WesternBlot原理和操作方法(全)讲解
Western Blot 原理和操作方法（全）
Western Blot
工作原理
蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ?
SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.
PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.
另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.
重要参数
①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:
T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100%
其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)
②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:
蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)
<104 20-30
1×104-4×104 15-20
4×104-1×105 10-15
1×105-5×105 5-10
>5×105 2-5
③分离胶:
电泳凝胶浓度
试剂10% 12% 15% 10% 12% 15%
H2O(ml) 4.0 3.3 2.3 5.9 4.9 3.4
30%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 3.3 4.0 5.0 5.0 6.0 7.5
1.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)
2.5 2.5 2.5
3.8 3.8 3.8
10%SDS(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15
10%AP(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15
TEMED(μl) 4 4 4 6 6 6
总体积(ml) 10 15
④浓缩胶
试剂浓度(5%)
H2O(ml) 4 2
30%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 1 0.5
1.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 1 0.5
10%SDS(μl) 80 40
10%AP(μl) 60 30
TEMED(μl) 8 4
总体积(ml) 6 3
蛋白质的样品制备：
蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：
1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。
3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。
4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂）
5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80℃中保存，但要注意不要反复冻融。
一：准备工作：
一个水浴箱，一台超声装置，组织匀浆器
二：需要的溶液：
裂解液Laemmli样品缓冲液
三：操作步骤：
1)培养细胞蛋白质样品的制备：
1：胰酶酶解后裂解：
细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS 漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450μl裂解液反复吹打。
2：皿上直接裂解：
细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。
以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理，超声时为5S，间歇时间为10S，功率为100-120W至溶液清澈无粘稠为止，处理过程在水浴中进行，后4℃25000g离心1小时取上清或以最大强度超声4次，每次15-30S，在每次超声步骤之间将样品转置水浴中15S，加入Laemmli 样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合），强力混匀，样品置100℃水浴箱里水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中，至此，电泳样品已准备就绪。（样品可立即使用也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月）
2)组织样品的制备：
手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理，具体方法见细胞培养的样品制备，也可以冷冻干燥降解核酸后，将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样buffer中，混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有5分钟即可，4度离心收集。）加入Laemmli样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合）强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪（样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月。）
蛋白质的样品制备：
蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：
1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。
3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。
4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂）
5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置-80℃中保存，但要注意不要反复冻融。
一：准备工作：
一个水浴箱，一台超声装置，组织匀浆器
二：需要的溶液：
裂解液Laemmli样品缓冲液
三：操作步骤：
1)培养细胞蛋白质样品的制备：
1：胰酶酶解后裂解：
细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS 漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450μl裂解液反复吹打。
2：皿上直接裂解：
细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。
以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理，超声时为5S，间歇时间为10S，功率为100-120W至溶液清澈无粘稠为止，处理过程在水浴中进行，后4℃25000g离心1小时取上清或以最大强度超声4次，每次15-30S，在每次超声步骤之间将样品转置水浴中15S，加入Laemmli 样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合），强力混匀，样品置100℃水浴箱里水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中，至此，电泳样品已准备就绪。（样品可立即使用也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月）
2)组织样品的制备：
手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理，具体方法见细胞培养的样品制备，也可以冷冻干燥降解核酸后，将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样buffer中，混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有5分钟即可，4度离心收集。）加入Laemmli样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合）强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪（样品即可立即使用也可也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月。）
附：
一：裂解液的制备：
组织裂解液（全细胞蛋提取）：1：Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.4
2: Nacl 150 mmoL/L
3: 去氧胆酸钠0.25%
4：NP-40或Triton-x-100 1%
5: EDTA 1 mmoL/L
6：PMSF 1 mmoL/L
7：Aprotinin 1μg/ml
8: leupeptin 1μg/ml
9: pepstain 1μg/ml
其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。
细胞裂解液：1：NP-40裂解体系：150 mmoL/L Nacl
1.0%NP-40或Triton-x-100
50 mmoL/L Tris(PH8.0)
2：RIPA裂解体系：150 mmoL/L Nacl
1.0%NP-40或Triton-x-100
0.5%脱氧胆酸钠
0.1%SDS
50 mmoL/L Tris( ph8.0)
二：Laemmli 样品缓冲液配置（1*SDS样品缓冲液）
50 mmoL/L Tris-HCL （PH8.0）
100 mmoL/L DTT
2% SDS
0.1% 溴酚蓝
10% 甘油
此液可以配置成不同的储存液，根据蛋白浓度而定，40C长期保存，用时临时与蛋白液按比例混合，其中DTT应临时加入，以防降解。
蛋白质定量
1)Bradford法:
检测原理: Bradford与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm 检测.该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX-100,SDS,NP-40等.
