性别决定及其控制

性别控制是通过人为地干预并按人们的愿望使雌性动物繁殖出所需性别后代的一种繁殖技术。可以通过人工授精或体外授精将分离的优良精子注入受体，精子的分离可通过物理、免疫、流动细胞等分离方法进行分离。授精后，可通过胚胎性别鉴定，如染色质、染色体组型鉴定法、雄性特异抗原鉴定或分子生物学SRY-PCR鉴定。

性别控制对我们的生产、生活都有很重要的作用。1：可使受性别限制的生产性状（如泌乳性状）和受性别影响的生产性状（如肉用、毛用性状等）能获得更大的经济效益；2：可增强良种选种的强度和提高育种效率，以获得最大的遗传进展；3：对人类来说，通过精子性别的选择，可以避免怀孕一个与X相关隐性疾病的婴儿；对于平衡一个家庭后代的性别比例也将起到积极的作用，从而可以控制人口增长。

两栖爬行动物性别决定的研究进展

摘要:两栖爬行动物性别决定的方式有基因型性别决定和环境型性别决定两种类型.本文综述了两种类型的最新研究进展，推测两种性别决定机制在分子水平上可能是一致的，对进一步研究存在的问题作了一定的分析.

性别决定和分化机理的研究一直是生命科学的一个热点领域.科学家们经过异常艰苦的研究才逐步揭开了性别决定的神秘面纱.众所周知，哺乳动物的性别是由性染色体决定的，在受精时，带有Y染色体的精子与卵子结合发育为雄性，带有X染色体的精子与卵子结合发育为雌性，X染色体与Y染色体在动物性别决定中似乎具有同等的作用，但随着细胞生物学、分子遗传学、发育生物学等学科的迅速发展，专家们发现，位于Y染色体上的SRY(Sex determing of Y chromosome)基因才是辜丸决定因子TDF(Testis determing factor,Tl)F)的最佳候选基因[ 1]. SRY基因的缺失可以使动物个体发育过程出现性反转(2)，这更进一步证明了SRY基因在性别决定中的重要作用‘可是，两栖爬行动物的许多物种没有性染色体的分化，这说明两栖爬行动物性别决定机制可能具有多样性.目前认为两栖爬行动物性别决定的方式有二:一是基因型性别决定，二是环境型(主要是温度依赖型)性别决定.

1、两栖爬行动物基因型性别决定(Gene type sex determination, GSD)

两栖爬行动物基因型性别决定遗传学上的证据:

基因型性别决定是指子代的性别是通过性染色体来决定的，它不受外界环境的影响，胚胎发育成雌性或雄性的趋向取决于其性染色体的组成，XY型(或zz型)将发育成雄性，而XX型(或zw型)将发育成雌性.哺乳动物是基因型性别决定的代表.二十世纪五十年代以前，两栖爬行动物染色体是否有性染色体的分化，尚未完全清楚，直到1962年sew[31第一次报道了爬行类有异型染色体的存在，继此之后，性染色体在两栖爬行动物中才相继被发现.在蛇类中，性染色体的分化最为明显，其性染色体为zw(或ZZ)型，其分化程度从低等到高等逐渐增高[41.经典的分类和解剖学认为，蟒蛇科是较原始的类群，而游蛇科是由其演化而来的，蝗科又是在游蛇科的基础上进一步发展来的，性染色体的分化也表现这一规律.蛇类的性染色体一般是由核型中的第四对大染色体分化形成.在这种分化中，z染色体一直保持不变，仅w 发生了变化，这种变化主要通过缺失卜倒位及重复等形式而进行[s1蜘蝎类目前已有7科约70多种发现具有性染色体〔6-71.龟鳖目大多缺乏性染色体的分化!8-91鳄目至今未发现有异型染色体〔10-111.两栖类即使有异型染色体分化的种类，也仅在性相关区有分化〔121.在两栖爬行动物中，具有性染色体的物种，其性别是由异型性染色体决定的，或者说是由基因型决定受精卵发育为雄性或雌性;其性别决定机制与哺乳动物和鸟类相似.例如，动胸龟科中沙氏赓香龟与大1!d香龟是具异型性染色体的，雄性为XY型，雌性为XX型;中华大婚蛛也具异型性染色体，雌性为zw型，雄性为zz型.而在虎绞蛙、乌龟、平胸龟、中华鳌等物种中，雌雄个体均未见有异型性染色体的分化，这些物种*基因保守区的克隆及序列分析也显示[13一‘6)，雌雄个体间未有差异，这些物种性别决定为EST)机制.这就从反面证实了性染色体的分化是GSI〕机制的遗传基础.

