离子交换和亲和层析
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C、 用不同pH值0.05mol／L（对Sephadex)或0.01mol／L（对Sepharose或 Sephacel）缓冲液（各管PH值仍与洗涤液相同）平衡5次（每次洗涤、平 衡的上清液均可用倾斜法或离心法除去，但最后一次应采用离心法除去， 试管间操作要尽量一致）
D、同样量的待分离样品加到管中，缓慢混合5～10min ， 静止沉淀 E、测定各管有效成分的含量、绘制出相应图谱（见图5-9A）。
都可聚焦到其等电点位置. ④ 可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01 pH单位。
（5）缺点
① 要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀 ② 不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。
5、离子交换层析
优点：
①具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大； 2有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件便可以洗脱，不致引起蛋
一些pK和pI值各自相异却又 相近的两性电解质
载体两性电解质应具备的条件：
① 在等电点处必须有足够的缓冲能力 ② 在等电点必须有足够高的电导 ③ 分子量要小 ④ 化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定； ⑤ 应不与分离物质反应或使之变性。
聚丙烯酰胺凝胶
等电聚焦的支持介质 琼脂糖凝胶
葡聚糖凝胶
最广泛
4、等电聚焦电泳
（1）基本原理
等电聚焦就是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解 质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度。当蛋白质放进此体系时， 靠近阳极侧的蛋白质处于酸性环境中，带正电荷向负极移动；靠近阴极的蛋 白质处于碱性环境中，带负电荷向正极移动，最终都聚焦于与其等电点相当 的pH位置上，形成不同的蛋白质区带。
由于不同蛋白质有不同的pI，在同一pH下，各种蛋白质 所带的电荷种类和数量不同，因此与离子交换剂的吸附作用 的强弱不同，有些甚至完全不吸附。从而将有不同电荷的蛋 白质分开。然后通过改变缓冲液的盐浓度（离子强度）和 pH，用溶液中的离子置换吸附上的蛋白质，吸附力弱的先洗 脱下来，吸附力强的后洗脱下来，从而使蛋白质混合物的组 分分开。
最适pH(7.0)的选择 在pH7.0以上的缓冲液中，有效成分全部被吸附了。 因此，起始缓冲液（即样品的溶解液和层析柱的平衡液）pH可选 用7.0。
起始缓冲液和限制性缓冲液（洗脱液）离子强度的确定
在各管中加入不同离子强度的缓冲液，经过洗涤、平衡、加样、测定 含量，即可绘制出相应的图谱（见图5-9B）。
强阳离子交换剂
乙基磺酸基团（-O-CH2-CH2-SO3H）
磷酸基团（-OPO3H2） 亚磷酸基团（-OPO2H）
中强阳离子交换剂
酚羟基（-
）
羧酸（-COOH）
弱阳离子交换剂
强酸性：R−S03−. H+ + Na+ 弱酸性：R−COO–H + + Na+
R−S03−. Na + + H + R−COO– Na + +H+
束缚(0.15mol/L)和洗脱(>0.3mol/L)时盐浓度的选择 当离子强度(μ) <0.15时，样品中的有效成分基本上全被离子交换剂吸附了； 但当μ提高到0.3或0.3以上时，有效成分却全部留存在溶液中。 因此，起始缓冲液的μ应确定为≤0．15，
而限制性缓冲液的μ应确定为≥0.3。
3）加样量的确定
阳离子交换剂有: 羧甲基纤维素（CM- 纤维素）， 阴离子交换剂有: 二乙基氨基乙基纤维素（DEAE- 纤维素）
3交联葡聚糖离子交换剂：
是将交换基团连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂，因
而既具有离子交换作用，又具有分子筛效应，是一类广泛应
用的色谱分离物质。
非特异性吸附少， 特点： 不易使蛋白质变性，
2）阴离子交换剂