①Bradford法浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml浓磷酸;然后,用蒸馏水补充至200ml;此染液放4℃至少6个月保持稳定.
②标准曲线蛋白质样本的制备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准,如果待测样品是未知的,也可用抗体作为标准蛋白,通常在20μg -150μg/100μl之间绘制标准曲线.
③将待测样本溶于100μl缓冲溶液中,该缓冲溶液相同(最好用PBS)
④按照1:5用水稀释浓燃料结合溶液,如果出现沉淀,过滤除去.
⑤每个样品家5ml稀释的燃料结合溶液,作用5-30分钟,燃料与蛋白结合,将由红色变为兰色,在595nm波长下测定其吸光度,注意显色反应不超过30分钟.
⑥根据标准曲线计算待测样品的浓度.
2)Lowry法:
检测原理: 是Cu2+与蛋白作用生成的Cu+与双缩脲试剂形成兰色络合物,菲林试剂增强兰色形成,750nm检测.
①首先,将20g碳酸钠溶于500ml水中;再将1g CuSO4.5H2O和2g酒石酸钠溶于500ml蒸馏水中;将铜/酒石酸钠溶液放在磁力搅拌器上搅拌缓缓加碳酸钠溶液,储存于冰箱中,可稳定保存1年以上.
②Folin-ciocalteu酚试剂
③按体积比1:2:1将铜/酒石酸/碳酸钠,5%SDS和0.8mmol/l NaOH溶液混合,室温下储藏,可稳定保存2周,标明为试剂A
④按体积比1:5将Folin-ciocalteu酚试剂和H2O混合,室温下储存于琥珀色试剂瓶中,可稳定保存1个月,表明为时机B
⑤用蒸馏水将样本(5-100μg)稀释为1ml,并准备100,50,25,12.5μg /ml,4个浓度的BSA作为标准蛋白.
⑥每个蛋白样品家1.0ml试剂A,混合均匀,在室温下孵育10分钟.
⑦加入0.5 ml试剂B并立即混合, 在室温下孵育30分钟.
⑧在750nm光波长下测定吸光度;根据标准曲线计算样本蛋白质的浓度.
3)紫外分光光度法:
检测原理:是因蛋白质样品在280nm波长下有最大吸光率,最大吸光率主要取决于酪氨酸和色氨酸的存在.
①纯化蛋白质浓度的测定:在280nm波长下读取与适当对照相比较的吸光值.
②对于抗体和BSA,可按照下述标准计算其浓度,对其他蛋白质粗略地估计:1单位吸光值相当于1mg/ml
蛋白质A280(1mg/ml)
IgG 1.35
IgM 1.2
BSA 0.7
③含有核苷酸的蛋白质溶液浓度的测定:
蛋白质浓度(mg/ml)=(1.55*A280)-(0.76*A260)
蛋白质浓度(mg/ml)=A205(27+120A280/A205)
1)SDS-PAGE设备和材料
①电泳装置（垂直板电泳槽）为北京六一仪器厂生产的DYCZ-24D型电泳装置。
②电泳仪（电源）为北京六一仪器厂生产的DYY-8B型。
③振荡器
2）试剂
①丙烯酰胺（电泳级）
②N,N′-甲叉双丙烯酰胺（bis）
③SDS
④TEMED
⑤Tris
⑥过硫酸铵
⑦α-巯基乙醇或DTT
⑧甘油
⑨甘氨酸
⑩溴酚蓝
(11)盐酸
3）聚胶前准备：
①配制凝胶储液：T%=30% C%=1% arc:bis=29:1过滤后4℃避光保存。
②配制浓缩胶缓冲液： 1.0mol/L TrisHCl Ph6.8, 过滤后4℃避光保存。
③配制分离胶缓冲液： 1.5mol/L TrisHCl Ph8.8, 过滤后4℃避光保存。
④配制10%SDS
⑤配制10%过硫酸铵（AP）
⑥TEMED原溶液
⑦电泳缓冲液（5×）：Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L,临用时稀释5倍至1×SDS电泳缓冲液加入电泳槽中。
4)制胶: 制胶关键是聚合时间,最好是分离胶聚合控制在分离胶从加入10%AP
和TEMED起至开始出现凝胶的时间为15-20分钟（并不是此时已凝聚完全）。对浓缩胶最佳聚合速度为8-10min开始可见聚合，可以通过调节AP和TEMED 的加入量来控制，因液体中含有分子氧可抑制凝胶的聚合，故用时可在真空中抽气以排除液体中的分子氧，灌完分离胶后加水以封闭分离胶与外界氧气的结合，总之，要掌握一个原则：即用尽量少的催化剂在最佳时间聚合。
①按比例配制分离胶，轻缓地摇动溶液（8-10下），使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水或正丁醇，以阻止氧气进入凝胶溶液中，然后静置90min。