1.2 两栖爬行动物基因型性别决定分子方面的证据

有性染色体的分化，为基因型的性别决定提供了物质基础.问题在于，性染色体上存在有众多的基因，其中究竟那一些是性别决定基因，科学家们经过了长期锲而不舍的探索，终于弄清了哺乳动物的雄性性别由Y染色体决定，并证明了Y染色体上有一个控制性别的决定因子又称为肇丸决定因子(TDF)，为解释该因子的作用机理，科学家们又进行了卓有成效的研究，提出了H-Y抗原基因、BMK卫星DNA片段、ZFY基因、SRY基因等为性别决定因子的假说1,17-201，目前，SRY基因作为TDE的最佳候选基因，在学术界已是一个不争的事实.在人类,SRY基因位于Y染色体短臂紧邻拟长染色质区，为单一外显子的DNA片段，这种片段在多种哺乳动物中普遍存在，但不同物种所处位置不尽相同，经研究确认SRY在人类是距边界35Kb(千碱基对)的范围内，小鼠是14Kb.它是一个长约250饰，编码HMGI, HMG2蛋白A,B结构域高度同源的单拷贝基因，编码的蛋白质约80个氨基酸，即HMG(High Mobility Group)盒[1.211，具高度的保守性和特异性.HMG盒是SRY基因编码的蛋白质与DNA发生作用的部位，很多其它基因所编码的蛋白质也被证实有HMG盒.研究发现，在一些XY女性中，由于SRY蛋白的HMG区发生突变，丧失了与靶位点的结合能力，从而导致性别逆转[21.这说明SRY蛋白的DNA结合活性对辜丸发育和雄性性别的决定是必须的，SRY基因是性别决定和分化的开关“基因”.很多基因所编码的蛋白质已被证实有HMG盒，现已把编码蛋白质与HMG盒有60%同源性的基因，称为Sox基因(SRY-related HMG-box gene) [22〕目前已在两栖爬行动物中通过PCR方法克隆出多条，x基因[13-16,233，称Sox 家族.通过对人sox基因序列及其在染色体上位置的比较，发现SRY基因与位于X染色体上的SOX3基因可能原本是一对等位基因，SRY基因由SOX3进化而来，关于SOX3的作用，现在较为广泛接受的观点是SRY与SOX3相互作用调节SOX9[2a1. SOX9基因被定位于人类染色体的17824.1一825.1区域内，是继SRY基因之后发现的关于性别决定的SOX家族的又一成员，它是紧靠着SRY基因的一下游基因，是与性别决定直接相关的基因，它的表达与否直接决定辜丸发育与否:在雄性中，SRY抑制SOX3,SOX9没有SOX3的抑制得以发挥作用，诱导皋丸发育，在雌性中，无SRY, SOX3产物抑制SOX9，因而无肇丸发育.另外，位于X染色体短臂上的DAM 基因可能负责卵巢的分化，并对SRY基因起着剂量上的拮抗作用[25-x61.正常雄性个体DAM 基因只有一个拷贝，不足以抑制SRY基因的表达，正常雌性个体虽然也只有一个活性拷贝，但因为无SRY基因的拮抗作用，所以卵巢得以正常分化.总之，性别决定及性腺分化取决于以上各基因间的相互作用和相互影响，任何一个基因的确失、突变或过量表达都有可能引起性反转或性别分化异常.