季胺盐[−N+ (CH3)3] 三乙基氨基乙基[-O-（CH2)2−N+ (C2H5)3] 叔胺[−N+H（CH3）2］
仲胺盐(−N+H2CH3) 伯胺盐（−N+H3） 二乙基氨基乙基[-O-(CH2)2- N+H(C2H5)2] 氨基乙基[-O-(CH2)2N+H3]
某些wenku.baidu.com换反应如下：
① 阴、阳离子交换剂的选择
对于未知等电点的物质 可参照电泳的结果 在中性或偏碱性的条件下进行电泳， 向阳极移动较快的物质，在同样条件下可被阴离子交换剂吸附； 向阴极移动或向阳极移动较慢的，可被阴离子交换剂吸附。
② 强、弱离子交换剂的选择
强性离子交换剂: 应用范围广，但选择性低，所以常用它来制备 无离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的 物质。比如简单的、复杂的、无机的及有机的阳离子 都可与强酸性阳离子交换。
为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此， 强阳性和强阴性离子交换剂应分别选择H型和0H型； 弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。
④ 不同基质离子交换剂的选择
树脂基质是疏水性化合物 而纤维素、葡聚糖和琼脂糖基质则是亲水性化合物。
在分离生命大分子物质时，一般认为后三种基质(亲水性 化合物)比前一种基质(疏水性化合物)更为优越。由于后三种是 亲水性的，且对生命大分子物质的吸附和洗脱都比前者温和， 所以采用后者基质制成的离子交换剂，被分离物质活性不易受 到破坏。
白质变性或酶的失活； 3多孔性，表面积大、交换容量大、回收率高，可用于分离和制备。
（1）基本原理
基质 离子交换剂是由 电荷基团（或功能基团）
反离子
纤维素—O—CH2 — COO−—Na+
基质
电荷基团 反离子
图5．羧甲基纤维素离子交换剂组成示意图
离子交换剂与生物大分子间的亲和力取决于:
每个分子能够和离子交换剂形成的 静电键的数目 电荷数目多寡 与分子中电荷的排布有关。
洗脱方法
增加缓冲液的离子强度 改变pH ，
洗脱方式
梯度洗脱： 阶段洗脱：
（2）离子交换剂的分类和性质
离子交换剂应满足下列要求：
① 有高度的不溶性 ② 有疏松的多孔结构或巨大的表面积 ③ 有较多的交换基团 ④ 有稳定的物理化学性质
离子交换剂的分型
1）阳离子交换剂
磺酸基团（-OSO3H）
甲基磺酸基团（-O-CH2-SO3 H）
2）缓冲液的选择
选用的起始缓冲液
其pH值和离子强度等能使样品中有效成分与离子交换剂结 合，而不能使样品中杂质与离子交换剂结合.
如选用阴离子交换剂, pH值一般比有效成分的pI值高一个单位; 选用阳离子交换剂, pH值一般比有效成分的pI值低一个单位; 离子强度为0.1时，就能很快把有效成分与杂质分开。 选用的洗脱液 其离子强度和pH值应使有效成分从离子交换剂上解离下来， 一般离子强度要比起始缓冲液高，pH值是随着离子交换剂性 质变化而变化。
交换容量
指单位重量交换剂中可解离基团的数量，是离子交换剂的特性 常用单位重量或单位容积交换剂的能交换的毫克当量离子来表示；
影响交换容量的因子：
筛孔 离子强度 pH
（3）离子交换层析条件的选择
1）离子交换剂的选择
交换容量是提供交换离子的量度，是选用交换剂数量的 重要参考依据。
选用何种交换剂还要根据被分离的物质所带电荷、分子 大小，及是否耐酸碱等对离子交换剂进行选择。
例如聚苯乙烯磺化型离子交换树脂是由苯乙烯与二乙烯苯共聚和 再磺化引入磺酸基合成。磺酸根连在树脂上，氢离子与磺酸 根的负电荷互相平衡，可与外来离子相互交换。
特点： 交联孔径小，吸附力太牢，要求洗脱条件剧烈 不适用于大分子的蛋白质分离纯化 多用于小肽和氨基酸的分离纯化及无离子水的制备。
2纤维素离子交换剂： 是以微晶纤维素为基质，通过化学方法引入电荷基团构成的。 离子交换纤维素分子上的羟基被离子基团取代。 特点： 对蛋白质的交换容量大，结合力弱， 洗脱条件缓和， 因而是分离纯化生物活性大分子的理想的工具。
强阴离子交换剂 弱阴离子交换剂
强碱性：R−N+ ( CH3)3 OH– + Cl− 弱碱性：R− NH3 +(OH) – + Cl−
R−N+(CH3)2Cl– + OH− R−NH3 +Cl –+ OH−
离子交换剂根据化学性质分为三类：
1树脂离子交换剂：