②同前按比例配制浓缩胶，但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制90min以上以保证完全聚合。
5)预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽电泳缓冲液后低电压短时间的预电泳（恒压10-20V,20-30min），清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通。
6)加样：预电泳后依次加入标准品和待分析样品，注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。
7)电泳：加样完毕，盖好电泳槽的盖子并选择适当的电压进行电泳，通常在连续系统中，上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶的电泳电压，使样品更好的进入凝胶，电泳时，应采用恒压的模式，这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迁移率。一般采用恒压浓缩胶80V，分离胶120V，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。
8)染色和脱色
电泳完毕需通过染色和脱色评定其结果的优劣.对凝胶中分离成不同条带的蛋白进行检测.此外,根据不同的研究目的,也可将凝胶电印迹
①考马斯亮蓝染色:
将凝胶取出放入培养皿中到如少量的染色液,以浸没凝胶为宜,在摇床上震荡,直到凝胶上出现明显的条带为止,一般5-6小时或者4℃过夜;然后倾去染色液，用脱色液洗涤震荡,其间要不断换脱色液,直至脱色液颜色稍清亮.,凝胶背景清楚为止.
②染色液配制:
90ml甲醇和H20混合溶液(甲醇:水=1:1,V/V)和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解
0.25g考马斯亮蓝R250用滤纸过滤染液以除去颗粒不溶性物质.
③脱色液的配制:
90mL(甲醇):H20(1:1 V/V)和10ml冰乙酸溶液.
附：
一、蛋白标准品的选择
凝胶电泳中一个关键的指示系统，即蛋白标准品（Molecular Weight Marker），电泳的分离效率，转膜效率以及电泳泳动情况等，皆需通过蛋白标准品来显示，目前普遍采用的几种蛋白标准品有：
①Blue RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix
②Trichrom RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker
Mix
以上两种Marker均为PIERCE公司的产品，货号为：①prod# 26681; ②prod# 26691;该标准蛋白不需染色，在电泳凝胶中随着蛋白质的迁移，各种分子质量的标准蛋白逐渐分开，而显示出非常漂亮的多色条带，可通过电泳槽直接肉眼观察各电泳带的凝胶中的泳动情况，当相对于目的蛋白大小的标准蛋白与相邻两条标准蛋白达到所需分辨距离时，即可停止电泳，取出凝胶做进一步的转膜工作。
③Chemiluminescent BlueRangerR peroxidase-Labled protein
Molecular Weight Marker Mix
以上也为PIERCE产品，货号为：prod# 26651，该标准蛋白同上也具有以上作用外，同时在使用化学发光时，和样品一起显色经胶片曝光后，在胶片上可出现漂亮的条带。
④Blotinylated SDS Molecular Weight Marker Mix
以上为Sigma公司产品，货号为B2787,作用效果同③
二、对照的设置
一般需要设立:
内参照, 提示系统的稳定性,一般是一些管家蛋白
阳性对照, 即肯定可以表达你的目的蛋白的组织或者细胞,同时可以提示你一抗的质量
阴性对照: 即肯定不会表达你的目的蛋白的组织或者细胞.在实验中
根据你的需要选择
免疫印迹
蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后,分离为不同条带,其中含有能与特异性抗体(或McAb)相应的待检测的蛋白质(抗原蛋白),将PAGE胶上的蛋白条带转移到NC膜上此过程称为blotting,以利于随后的检测能够的进行,随后,将NC膜与抗血清一起孵育,使第一抗体与待检的抗原决定簇结合(特异大蛋白条带),再与酶标的第二抗体反应,即检测样品的待测抗原并可对其定量.
