步加重了氟对肝的危害[11]㊂同时,大量研究发现氟暴露能够导致肝中核固缩㊁核溶解㊁空泡变性㊁脂肪变性增多,线粒体和内质网损伤,以及炎症细胞的浸润[5,12]㊂与上述研究结果相似,在本研究中氟暴露导致了肝组织形态和超微结构损伤㊂在前期研究中,作者发现氟暴露后肝中I L -17A 含量和炎症细胞浸润显著增加[5]㊂I L -17A 作为重要的促炎因子,其在炎症的发生和发展过程中发挥重要的调节作用[13]㊂因此,作者推测I L -17A 在氟诱导了肝的炎症损伤中发挥重要的作用㊂I L -17A 参与急慢性炎症过程,I L -17A 的高表达能够促进免疫细胞的慢性浸润和多种炎症因子的21137期赵阳飞等:I L -17A基因敲除对氟诱导小鼠肝炎症反应和肝细胞凋亡的影响图4 巨噬细胞㊁树突状细胞㊁自然杀伤细胞㊁肥大细胞㊁γδT 细胞含量流式检测结果(n =6, x ʃs )F i g .4 T h e f l o w c y t o m e t r y r e s u l t s o f m a c r o p h a ge s ,d e n d r i t i c c e l l s ,n a t u r a l k i l l e r c e l l s ,m a s t c e l l s ,a n d γδT c e l l s c o n t e n t s (n =6, x ʃs )表达,并最终导致炎症反应和组织损伤[14-15]㊂Z h a n g 等[16]研究发现,I L -17A 功能的阻断能够有效缓解胆汁淤积诱导的肝细胞坏死和肝损伤㊂同时,G o m e s 等[17]的研究也发现阻断I L -17A 信号传导可减少脂肪变性和肝损伤,并预防肝细胞癌㊂相似地,在本研究中I L -17A 的基因敲除缓解了氟诱导的肝组织形态损伤㊂为探究I L -17A 基因敲除缓解肝损伤的机制,本研究进一步检测了肝中炎症因子和炎症细胞的变化情况㊂炎症反应是机体抵御不良刺激的一种防御反应,但过强或长期的炎症反应能够诱导机体组织器官的功能损伤[18]㊂已有大量的研究报道外源性毒物能够导致肝中炎症因子和炎性细胞的水平改变,进而引发肝炎症[19]㊂同时,研究发现氟作为广泛存在与水和食物中的外源性毒物能够增加肝中炎症因子I L -2㊁I L -4㊁I L -6㊁I L -13㊁I L -21㊁T N F -α和T G F -β3113畜 牧 兽 医 学 报54卷图5 肝细胞凋亡流式检测结果(n =6, x ʃs )F i g .5 T h e f l o w c y t o m e t r y r e s u l t s o f h e p a t o c y t e a p o pt o s i s (n =6, x ʃs)图6 肝C a s p a s e 3和C y t -c 蛋白免疫组化结果(400ˑ)F i g .6 C a s p a s e 3a n d C yt -c i m m u n o h i s t o c h e m i c a l r e s u l t s (400ˑ)水平升高,以及I F N -γ/I L -4和I L -2/I L -10比值的降低[20]㊂与上述结果相似,本研究中氟暴露增加了肝中T N F -α㊁I L -17A ㊁I N F -γ㊁I L -23㊁T G F -β含量,以及M 2型巨噬细胞和树突状细胞水平㊂同时,氟暴露降低了I L -1β㊁自然杀伤细胞㊁γδT 细胞和C D 4+T 细胞水平,以及C D 4+T 