由苯乙烯和二乙烯苯的共聚物作为骨架，再引入所需的酸性基团 或碱性基团。
故交换容量很高
能引入大量活性基团而不破坏骨架
阳离子交换剂有:SE-Sephadex(强) CM-Sephadex(弱)
阴离子交换剂有：QAE-Sephadex(强) DEAE- Sephadex（弱）
表7-6 一些常用的纤维素离子交换剂和Sephadex离子交换剂
离子交换剂 I、阳离子交换剂
CM-纤维素（弱酸型） P-纤维素（中强酸型） SE-纤维素（强酸型） SP-Sephadex(强酸型) II、阴离子交换剂
① 阴、阳离子交换剂的选择
对于已知等电点的物质
当pH< pI时, 应选择阳离子交换剂； 当pH> pI时, 应选择阴离子交换剂； 如果被分离物质为两性离子，则一般应根据其在稳定的pH范 围内所带电荷来选择交换剂。 例如，一蛋白质的pI为5． 若该物质在pH5～8稳定时，则应选择阴离子交换剂； 若该物质在pH5以下稳定时，则可选择阳离子交换剂。
弱性离子交换剂 选择性较高，适用的pH范围较窄，这种离子交 换剂在pH为中性的溶液中交换容量也高，用它分离生 命大分子物质时，其活性不易丧失。所以，分离生物 样品习惯采用弱性离子交换剂
③ 不同离子型交换剂的选择
离子交换剂处于电中性时往往带有一定的反离子。
如阳离子交换剂的反离子可以是
H+ (称H型） Na+ （称Na型） NH4+等
五、亲和层析 利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法
优点: 可对天然生物活性物质进行高特异性的分离和纯化。
（一）基本原理
抗原和抗体
激素和受体
酶和底物及辅酶 酶和抑制剂
酶和调节效应物 RNA和其互补的DNA等
生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力。
亲和层析的过程
配基固相化：将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在 水不溶 性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称 亲和柱）。
1）吸附阶段：
①紧密吸附：静电键的数目相当多，以致它们同时解离的概率为零。 处于此状态的物质，被吸附于柱顶而不下移。
②有限吸附平衡：静电键的数目较少，它们同时解离的概率达到一 个有限值（0∼1间）。只有在此范围内才能达到较高的 分辨率。
③解吸状态：静电键数目极少，同时解离的概率为1，完全不吸附。
2）洗脱（解吸附）阶段：
在pH7.0 0.1mol/L盐浓度时,最佳操作容量(总交换量的40%)的选择
在10支盛离子交换剂的试管中，先用相同缓冲液进行充分洗涤、平 衡，然后按总交换容量的百分数，分别加入不同量的样品液，吸附毕， 取上清液测定待分离物的含量，并绘制相应图谱（见图59C）。
从图看出，离子交换剂的总交换容量达40％时，其吸附力已呈饱和 状态。这表明该交换剂中加入样品液的最大量为总交换容量的40％。
（3）等电聚焦电泳的方式
垂直管式 毛细管式 水平板式 超薄水平板式
分析样品多 两性电解质用量少 结果重复性好
（4）优点
① 有很高的分辨率，可将等电点相差0.01～0.02 pH单位的蛋白质分开； ② 能抵消扩散作用，使区带越走越窄。一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时
间和泳动距离加长，区带越走越宽 ③ 很稀的样品也可进行分离. 由于这种等电聚焦作用，不管样品加在什么部位，
缓冲液选择的关键在于:了解有效成分的等电点。 初步选择缓冲液（pH值）的简便方法 ：
A、取10支1.5ml试管，在各管中加入0.1g Sephadex或1.5ml Sepharose（或 Sephacel）离子交换剂
B、用不同pH值0.5mol／L缓冲液分别洗涤10次 （阴离子交换剂选pH5～9，阳 离子选pH4～8，配方见表5-8)
可电离基团
羧甲基 磷酸基 磺乙基 磺丙基
AE-纤维素（弱碱型） PAB-纤维素（弱碱型） DEAE-纤维素（中强碱型） DEAE-Sephadex（中强碱型） TEAE-纤维素（强碱型） QAE-Sephadex（强碱型）
氨基乙基 对氨基苯甲基 二乙基氨基乙基 二乙基氨基乙基 三乙基氨基乙基 二乙基（2-羟丙基）-氨基乙基
(2) pH梯度的建立。