一、设备和材料
转移电泳槽和转移电泳仪(电源)
震荡器
冰箱
滤纸
NC膜
胶片
暗室
二、试剂
封闭液:5%的脱脂牛奶粉TBS-T
第一抗体(Ab1)
第二抗体(标记的Ab2)
底物以及显色指示剂
漂洗液(TBS-T)
转印缓冲液
抗体稀释液
丽春红S
显影液
定影液
三、试剂的配制
封闭液: 5g的脱脂牛奶+100ml的TBS-T
漂洗液(TBS-T): 0.01M TBS-T为Tris 1.21g+ NaCl5.84g+800ml H2O用HCl调节PH到7.5,假如0.05%或者0.1%Tween-20用H2O定溶至1000ml
转印缓冲液: 同5×SDS电泳缓冲液,不含SDS,如果采用PVD干膜或NC膜加20%甲醇,不加甲醇也可以
Tris 15g+甘氨酸72g加水定容到1000ml,一般不需调节PH值,用时稀释5倍到1×转印缓冲液.
显影液：H2O--750ml
米土尔--3g
无水亚硫酸钠---100g
对苯二酚---3g
溴化钾---3g
无水碳酸钠：先加5gPH10.0不够时再加5g
注：以上配定加H2o定容至1000ml
定影液：起始水温：60℃H2o 700ml
硫代硫酸钠：240g
无水亚硫酸钠：25g
冰醋酸：48ml
注：加H2o至1000ml
四、电印迹
蛋白质经SDS-PAGE分离后，必须从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物具有牢固结合蛋白又不影响蛋白质Ag活性，而且支持物本身还有免疫反应惰性等特点，常用的支持物有：硝酸纤维膜（NC膜）或PVDF膜。
蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，分为半干式和湿式转印两种模式。
一．半干式电转印
1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。取凝胶方法：用刀片将两玻璃板分开，将多余的凝胶划去，上部以浓缩胶为准全部弃去，下部以分子量标准最小分子带下一点全部划去，取一10ml注射器注满转印缓冲液，插入玻璃板与凝胶之间注水，使水的压力将两者自然分开,边推边进,反复多次注水,直至凝胶从玻璃板上滑落下来。
2. 将NC膜和滤纸切出与凝胶一样大小，置转移缓冲液中湿润5-10min.
3. 按照以下顺序放置滤纸，凝胶和NC膜到半干槽中。
4. 每层之间的气泡要全部去除。可以用10ml吸管轻轻在上一层滚动去除气泡，然后用一绝缘的塑料片中间挖空与凝胶一样大小或略小一点，以防电流直接从没
有凝胶处通过造成短路，盖好加上阳极电极板。
二．湿式电转印
1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。取出凝胶方法同半干式电转印。
2. 打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海面垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与NC膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。
3. 电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内（电转印液之前要放入冰箱内预冷），连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极。
五、印迹膜上总蛋白的染色
在确定印迹中是否存在总蛋白之前,通过对硝酸纤维素膜染色可以了解转印至膜上的总蛋白质的组成情况,并可确定蛋白质分子质量标记物的位置和确定转印成功,同时,该方法也清楚地显示出转印蛋白质的复杂性.
丽春红S印迹膜染色法：
丽春红S适用于酸性水溶液,染色但是不持久,在后续的处理中红色染料易被洗去,由于与蛋白质的结合是可逆性的,该染色方法适用于所有显示抗原的饿技术, 丽春红S带负电荷,可以与带正电贺的氨基酸残基结合,同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合,从而形成红色条带.
1)丽春红溶液的配制:
储存液(10×)：0.1g丽春红溶于5ml冰乙酸,加入H2O定容至100ml,临用前稀释10倍为应用液.