2 两栖爬行动物环境型性别决定(Environmental Sex Determination, ESD)

环境型的性别决定指子代的性别由环境中的影响因子决定(如温度、湿度等)，过去三十多年的研究证明，多数两栖爬行类的性别决定由卵的孵化温度所决定，到目前为止，两栖爬行动物已证实存在ESI〕机制的种类有94种，具ESD机制的物种均无异型染色体的分化.1966年，Charmier第一次报道了温度对爬行类性别分化的影响，他把蝴蝎的卵置于26一27℃下孵化，其子代97.8%为雌性，在29℃下子代100%为雄性，他的发现引起了生物学者的重视，以后在龟类中报道了相似的结果.到1979年，Bull和Vogt在研究了温度对5种龟性别的影响之后〔27-281，才明确提出了温度依赖型性别决定(Temperature Dependent sex Determination, TSD)这一专业名词，使这一问题系统化，并促进了对其研究.目前通常认为TSD机制有三种模式:A型为低的孵化温度产生雌性，高的孵化温度产生雄性，也称FM型.I型正好相反，低的孵化温度产生雄性，高的孵化温度产生雌性，也称1F 型.C型为低温产生雌性，中间温度产生雄性，高温也产生雌性，称FMF型.FM型多存在于鳄类和晰蝎类中;NE型则在许多龟类中存在JMF型在已知的具TSD机制的所有类群中均有发生〔29-301.结合哺乳动物性别决定机制的研究成果，已在两栖爬行动物中分离和鉴定出控制动物性腺发育的有关基因的同源

基因有:BMK, H - Y, ZFY同源基因Zfc,SRY同源基因Sox.结合两栖爬行动物性别决定研究的最新成果〔13,16-231，从分子水平上我们可以看出，龟鳖目中，由于没有性染色体的分化.Sox 基因在雌雄个体中共同表达，无性别特异，〕\'S。制;在蛇亚目，性染色体分化较明显，Sox 基因的表达也有性别特异性，为GSD机制.现已证实，在两栖爬行动物中，Sox与SRY基因在DNA序列和编码的氨基酸水平上都有较高的同源性[13-16,23,30-331，推测Sox基因与SRY基因一样，对雄性性别分化起开关作用.可能是由温度引起Sox基因的表达，而表达的多少、快慢及Sox蛋白的构象都会影响性腺的分化，继而启动性腺发育的一系列级联作用.3 CTSI)机制与ES]〕机制的进化关系从以上所述可以看出有些两栖爬行动物由孵化温度等环境因子决定性别，而另一些种类的性别由异型性染色体决定，在系统进化上，GSD机制与FSD机制关系如何呢?鱼类是低等的脊椎动物，大多数种类未发现有异型性染色体，即使有异型性染色体分化的种类，也仍处在萌芽状态，而多数种类由环境决定性别，如银边鱼〔341两栖类发现异型性染色体的种类也屈指可数，虽然有些种类的性别可能由基因决定，也仅在性相关区域(Sex related region)有分化121，同时两栖类性别分化也受温度及其它因素的影响，故尔两栖类的性别决定受两种因素的影响[351在爬行类中，只有少数种类发现了异型性染色体，且鳄目和嚎头目至今尚未发现异型性染色体.就是在有鳞目和龟鳖目中，所观察到的性染色体仍处在分化的初级阶段;只是在蛇亚目中，性染色体由低等到高等从同型染色体分化为异型染色体显得较为突出.从以上可以看出，无论是鱼类、还是两栖类、爬行类，只有那些较特化的种类才分化出现了异型性染色体.作为高等脊椎动物的鸟类和哺乳类，其外部特征高度进化，而且性别决定机制也随之进化，性染色体高度分化，性别完全由异型性染色体所决定.异型性染色体之间，即Z与W之间、X与Y染色体之间的差别也很明显，无温度作用的例证.由此我们可以看出，性染色体应是进化的产物，尽管目前对ESD机制的细节尚未完全清楚，然而越来越多的证据表明，其性别决定的策略与GSD可能十分相似，在分子水平上二者可能是一致的，有如下的证据:第一，龟类和晰蝎中亲缘关系较近的种间既有GSI〕机制又有TSD机制.