细胞/C D 8+T 细胞比值㊂I L -23㊁I L -17㊁T N F -α㊁I N F -γ㊁I L -1β是关键的促炎细胞因子,T G F -β是关键的抑炎细胞因子[21]㊂巨噬细胞㊁树突状细胞㊁T 淋巴细胞㊁自然杀伤细胞㊁γδT 细胞能够产生炎症因子,并介导炎症反应过程[18]㊂C D 4+T 细胞是机体免疫力的重要指标,其含量降低表明机体免疫力减弱㊂C D 4+T 细胞/C D 8+T 细41137期赵阳飞等:I L-17A基因敲除对氟诱导小鼠肝炎症反应和肝细胞凋亡的影响胞比值是免疫调节的一项重要指标,其比值的异常表明免疫功能的紊乱[22]㊂这些结果表明氟暴露降低了肝的免疫能力,扰乱了肝炎症平衡,增加了肝的炎症反应㊂I L-17A作为炎症反应过程中重要的促炎因子,其不仅能够增加炎症因子的分泌,而且能够促进炎症细胞在受损组织中的浸润[14]㊂Z h a n g 等[16]发现阻断I L-17A的作用显著减少肝中促炎细胞因子㊁中性粒细胞㊁巨噬细胞的流入㊂在本试验中,与N a F组相比,I L-17A基因敲除降低了肝中T N Fα㊁I L-17A㊁I N F-γ㊁I L-23㊁T G F-β的表达水平和树突状细胞含量,增加了I L-1β的表达水平㊂虽γδT细胞和M2型巨噬细胞与氟组无显著差异,但其与对照组比无显著差异㊂有趣的是在本研究中I L-1β㊁自然杀伤细胞和γδT细胞在氟组降低,且I L-17A基因敲除增加了I L-1β水平㊂I L-1β结果可能的机制:I L-1β作为组织的细胞防御和组织修复的关键因子,其在细胞增殖㊁分化和凋亡等生物过程中发挥重要作用㊂肝作为自我修复能力较强的器官,受到氟的损伤后启动修复机制,抑制了I L-1β的表达㊂I L-17A基因的敲除能够缓解氟诱导的肝损伤,从而促进I L-1β的表达趋于正常㊂自然杀伤细胞和γδT细胞结果可能的机制:自然杀伤细胞和γδT细胞较为敏感,容易受到外源性毒物氟的刺激,激活细胞的凋亡程序,进而导致肝中自然杀伤细胞和γδT细胞数量的降低㊂自然杀伤细胞和γδT细胞作为机体重要的免疫细胞,其数量的减少能够降低机体的免疫力,进一步影响机体的炎症反应㊂同时,I L-17A基因的敲除未参与到上述诱导自然杀伤细胞和γδT细胞凋亡的过程㊂因此,I L-17A基因的敲除未缓解氟诱导的上述改变㊂在未来的研究中作者将进一步探究I L-1β㊁自然杀伤细胞和γδT 细胞在氟致肝损伤中的作用机制㊂上述结果表明, I L-17A基因敲除缓解了氟诱导的肝炎症损伤㊂已有大量研究发现,炎症反应与细胞凋亡密切相关,一方面大量的炎症因子能够诱导细胞凋亡的发生,另一方面细胞凋亡能够清除炎症病灶内中性粒细胞和其他滞留细胞,限制组织损伤,促进炎症吸收[23]㊂因此,本研究进一步探究了I L-17A基因敲除对氟诱导的肝细胞凋亡的影响㊂细胞凋亡是一种维持细胞微环境稳态的细胞自主性和程序性死亡方式㊂在生理条件下,机体通过凋亡去除不需要的和异常的细胞㊂而在病理条件下,受不利条件刺激细胞凋亡增加,导致正常细胞损伤[24]㊂已有研究发现,氟可导致肝细胞的凋亡增加[25-26]㊂例如,O u y a n g等[25]报道氟通过C y t-c/ C a s p a s e3/9通路诱导了鸭肝细胞的凋亡㊂L u等[26]报道氟通过氧化应激和凋亡导致了小鼠肝损伤㊂与上述研究结果相似,本研究中氟暴露增加了肝中的凋亡细胞,以及凋亡关键基因C y t-c和C a s p a s e3的蛋白表达水平㊂C y t-c是凋亡C a s p a s