人工pH梯度：用两种不同pH的缓冲液互相扩散，在混合区形成pH梯度。 天然pH梯度：利用载体两性电解质（carrier ampholytes）在电场作用下自
然形成pH梯度。该方法是常用的方法
低pH
+
H2SO4 两性电解质(带正电)
高pH
甲(酸性很强) 乙(等电点稍高于甲)
两性电解质(带负电) NaOH −
D、同样量的待分离样品加到管中，缓慢混合5～10min ， 静止沉淀 E、测定各管有效成分的含量、绘制出相应图谱（见图5-9A）。
都可聚焦到其等电点位置. ④ 可直接测出蛋白质的等电点，其精确度可达0.01 pH单位。
（5）缺点
① 要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀 ② 不适用在等电点不溶或发生变性的蛋白质。
5、离子交换层析
优点：
①具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大； 2有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件便可以洗脱，不致引起蛋
一些pK和pI值各自相异却又 相近的两性电解质
载体两性电解质应具备的条件：
① 在等电点处必须有足够的缓冲能力 ② 在等电点必须有足够高的电导 ③ 分子量要小 ④ 化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定； ⑤ 应不与分离物质反应或使之变性。
聚丙烯酰胺凝胶
等电聚焦的支持介质 琼脂糖凝胶
葡聚糖凝胶
最广泛
4、等电聚焦电泳
（1）基本原理
等电聚焦就是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解 质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度。当蛋白质放进此体系时， 靠近阳极侧的蛋白质处于酸性环境中，带正电荷向负极移动；靠近阴极的蛋 白质处于碱性环境中，带负电荷向正极移动，最终都聚焦于与其等电点相当 的pH位置上，形成不同的蛋白质区带。
由于不同蛋白质有不同的pI，在同一pH下，各种蛋白质 所带的电荷种类和数量不同，因此与离子交换剂的吸附作用 的强弱不同，有些甚至完全不吸附。从而将有不同电荷的蛋 白质分开。然后通过改变缓冲液的盐浓度（离子强度）和 pH，用溶液中的离子置换吸附上的蛋白质，吸附力弱的先洗 脱下来，吸附力强的后洗脱下来，从而使蛋白质混合物的组 分分开。
最适pH(7.0)的选择 在pH7.0以上的缓冲液中，有效成分全部被吸附了。 因此，起始缓冲液（即样品的溶解液和层析柱的平衡液）pH可选 用7.0。
起始缓冲液和限制性缓冲液（洗脱液）离子强度的确定
在各管中加入不同离子强度的缓冲液，经过洗涤、平衡、加样、测定 含量，即可绘制出相应的图谱（见图5-9B）。
强阳离子交换剂
乙基磺酸基团（-O-CH2-CH2-SO3H）
磷酸基团（-OPO3H2） 亚磷酸基团（-OPO2H）
中强阳离子交换剂
酚羟基（-
）
羧酸（-COOH）
弱阳离子交换剂
强酸性：R−S03−. H+ + Na+ 弱酸性：R−COO–H + + Na+
R−S03−. Na + + H + R−COO– Na + +H+
束缚(0.15mol/L)和洗脱(>0.3mol/L)时盐浓度的选择 当离子强度(μ) <0.15时，样品中的有效成分基本上全被离子交换剂吸附了； 但当μ提高到0.3或0.3以上时，有效成分却全部留存在溶液中。 因此，起始缓冲液的μ应确定为≤0．15，
而限制性缓冲液的μ应确定为≥0.3。
3）加样量的确定
阳离子交换剂有: 羧甲基纤维素（CM- 纤维素）， 阴离子交换剂有: 二乙基氨基乙基纤维素（DEAE- 纤维素）
3交联葡聚糖离子交换剂：
是将交换基团连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂，因
而既具有离子交换作用，又具有分子筛效应，是一类广泛应
用的色谱分离物质。
非特异性吸附少， 特点： 不易使蛋白质变性，
2）阴离子交换剂
季胺盐[−N+ (CH3)3] 三乙基氨基乙基[-O-（CH2)2−N+ (C2H5)3] 叔胺[−N+H（CH3）2］
仲胺盐(−N+H2CH3) 伯胺盐（−N+H3） 二乙基氨基乙基[-O-(CH2)2- N+H(C2H5)2] 氨基乙基[-O-(CH2)2N+H3]