2)操作步骤
①转印结束后取出印迹膜至于丽春红S应用液中,并在室温下搅动5-10分钟
②将膜放入PBS洗数次,每次1-2分钟,并且更换PBS
③根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记
至此膜可以用于封闭和加入抗体
六、膜的封闭
在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，10%马血清以及5% No-fat milk等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测试剂相适应，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用检测试剂，就不能用全血清封闭，其次是尽可能使非特异着色背静浅，封闭液以20%BSA效果较好，其次是5%N-fat milk.
封闭过程：
1) 洗转印膜：室温漂洗3次x10min,以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。
2) 取漂洗的转印膜，放入5% No-fat milk的封闭液内，摇床震动，室温封闭2h，也可在4度过夜。
3) 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次x10min.
七、抗体杂交
抗体表面主要采用间接法。即先加入未标记特异性抗体（Ab1）与膜上抗原结合，再加入标记的抗抗体（Ab2）进行杂交检测，标记Ab2 物质有放射性核素，酶，以及生物素等。
杂交过程：
１）封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液稀释的Ab1浓度为1ug/ml，封口，4℃孵育过夜或室温（22-25℃）摇动孵育2h.
２）液洗膜3次x10min
３）标记的Ab2（羊抗兔-HRP）室温1h，洗膜3x10min
八、检测
根据标记Ab2的标记物不同,其杂交的结果检测方法也不同,较常用的检测系统有HRP标记Ab2的的增强化学发光(ECL)和DAB检测系统.
1) 辣根过氧化物酶-DAB法:
①DAB显色液的配制:按照1mlH2O加显色剂A,B,C各1滴,混匀.
②显色:将适量DAB显色液平铺在Ab2杂交后的印迹膜上,室温放置观察,可出现明显的棕褐色蛋白显色带
③终止:用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应.
2) 辣根过氧化物酶-ECL法:
增强化学发光(ECL)检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质,生成一种不稳定的中间物质,其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带,利用X线胶片感光原理,将结果记录下来:
ECM显色剂配制:按mlH2O加显色剂A、B各1滴,混匀.
在暗室将杂交后印迹膜放入显色盒中,加上混合好的显色液,月1-5分钟
用纸巾吸去印迹膜边缘或者边角部分多余的显色液,将一透明的玻璃纸盖住抚平,并确定干的表面与胶片接触.
将印迹膜在暗室中使胶片暴光1-5分钟,冲洗胶片以确定所测抗原的正确暴光时间,暴光时间可短至几秒也可以长到数小时.
冲洗胶片步骤:先在显影液中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止,在放入定影液中漂洗,十秒即可.
注意事项:
1. 免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关.因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低,如果过低应该重新纯化和浓缩使用,或者建议做一次梯度稀释,上样电泳后,直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量,纯化和浓缩的蛋白质样品必须注意盐的浓度过高,可平衡一下盐的浓度,如,透析.
2. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当,不仅可以决定凝胶聚合的速度,也将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度.因此,建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开
始可见聚合.灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合.
3. 未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内.
4. 电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V,20-30min)
5. 加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象
6. 为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液
7. 样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数,,但是反复冻融会使蛋白质降解
8. 为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印.
9. 上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔
10. 取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对NC膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系.
11. 转膜时应依次放好NC膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,NC膜对应正极.