e级联反应的关键蛋白酶激活因子,C a s p a s e3是介导凋亡信号和执行细胞凋亡的关键激酶[8]㊂同时,本研究发现I L-17A基因敲除减轻了氟诱导的肝细胞凋亡,降低了C y t-c和C a s p a s e3的蛋白表达水平㊂在外源性毒物诱导肝炎症的研究发现,I L-17A作为重要炎症因子,其能够刺激多种细胞释放金属蛋白酶和炎症因子,促进炎症细胞的募集和肝炎症反应[14]㊂最近研究发现,I L-17A能够通过I L-17A受体通路调节细胞自噬㊁线粒体损伤㊁凋亡等生物过程[27-28]㊂例如,K i m等[27]研究发现I L-17A通过损伤线粒体功能诱导滑膜成纤维细胞的凋亡㊂因此,I L-17A缓解氟诱导的肝细胞凋亡的机制可能是氟引起了肝的炎症反应,炎症因子的大量释放刺激肝细胞的凋亡,同时氟作为外源性毒物能够激活I L-17A受体通路诱导肝细胞凋亡㊂然而,I L-17A基因的敲除缓解了氟诱导的肝炎症反应,减轻了炎症因子刺激的凋亡,并阻断了I L-17A受体通路诱导的肝细胞凋亡㊂4结论氟暴露损伤了肝的组织形态,并改变了肝内炎症因子(T N F-α㊁I L-17㊁I N F-γ㊁I L-23㊁T G F-β㊁I L-1β)和炎症细胞(M2型巨噬细胞㊁树突状细胞㊁C D4+T 细胞㊁自然杀伤细胞㊁γδT细胞)的水平㊂同时,氟暴露诱导了肝细胞凋亡㊂然而,I L-17A基因敲除能够缓解氟诱导的肝炎症反应,并减轻氟诱导的肝细胞凋亡㊂本研究明确了I L-17A在氟诱导肝炎症反应和凋亡中的作用,并进一步揭示了氟肝毒性的内在机理,为氟中毒的防治提供了理论依据㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] Z HA O S Y,G U O J X,X U E H J,e t a l.S y s t e m a t i ci m p a c t s o f f l u o r i d e e x p o s u r e o n t h e m e t a b o l o m i c s o fr a t s[J].E c o t o x i c o l E n v i r o n S a f,2022,242:113888.[2]龚涛,陈涛,柏才敏,等.高氟对雏鸡肝细胞周期和凋亡影响的研究[J].畜牧兽医学报,2009,405113畜牧兽医学报54卷(11):1675-1680.G O N G T,C H E N T,B A I C M,e t a l.E f f e c t o fd ie t a r y h i g hf l u o r i n e o n t h e c e l l c y c l e a n d a p o 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细胞与分子免疫学---第三部分问答
第14章细胞凋亡与免疫PCD, programmed cell death第一节细胞凋亡概述诱导凋亡制剂：1、Ca＋＋/Mg++：为内源性DNA内切酶所依赖，Zn2＋能拮抗之.2、糖皮质激素：常见的凋亡诱导剂,机制为促进凋亡相关蛋白质合成，可被蛋白合成抑制剂抑制。
3、细胞因子：IL-2:可增强Fas途径介导的AICD,增加FasL的转录和表达,并抑制ＦＬＩＰ(Fas信号抑制剂)的转录和表达IL-10:可通过Fas/ FasL，使活动型SLE病人PBMC凋亡IL-12:促进TNF /TNFR途径引起的凋亡;IFN-γ:使高表达IFN-γR的T细胞凋亡；TNF、TGF- β：促进凋亡。