某些wenku.baidu.com换反应如下：
① 阴、阳离子交换剂的选择
对于未知等电点的物质 可参照电泳的结果 在中性或偏碱性的条件下进行电泳， 向阳极移动较快的物质，在同样条件下可被阴离子交换剂吸附； 向阴极移动或向阳极移动较慢的，可被阴离子交换剂吸附。
② 强、弱离子交换剂的选择
强性离子交换剂: 应用范围广，但选择性低，所以常用它来制备 无离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的 物质。比如简单的、复杂的、无机的及有机的阳离子 都可与强酸性阳离子交换。
为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此， 强阳性和强阴性离子交换剂应分别选择H型和0H型； 弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。
④ 不同基质离子交换剂的选择
树脂基质是疏水性化合物 而纤维素、葡聚糖和琼脂糖基质则是亲水性化合物。
在分离生命大分子物质时，一般认为后三种基质(亲水性 化合物)比前一种基质(疏水性化合物)更为优越。由于后三种是 亲水性的，且对生命大分子物质的吸附和洗脱都比前者温和， 所以采用后者基质制成的离子交换剂，被分离物质活性不易受 到破坏。
白质变性或酶的失活； 3多孔性，表面积大、交换容量大、回收率高，可用于分离和制备。
（1）基本原理
基质 离子交换剂是由 电荷基团（或功能基团）
反离子
纤维素—O—CH2 — COO−—Na+
基质
电荷基团 反离子
图5．羧甲基纤维素离子交换剂组成示意图
离子交换剂与生物大分子间的亲和力取决于:
每个分子能够和离子交换剂形成的 静电键的数目 电荷数目多寡 与分子中电荷的排布有关。
洗脱方法
增加缓冲液的离子强度 改变pH ，
洗脱方式
梯度洗脱： 阶段洗脱：
（2）离子交换剂的分类和性质
离子交换剂应满足下列要求：
① 有高度的不溶性 ② 有疏松的多孔结构或巨大的表面积 ③ 有较多的交换基团 ④ 有稳定的物理化学性质
离子交换剂的分型
1）阳离子交换剂
磺酸基团（-OSO3H）
甲基磺酸基团（-O-CH2-SO3 H）
2）缓冲液的选择
选用的起始缓冲液
其pH值和离子强度等能使样品中有效成分与离子交换剂结 合，而不能使样品中杂质与离子交换剂结合.
如选用阴离子交换剂, pH值一般比有效成分的pI值高一个单位; 选用阳离子交换剂, pH值一般比有效成分的pI值低一个单位; 离子强度为0.1时，就能很快把有效成分与杂质分开。 选用的洗脱液 其离子强度和pH值应使有效成分从离子交换剂上解离下来， 一般离子强度要比起始缓冲液高，pH值是随着离子交换剂性 质变化而变化。
交换容量
指单位重量交换剂中可解离基团的数量，是离子交换剂的特性 常用单位重量或单位容积交换剂的能交换的毫克当量离子来表示；
影响交换容量的因子：
筛孔 离子强度 pH
（3）离子交换层析条件的选择
1）离子交换剂的选择
交换容量是提供交换离子的量度，是选用交换剂数量的 重要参考依据。
选用何种交换剂还要根据被分离的物质所带电荷、分子 大小，及是否耐酸碱等对离子交换剂进行选择。
例如聚苯乙烯磺化型离子交换树脂是由苯乙烯与二乙烯苯共聚和 再磺化引入磺酸基合成。磺酸根连在树脂上，氢离子与磺酸 根的负电荷互相平衡，可与外来离子相互交换。
特点： 交联孔径小，吸附力太牢，要求洗脱条件剧烈 不适用于大分子的蛋白质分离纯化 多用于小肽和氨基酸的分离纯化及无离子水的制备。
2纤维素离子交换剂： 是以微晶纤维素为基质，通过化学方法引入电荷基团构成的。 离子交换纤维素分子上的羟基被离子基团取代。 特点： 对蛋白质的交换容量大，结合力弱， 洗脱条件缓和， 因而是分离纯化生物活性大分子的理想的工具。
强阴离子交换剂 弱阴离子交换剂
强碱性：R−N+ ( CH3)3 OH– + Cl− 弱碱性：R− NH3 +(OH) – + Cl−
R−N+(CH3)2Cl– + OH− R−NH3 +Cl –+ OH−
离子交换剂根据化学性质分为三类：
1树脂离子交换剂：
由苯乙烯和二乙烯苯的共聚物作为骨架，再引入所需的酸性基团 或碱性基团。
故交换容量很高
能引入大量活性基团而不破坏骨架
阳离子交换剂有:SE-Sephadex(强) CM-Sephadex(弱)