铅酸蓄电池的原理与性能
铅酸蓄电池的原理与性能 一、铅酸蓄电池的工作原理 蓄电池是一种化学电源，它的构造可以是各式各样的，可是从原理上讲所有的电池都是由正极、负极、电解质、隔离物和容器组成的，其中 正负两极的活性物质和电解质起电化反应，对电池产生电流 起着主要作用，如图4-1所示。 在电池内部，正极和负极通过电解质构成电池的内电 路，在电池外部接通两极的导线和负荷构成电池的外电路。 在电极和电解液的接触面有电极电位产生，不同的两极 活性物质产生不同的电极电位，有着较高电位的电极叫做正 极，有着较低电位的电极叫做负极，这样在正负极之间产生了电位差，当外电路接通时，就有电流从正极经过外电路流向负极，再由负极经过内电路流向正极，电池向外电路输送电流的过程，叫做电池的放电。 在放电过程中，两极活性物质逐渐消耗，负极活性物质 1.电解质 2.负极 3.容量 4.正极 5.隔离物 6.导线 7.负荷 图4-1 电池构造示意图 放出电子而被氧化，正极活性物质吸收从外电路流回的电子而被还原，这样负极电位逐渐升高，正极电位逐渐降低，两极间的电位差也就逐渐降低，而且由于电化反应形成新的化合物增加了电池的内阻，使电池输出电流逐渐减少，直至不能满足使用要求时，或在外电路两电极之间端电压低于一定限度时，电池放电即告终。 电池放电以后，用外来直流电源以适当的反向电流通入，可以使已形成的新化合物还原成为原来的活性物质，而电池又能放电，这种用反向电流使活性物质还原的过程叫做充电。 蓄电池可以反复多次充电、放电，循环使用，使用寿 命长，成本较低，能输出较大的 能量，放电时电压下降很慢。 1.电动势的产生 铅蓄电池的正极是二氧化铅(PbO2)，负极是绒状铅 (Pb)，它们是两种不同的活性物质，故和稀硫酸(H2SO4)起 化学作用的结果也不同。在未接通负载时，由于化学作用 使正极板上缺少电子，负极板上却多余电子，如图4-2所图4-2 铅蓄电池电势产生过程示，两极间就产生了一定的电位差。 2.放电过程的化学反应 当外电路接上负载(比如灯泡)后，铅蓄电池在 正、负极板间电位差(电动势)的作用下，电流Ⅰ从 正极流出，经负载流向负极，也就是说，负极上的 电子经负载进入正极，如图4-3。同时在蓄电池内 部产生化学反应：
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤 1.western blot 即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 2.原理 简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息 3.步骤 （一）蛋白样品制备 培养的细胞（定性） 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 2.对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。 3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。 4.用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，可将EP管置于0℃后在 5.14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反 6.复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。 7.待样品恢复到室温后上样。 培养的细胞（定量） 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 3.刮下的细胞收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。 4.12000g离心，4℃，2min。 5.取少量上清进行定量。 6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。 （二）SDS－PAGE电泳 （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样 （3）电泳 （三）转膜 （四）免疫反应 （五）化学发光，显影，定影 （六）凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
铅酸蓄电池的结构和工作原理
铅酸蓄电池的结构和工作原理 （一）铅酸蓄电池的结构 铅酸蓄电池主要由正极板组?负极板组?隔板?容器和电解液等构成,其结构如下图所示： 1.极板 铅酸蓄电池的正?负极极板由纯铅制成,上面直接形成有效物质,有些极板用铅镍合金制成栅架,上面涂以有效物质?正极(阳极)的有效物质为褐色的二氧化铅,这层二氧化铅由结合氧化的铅细粒构成,在这些细粒之间能够自由地通过电解液,将正极材料磨成细粒的原因是可以增大其与电解液的接触面积,这样可以增加反应面积,从而减小蓄电池的内阻?负极(阴极)的有效物质为深灰色的海绵状铅?在同一个电池内,同极性的极板片数超过两片者,用金属条连接起来,称为极板组