4、抗原：Ag结合sIgM，sIgM交联，PKC激活，胞内钙库释放，诱发细胞凋亡。
5、抗体：抗sIgM、Fas、CD3/TCR、CD4、CD8 CD23等抗体诱导表达相应膜抗原的细胞发生凋亡。
6、超抗原及丝裂原：SAg金葡菌肠毒素诱导胸腺内DP细胞凋亡，PWM诱导T细胞凋亡抑制凋亡制剂⏹细胞因子：IL-2：可抑制糖皮质激素诱导的Ｔｈ1细胞的凋亡,其抑制凋亡的机制可能是通过蛋白激酶Ｃ(PKC)活化途径实现的； IL-4:可抑制糖皮质激素诱导的Th2细胞凋亡。
这可能是通过bcl-2的高表达或通过活化PKC途径实现的；IL-10:可抑制感染细胞的凋亡；IL-12:可抵抗60Ｃo,γ射线引起的小鼠骨髓细胞凋亡；IFN -γ:抑制低表达IFN –γR T细胞凋亡。
免疫相关的凋亡信号转倒(一)DR介导的信号途径⏹caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶⏹caspase家族:酶作用点为天冬氨酸残基caspase 以酶原形式存在于胞内-激活-剪切caspase-2,8,10,9为起始（上游）caspasecaspase-3,6,7是凋亡效应（下游）caspase. caspase -3可以激活ＤＮＡ降解酶,降解ＤＮＡ导致细胞凋亡FasL+Fas －Fa多聚体化－Fas-DD+DD-FADD(Fas associated protein with death domain)－（N端）FADD-DED+DED-proCaspase8(10)---DISCCas8(10)活化tBid－剪切和激活下游Cas pase 释放细胞色素C,pro-Cas2,3,9－激活Cas3、6、7 激活Cas9 －apoptosis(二)线粒体途径线粒体是各种死亡刺激的感受器。
cisd3基因
cisd3基因CISD3基因是一种与细胞内铁离子代谢相关的基因。
它在人体中的表达与铁离子的吸收、转运和储存等过程密切相关。
近年来，科学家们对CISD3基因进行了深入研究，并发现了它在多种疾病的发生和发展中的重要作用。
CISD3基因编码的蛋白质被称为CISD3，它主要存在于线粒体内膜上。
线粒体是细胞内的一个重要器官，它参与能量代谢和细胞呼吸等重要生物学过程。
CISD3蛋白质的主要功能是调节线粒体内铁离子的平衡，维持细胞内铁离子的稳定水平。
研究发现，CISD3基因的突变与多种疾病的发生有关。
例如，一些研究表明，CISD3基因的突变可能导致铁离子在细胞内的积累，进而引发铁离子过载症。
铁离子过载症是一种常见的遗传性疾病，患者体内的铁离子无法正常代谢和排泄，导致铁离子在体内积累过多，对多个器官和组织造成损害。
此外，CISD3基因的突变还与一些神经系统疾病的发生有关。
例如，一些研究发现，CISD3基因的突变可能导致线粒体功能异常，进而引发帕金森病等神经系统疾病。
帕金森病是一种常见的神经退行性疾病，患者主要表现为肌肉僵硬、震颤和运动障碍等症状。
CISD3基因的突变可能导致线粒体功能受损，进而引发帕金森病的发生。
除了与疾病的发生有关外，CISD3基因还与细胞的生存和凋亡等过程密切相关。
一些研究发现，CISD3基因的表达水平与细胞的存活率和凋亡率呈负相关。
这表明CISD3基因在细胞的生存和凋亡过程中起着重要的调节作用。
总之，CISD3基因是一种与细胞内铁离子代谢相关的基因。
它在人体中的表达与多种疾病的发生和发展密切相关。