第二，遗传的同源性比较可知，GSD机制中性别特异的DNA序列在TSI〕机制的物种中同样存在，如上述的BMK, ZFY/ZFX, SOX基因;第三，现在一般认为，性别决定基因是逐渐积累的，含有性别决定基因的染色体发生倒位及异染色质积聚等过程、避免交换，从而导致性染色体的分化，即由同型向异型分化.从分类地位上看，在高等脊椎动物中，趋向稳定的异染色体决定性别;而其它较低等的物种中由于尚未有性染色体的分化，故尔其雌雄个体基因组中Sox基因基本一致，无性别特异性

4。问题与展望

纵观近年来两栖爬行动物GSD和ESL〕机制的最新研究，虽取得了不少成果，但也存在一些问题.IL如尽管在一些物种中克隆和筛选了为数众多的Sox基因，但其上游调节因子目前尚未发现，下游基因也有待确认.我们认识到今后只有积累更多的动物性别决定和分化方面的分子资料，才能找到GSD和ESD机制之间的共同拥有的级联通路的基因，从而建立起动物性别决定机制的模型，继而彻底揭示千百年来困扰人们的性别决定和分化的机理，使人类能按自己的意志控制动物的性别，为社会创造更好的经济效益.

动物性别决定与控制技术的研究进展

王学峰、经荣斌、宋成义、陶勇、袁书林、王宵燕、朱荣生

一、性别决定：

1.性别决定的过程。

动物性别决定包括初级和次级性别决定。初级性别决定关系到性腺发育的方向，而哺乳动物性别决定的取向决定着未业性腺发育的导向。

次级性别决定关系到性腺外的身体表型，即第二性征，第二性征通常由性腺分泌的激素

决定。

2.性别决定的本质。

（1）SRY基因的发现和分离。对这一14kb的片段进行序列分析，发现除mSRY以外，并不含有其他基因，从而证实SRY确为性别决定基因。

（2）SRY基因的作用与功能。SRY基因是Y染色体的性别决定序列，是主宰性别的睾丸决定因子（TDF）的遗传基础，它的作用贯穿于性腺发育的全过程。研究表明，SRY基因有自启动转录功能，在胚胎睾丸组织细胞系表达产生SRY1因子，激活下游的114bp启动子，进而使下游的缪氏体抑制物基因MIS（miilerian inhibiting substance）表达，导致AMH （artimiilerian Hormone）分泌，抑制缪氏管发育，同时SRY1因子作用于间质细胞，促使其发育分泌睾胴产生雄性结构。

（3）SRY基因的表达。SRY基因结构的研究表明，SRY基因为开放的读码框架结构，有一个外显子，可编码204个aa肽键，其中有一段可编码79aa的保守区-HMG盒，它具有高度的保守性，现已在包括有袋类和真兽亚纲动物在内的哺乳动物的Y染色体上发现有SRY 同源序列的存在。SRY表达具有精确的时间性和组织特异性，这意味着有控制SRY的基因的存在，这些基因在性别决定通路上是SRY的上游基因，而且在生殖嵴中，这些基因一定是常染色体基因或者是X-连锁基因，而且在XX和XY胚胎中都有存在。

二、性别控制技术：

1.X、Y精子的分离。

（1）物理分离法。沉积分离法。此法是X精子沉积速率比Y精子快的原理，将人的精液放在不同密度的Percoll梯度中，经过24步骤，可以收集到90%以上的X精子。

电泳分离法。电泳法是根据精子表面具有不同的电荷而设计的一种分离方法，以中性缓冲液电泳时，向阳极运动的X精子比Y精子多。

密度梯度离心法。是以精子比重差异为前提，以平衡沉淀为基础，利用密度梯度进行分离的方法，采用蔗糖、乳糖等及其它一些高分子物质和Pacoli做成密度梯度，用30%-80%的11个密度梯度可使X精子层纯度高达87%-94%，最上层Y精子下降至原来的60%。