或极板群?至于极板组内的极板数的多少,随其容量(蓄电能力)的大小而异?为了获得较大的蓄电池容量,常将多片正?负极板分别并联,组成正?负极板组,如下图所示： 安装时,将正?负极板组相互嵌合,中间插入隔板,就形成了单格电池?在每个单格电池中,负极板的片数总要比正极板的片数多一片,从而使每片正极板都处于两片负极板之间,使正极板两侧放电均匀,避免因放电不均匀造成极板拱曲? 2.隔板 在各种类型的铅酸蓄电池中,除少数特殊组合的极板间留有宽大的空隙外,在两极板间均需插入隔板,以防止正?负极板相互接触而发生短路?这种隔板上密布着细小的孔,既可以保证电解液的通过,又可
以阻隔正?负极板之间的接触,控制反应速度,保护电池?隔板有木质?橡胶?微孔橡胶?微孔塑料?玻璃等数种,可根据蓄电池的类型适当选定?吸附式密封蓄电池的隔板是由超细玻璃丝绵制作的,这种隔板可以把电解液吸附在隔板内,吸附式密封蓄电池的名称也是由此而来的? 3.容器 容器是用来盛装电解液和支撑极板的,通常有玻璃容器?衬铅木质容器?硬橡胶容器和塑料容器四种?容器用于盛放电解液和极板组,应该耐酸?耐热?耐震?容器多采用硬橡胶或聚丙烯塑料制成,为整体式结构,底部有凸起的肋条以搁置极板组?壳内由间壁分成3个或6个互不相通的单格,各单格之间用铅质联条串联起来?容器上部使用相同材料的电池盖密封,电池盖上设有对应于每个单格电池的加液孔,用于添加电解液和蒸馏水以及测量电解液密度?温度和液面高度? 4.电解液 铅酸蓄电池的电解液是用蒸馏水稀释高纯浓硫酸而成的?它的密度高低视铅蓄电池类型和所用极板而定,一般在15℃时为1.200～1.300g/cm3?蓄电池用的电解液(稀硫酸)必须保持纯净,不能含有危害铅酸蓄电池的任何杂质?电解液的作用是给正?负电极之间流动的离子创造一个液体环境,或者说充当离子流动的介质?电解液的相对密度对蓄电池的工作有重要影响,相对密度大,可减少结冰的危险并提
激光原理习题
1、光与物质相互作用的三个基本过程：自发辐射、受激辐射、受激吸收。 2、激光器的损耗指的是在激光谐振腔内的光损耗，这种损耗可以分为两类：内部损耗、镜面损耗。 3、形成激光的条件：实现粒子数反转、满足阈值条件和谐振条件。 4、激光的四个基本特性：高亮度、方向性、单色性和相干性。 5、激光调制方法：内调制是指在激光生成的振荡过程中加载调制信号，通过改变激光的输 出特性而实现的调制。 外调制则是在激光形成以后，再用调制信号对激光进行调制，它并不改 变激光器的参数，而是改变已经输出的激光束的参数。 就调制方法来讲，也有振幅调制、强度调制、频率调制、相位调制以及脉冲调制等形式。 6、三种谱线增宽形式：自然增宽、碰撞增宽、多普勒增宽。 7、单纵模激光器的选频方法：短腔法、法布里—珀罗标准具法、三反射镜法。 8、激光器的基本结构：激光工作物质：能够实现粒子数反转，产生受激光放大。激励能源：能将低能级的粒子不断抽运到高能级，补充受激辐射减少高能级上的粒子数。光学谐振腔：提高光能密度，保证受激辐射大于受激吸收。 9、高斯光束的基膜腰斑半径（腰粗）公式：W 0= 2 1 W s = 2 1 π λL 简答题： 1、用速率方程组证明二能级系统不可能实现粒子数反转分布。
2、简述光频电磁场与物质的三种相互作用过程，并指出其影响因素。（画图说明） 答:光与物质相互作用的本质是光与物质中的电子发生相互作用，使得电子在不同的能级之间跃迁。包括三种基本过程：自发发射、受激辐射以及受激吸收。 .自发发射——在无外电磁场作用时,粒子自发地从E2跃迁到E1,发射光子hv。(a)特点:各粒子自发、独立地发射的光子。各光子的方向、偏振、初相等状态是无规的, 独立的，粒子体系为非相干光源。受激辐射:——原处于高能级E2的粒子, 受到能量恰为hv=E2-E1的光子的激励, 发射出与入射光子相同的一个光子而跃迁到低能级E1 。特点:①受激发射只能在频率满足hv=E2-E1的光子的激励下发生;②不同粒子发射的光子与入射光子的频率、位相、偏振等状态相同; 这样,光场中相同光子数目增加,光强增大,即入射光被放大——光放大过程。受激吸收:——原处于低能级E1的粒子,受到能量恰为hv=E2-E1的光子照射而吸收该光子的能量,跃迁到高能级E2。 3、 3、简述激光器的基本结构以及产生激光的基本条件：①有提供放大作用的增益介质作为激光工作物质，其激活粒子（原子、分子或离子）有适合于产生受激辐射的能级结构。②有外界激励源，将下能级的粒子抽运到上能级，使激光上下能级之间产生粒子数反转③有光学谐振腔，增长激活介质的工作长度，控制光束的传播方向，选择被放大的受激辐射光频率以提
铅酸蓄电池结构详解
铅酸蓄电池结构详解 一、蓄电池的功用 蓄电池种类较多，根据电解液不同，有酸性和碱性之分。由于铅酸蓄电池阻小，电压稳定，在短时间能供给较大的起动电流，而且结构简单，价格较低，所以在汽车拖拉机上被广泛采用。 蓄电池为一可逆直流电源，在汽车拖拉机上与发电机并联，它的主要作用是：（1）发动机起动时，蓄电池向起动机和点火装置供电。起动发动机时，蓄电池必须在短时间（5~10s）给起动机提供强大的起动电流（汽油机为200~600A。柴油机有的高达1000A）。 （2）在发电机不发电或电压较低发动机处于低速时，蓄电池向点火系及其它用电设备供电，同时向交流发电机供给他激励磁电流。 （3）当用电设备同时接入较多，发电机超载时，蓄电池协助发电机共同向用电设备供电。 （4）当蓄电池存电不足，而发电机负载又较少时，可将发电机的电能转变为化学能储存起来，即充电。 （5）蓄电池还有稳定电网电压的作用。当发动机运转时，交流发电机向整个系统提供电流。蓄电池起稳定电器系统电压的作用。蓄电池相当于一个较大的电容器，可吸收发电机的瞬时过电压，保护电子元件不被损坏。延长其使用寿命。 二、蓄电池的构造 车用12V蓄电池均由6个单格电池串联而成，每个单格的标称电压为2V，串联成12V的电源，向汽车拖拉机用电设备供电。