通过对CISD3基因的深入研究，我们可以更好地理解细胞内铁离子代谢的调控机制，为相关疾病的预防和治疗提供新的思路和方法。
未来，我们还需要进一步研究CISD3基因的功能和调控机制，以期能够更好地应用于临床实践，造福人类健康。
医学研究生病理生理资料-细胞凋亡(交)
形态特征：染色质边集、凋亡小体形成； 生化特征：DNA片段化，即形成寡核苷酸，
片段为200bp整数倍；凝胶电泳“梯带”。
区别
坏死
凋亡
诱导因素 生化特点
细胞形状 形态变化
染色质 DNA电泳
炎症反应
基因调控 潜伏期
强烈刺激，病理 被动过程，无新蛋白合 成，不耗能 形成碎片 细胞结构全面溶解、破 坏、细胞肿胀 稀疏、松散、呈絮状 弥散性降解，电泳呈均一 片状，即“拖带” 溶酶体破裂，局部炎症反 应
C.4-6Gy低剂量照射16小时后，人急性T细胞白血病有效；高温.高热43度， 30分钟肿瘤细胞有效；切除睾丸对前列腺癌有效。
Bcl-2基因在不同类型的肿瘤中过度表达的频率(%)
肿瘤类型 结肠-直肠癌
咽癌 骨髓癌 乳腺癌 非何杰金淋巴瘤 胃癌 前列腺癌 神经母细胞瘤 肺癌(小细胞肺癌)
Bcl-2基因过度表达频率(%) 92 85 80 70 65-70 60-70 30-60 30-35 20(80)
1. BcL-2家族分子
A 、Bcl-2----B cell lymphoma/leukemia-2
Bcl-2蛋白主要分布在线粒体内膜、细胞内膜表面、内质网、 核膜等处，并具有高效阻抑射线、化学药物等引发的细胞凋亡；
Bcl-2基因广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经 细胞以及多种瘤细胞中，因此具有促进细胞存活的功能；
凋亡相关性疾病/即病理意义
1.凋亡不足：肿瘤、自身免疫病； 2.凋亡过度： 心肌缺血、心力衰竭、AD 3.不足与过度并存：AS、AIDS
(一)凋亡不足疾病
1、肿瘤
凋亡依据
A.细胞数总量动态平衡，即死亡数与存活数平衡；
细胞凋亡信通路详细与总结
p53
➢ p53 是一种抑癌基因;其生物学功能是在G期监视 DNA的完整性; 如有损伤;则抑制细胞增殖;直到 DNA修复完成; 如果DNA不能被修复;则诱导其调亡;
➢ 在依赖P53蛋白的细胞凋亡中;P53蛋白能特异地抑 制 Bcl2 的表达;但对 Bax 的表达则有明显的促进作 用; 在这些细胞中; P53蛋白的积累和活动引起了细 胞凋亡;
解 DNA; –CAD 为caspaseactivated Dnase脱氧核苷酸酶;存在于胞质中;
细胞色素释 放引起的凋 亡线粒体凋 亡通路
死亡受体凋亡通路
fas 又称作 APO1; TNFR 肿瘤坏死因子受体和 NGF 受体家族; 1993 年人白细胞分型国际会议统一命名为 CD95; Fas 蛋白受体与 Fas 配体组成 Fas 系统;二者的结合 导致靶细胞走向凋亡;
信号转导研究方法
• 免疫共沉淀 • 荧光共振能量转移FRET • 荧光漂白恢复 • 荧光相关光谱 • 免疫荧光显微技术 • 电镜显微技术
=TNF
• Fas 具有三个富含半胱氨酸的胞外区 和一个称为死亡结构域Death domain;DD的胞内区;
• Fas 的配体 FasLFas ligand与 受Ffa体ass家又结族称;合作后AP;OFa1;s属三TN聚F化肿瘤使坏死因子受体和 NGF 胞后19内与93的接年D头人D蛋白区白细构胞象分改型国变际;然会议统一命名为 CD95;
凋亡促进剂，亦可作抑制剂，可与 BCL-2，BCL-X 和 E1B19K 结合