（2）H-Y抗原法。对H-Y抗原进行血清学分析，表明小鼠精子上存在H-Y抗原，并试图用免疫法来抑制Y精子。

免疫亲和柱层析法：用免抗鼠IgG（第二抗体）与琼脂糖-6MB（Sepharose-6MB）小球偶联构筑分离柱，分离H-Y+与H-Y-精子。

免疫磁力法。利用磁体将与磁珠相连的精子（Y精子）从样品中除去，上清液中的精子就是X精子。

（3）流式细胞分类仪法。用无毒荧光材料“Hoechst33342”对精子染色，在通过分类仪中时，用激光照射，X精子发出的荧光强，再用计算机控制使荧光强的X精子带上正电荷，Y精子带上负电荷，带电精子通过高压电场进即向不同方向偏转，从而达到分离目的。

2.胚胎性别的早期鉴定。

（1）核型分析法（细胞遗传鉴定）。该方法是通过核型分析来进行胚胎性别鉴定的，最早用于兔、羊、牛胚胎性别鉴定，操作过程为：取少量胚胎细胞，经秋水仙素处理后固定和染色，检查性染色体，根据染色体在细胞分裂中期的不同谱带和Y染色体的大小、形态来判断性别另，这种方法鉴别胚胎性别准确率几乎是100%，但操作繁琐。

（2）X-相关酶法。哺乳动物为了维持性别之间的基因平衡，在胚胎发育早期，雌性个体每个细胞中的一条X染色体是失活的，在失活前雌性胚胎X染色体连锁酶的活性是雄性的2倍。据此，Willams等（1986）用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（GYPD）检查，发现雌、雄性胚胎鉴别率为72%和46%。Monk和Handyside用次黄嘌噙核糖基转移酶（HPRT）及腺嘌呤核糖基转移酶（APRT）检测，雌雄胚胎的鉴别准确率为91%和100%，但由于X-染色体

失活的确切时间尚不清楚，可能把失活的雌胚胎误判为雄胚，从而影响准确率。Monk(1977)、Kralzer(1978)研究发现在牛桑棋胚后期至囊胚的早、中期可看到有双峰分布曲线，而到囊胚的后期则双峰消失，这是失活的标志，但不同的畜种失活时间有差异。

（3）H-Y抗原法。包括间接免疫荧光法和细胞毒性分析法。

间接免疫荧光法：先将8细胞屋塥胚期胚胎与H-Y抗体反应30min，再与异硫氰酸盐荧光素（FITC）标记的免疫球蛋白M（IgM）抗体反应，然后在荧光显微镜下检查胚胎是否带有荧光素，若有则判定为H-Y+胚胎，不显荧光者则为H-Y-胚胎。

细胞毒性分析法：在补体存在的情况下，H-Y抗体可以与H-Y+胚胎结合并使其呈个或更多的卵裂球溶解，或使卵裂球呈现不规则的体积和开头阻滞了胚胎的发育，受影响的胚胎为雄性胚胎，而仍然正常发育的为雌性胚胎。这一方法是以破坏雄性胚胎为代价的，故现已很少采用。

（4）Y特异性片段鉴别法：包括核酸探针法和PCR法。

核酸控针法（特异性DNA探针法）。主要是基于Y染色体上有几种不同的基因，如睾丸决定因子、H-Y抗原、12EF抗原基因及两个功能未知的多态基因，这些基因中有些片段是雄性特性的，将Y染色体上的一侧面特异性DNA片段标记为DNA探针，与胚胎的DNA 同源序列杂交，显阳性者为有Y染色体存在的雄胚。

PCR法。Reed.K（1990）首先成功地运用PCR技术在体外扩增Y染色体特性片段（非SRY序列）鉴别胚胎性别，此后有学者依据SRY基因的核心序列设计了特异性引物，对胚胎提取的DNA进行扩增，如出现特异性条带则为雄性。Pomt(1995)建立的SRYA或SRYB 引物的SRY/ZFY-ZFX双扩增体系成功的鉴别了牛、绵羊、山羊、驼羊、马、人、大鼠、小鼠等的胚胎性别。

哺乳动物性别绝大部分的取向决定着未来性腺发育的导向,而性别决定的结果又是通过性腺分化及性表型来体现的。雄性与雌性决定通路只不过是一个类似于“双向开关”的“开启”与“关闭”过程，取决与SRY基因的存在与否，受到来自中肾的某种物质的协调。动物性别控制是一项能显著提高畜牧业经济效益的生物工程技术。