阴离子交换剂有：QAE-Sephadex(强) DEAE- Sephadex（弱）
表7-6 一些常用的纤维素离子交换剂和Sephadex离子交换剂
离子交换剂 I、阳离子交换剂
CM-纤维素（弱酸型） P-纤维素（中强酸型） SE-纤维素（强酸型） SP-Sephadex(强酸型) II、阴离子交换剂
① 阴、阳离子交换剂的选择
对于已知等电点的物质
当pH< pI时, 应选择阳离子交换剂； 当pH> pI时, 应选择阴离子交换剂； 如果被分离物质为两性离子，则一般应根据其在稳定的pH范 围内所带电荷来选择交换剂。 例如，一蛋白质的pI为5． 若该物质在pH5～8稳定时，则应选择阴离子交换剂； 若该物质在pH5以下稳定时，则可选择阳离子交换剂。
弱性离子交换剂 选择性较高，适用的pH范围较窄，这种离子交 换剂在pH为中性的溶液中交换容量也高，用它分离生 命大分子物质时，其活性不易丧失。所以，分离生物 样品习惯采用弱性离子交换剂
③ 不同离子型交换剂的选择
离子交换剂处于电中性时往往带有一定的反离子。
如阳离子交换剂的反离子可以是
H+ (称H型） Na+ （称Na型） NH4+等
五、亲和层析 利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法
优点: 可对天然生物活性物质进行高特异性的分离和纯化。
（一）基本原理
抗原和抗体
激素和受体
酶和底物及辅酶 酶和抑制剂
酶和调节效应物 RNA和其互补的DNA等
生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力。
亲和层析的过程
配基固相化：将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在 水不溶 性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称 亲和柱）。
1）吸附阶段：
①紧密吸附：静电键的数目相当多，以致它们同时解离的概率为零。 处于此状态的物质，被吸附于柱顶而不下移。
②有限吸附平衡：静电键的数目较少，它们同时解离的概率达到一 个有限值（0∼1间）。只有在此范围内才能达到较高的 分辨率。
③解吸状态：静电键数目极少，同时解离的概率为1，完全不吸附。
2）洗脱（解吸附）阶段：
在pH7.0 0.1mol/L盐浓度时,最佳操作容量(总交换量的40%)的选择
在10支盛离子交换剂的试管中，先用相同缓冲液进行充分洗涤、平 衡，然后按总交换容量的百分数，分别加入不同量的样品液，吸附毕， 取上清液测定待分离物的含量，并绘制相应图谱（见图59C）。
从图看出，离子交换剂的总交换容量达40％时，其吸附力已呈饱和 状态。这表明该交换剂中加入样品液的最大量为总交换容量的40％。
（3）等电聚焦电泳的方式
垂直管式 毛细管式 水平板式 超薄水平板式
分析样品多 两性电解质用量少 结果重复性好
（4）优点
① 有很高的分辨率，可将等电点相差0.01～0.02 pH单位的蛋白质分开； ② 能抵消扩散作用，使区带越走越窄。一般电泳由于受扩散作用的影响，随着时
间和泳动距离加长，区带越走越宽 ③ 很稀的样品也可进行分离. 由于这种等电聚焦作用，不管样品加在什么部位，
缓冲液选择的关键在于:了解有效成分的等电点。 初步选择缓冲液（pH值）的简便方法 ：
A、取10支1.5ml试管，在各管中加入0.1g Sephadex或1.5ml Sepharose（或 Sephacel）离子交换剂
B、用不同pH值0.5mol／L缓冲液分别洗涤10次 （阴离子交换剂选pH5～9，阳 离子选pH4～8，配方见表5-8)
可电离基团
羧甲基 磷酸基 磺乙基 磺丙基
AE-纤维素（弱碱型） PAB-纤维素（弱碱型） DEAE-纤维素（中强碱型） DEAE-Sephadex（中强碱型） TEAE-纤维素（强碱型） QAE-Sephadex（强碱型）
氨基乙基 对氨基苯甲基 二乙基氨基乙基 二乙基氨基乙基 三乙基氨基乙基 二乙基（2-羟丙基）-氨基乙基
(2) pH梯度的建立。
人工pH梯度：用两种不同pH的缓冲液互相扩散，在混合区形成pH梯度。 天然pH梯度：利用载体两性电解质（carrier ampholytes）在电场作用下自
然形成pH梯度。该方法是常用的方法
低pH
+
H2SO4 两性电解质(带正电)
高pH
甲(酸性很强) 乙(等电点稍高于甲)
两性电解质(带负电) NaOH −