凋亡抑制剂
凋亡促进剂，与 BCL-2 和 BCL-XL 结合 线虫中的凋亡抑制剂，BCL-2 同源物 腺病毒凋亡抑制剂，与 Bax 和 Bak 结合
Bcl2家族 引自Katja C Zimmermann等2001
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诱导细胞凋亡的相关基因
细胞凋亡是细胞自我死亡的一种形式，是维持生命平衡状态的重要过程。
这个过程涉及到很多的基因和分子通路。
通过研究这些基因和分子通路，我们可以更好地了解细胞凋亡的机制，并为治疗多种疾病提供新的思路和方法。
本文就讨论一些诱导细胞凋亡的相关基因。
1. p53基因
p53基因是人类最重要的抑癌基因之一。
它是一种转录因子，
可以调节多种基因的表达，从而影响细胞周期和凋亡。
当细胞处于DNA损伤或某些压力条件下，p53会被激活并引发DNA
修复或细胞凋亡等一系列细胞生物学反应。
在诱导细胞凋亡过程中，p53通过调控Bcl-2家族成员、p21、PUMA等靶基因的表达，诱导线粒体通途的打开和协同机制的激活，最终导致细胞凋亡。
研究表明，p53因子在哺乳动物细胞凋亡过程中发挥
重要的作用。
2. Bcl-2家族成员
Bcl-2家族是调节线粒体通途参与诱导细胞周期的一类蛋白质。
Bcl-2家族分为两类，一类是抗凋亡成员，包括Bcl-2、Bcl-xl 等；另一类是促凋亡成员，包括Bax、Bad等。
这些成员之间
通过形成二聚体或多聚体，调节线粒体通途的打开和协同机制的激活。
在诱导细胞凋亡的过程中，促凋亡成员Bax和Bad
与抗凋亡成员Bcl-2和Bcl-xl之间的平衡起着重要的作用。
当
促凋亡成员的表达量增加或抗凋亡成员的表达量降低时，细胞
就会通过诱导线粒体通途的打开，最终导致凋亡。
3. caspase家族
Caspase家族是模拟飞蛾血凝素激活酶（ICE）的一类半胱氨
酸蛋白酶，当细胞进入凋亡过程时，它们会催化一系列氨基酸的酶解反应，最终导致DNA断裂和细胞死亡。
Caspase家族
包括两类，一类是启动caspace，如caspase-8和caspase-10；
另一类是实施caspase，如caspase-3、caspase-6和caspase-7。
当启动caspase激活时，它可以进入实施caspase通途，从而
直接催化基质蛋白酶的酶解反应，引发细胞死亡。
4. Fas/FasL信号通途
Fas/FasL信号通途是由Fas死亡受体和FasL死因因子两个蛋
白质组成的信号通途。
在正常条件下，FasL与Fas并不结合，当细胞进入凋亡程序并释放FasL时，它们可以结合，从而启
动细胞内部的酶解反应，最终导致细胞凋亡。
在人体的免疫功能方面，Fas/FasL信号通途有很重要的作用，主要通过清除免
疫细胞中的过度或异常细胞来维持免疫系统的正常功能。
5. c-Myc基因
c-Myc基因是一类转录因子，它可以调节多种基因和细胞周期
的进程。
在细胞凋亡过程中，c-Myc通常被认为是一个负性的
调节者。
它与P53基因之间存在一种反调节关系，通过抑制
P53因子的表达，最终导致细胞凋亡。
研究表明，在许多肿瘤
细胞中，c-Myc的过度表达可以抑制P53与Bcl-2家族成员的表达，从而导致肿瘤细胞长期存活和增殖。
综上所述，诱导细胞凋亡过程涉及到多种基因和分子通途的参与。
在以后的研究和临床治疗中，我们需要更深入地了解这些基因和通途在细胞凋亡过程中的功能变化与相互作用，以期为治疗人类的疾病提供有效的更新方法。