蓄电池主要由极板、电解液、格板、电极、壳体等部分组成。 1．极板 极板分为正极板和负极板两种。蓄电池的充电过程是依靠极板上的活性物质和电解液中硫酸的化学反应来实现的。正极板上的活性物质是深棕色的二氧化铅（PbO2），负极板上的活性物质是海绵状、青灰色的纯铅（Pb）。 正、负极板的活性物质分别填充在铅锑合金铸成的栅架上，加入锑的目的是提高栅架的机械强度和浇铸性能。但锑有一定的副作用，锑易从正极板栅架中解析出来而引起蓄电池的自行放电和栅架的膨胀、溃烂，从而影响蓄电池的使用寿命。 负极板的厚度为1.8mm，正极板为2.2mm，为了提高蓄电池的容量，国外大多采用厚度为1.1~1.5mm的薄型极板。另外，为了提高蓄电池的容量，将多片正、负极板并联，组成正、负极板组。在每单格电池中，负极板的数量总比正极板多一片，正极板都处于负极板之间，使其两侧放电均匀，否则因正极板机械强度差，单面工作会使两侧活性物质体积变化不一致，造成极板弯曲。 2．隔板 为了减少蓄电池的阻和体积，正、负极板应尽量靠近但彼此又不能接触而短路，所以在相邻正负极板间加有绝缘隔板。隔板应具有多孔性，以便电解液渗透，而且应具有良好的耐酸性和抗碱性。 隔板材料有木质、微孔橡胶、微孔塑料以及浸树脂纸质等。近年来，还有将微孔塑料隔板做成袋状，紧包在正极板的外部，防止活性物质脱落。 3．壳体
WesternBlot原理和操作方法(全)讲解
Western Blot 原理和操作方法（全） Western Blot 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ? SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数 ①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100% 其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml) ②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) <104 20-30
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤 Western blot基本原理： 在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western blot应用： 目的蛋白的表达特性分析； 目的蛋白与其他蛋白的互作； 目的蛋白的组织定位； 目的蛋白的表达量分析； 蛋白样品的制备： 1 水溶液提取法：稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的的溶剂，操作相对麻烦，重复性一般； 2 有机溶剂提取法； 3 离心管柱提取法：超快速，易用，高产及重复性强； 4 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。 Western blot注意事项和常见问题：
1 我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？ 答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长；也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。 2 我做的蛋白质分子量很小（10 KD），请问怎么做WB？ 答：可以选择0.2 μm的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。 3 最后显色时用DAB好还是ECM好？ 答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级蛋白，具体可以根据你实验的情况。 4 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？ 答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。
铅酸蓄电池的原理与性能
. 铅酸蓄电池的原理与性能 一、铅酸蓄电池的工作原理 蓄电池是一种化学电源，它的构造可以是各式各样的，可是从原理上讲所有的电池都是由正极、负极、电解质、隔离物和容器组成的，其中正负两极的活性物质和电解质起电化反应，对电池产生电流起着主要作用，如图4-1所示。 在电池内部，正极和负极通过电解质构成电池的内电路，在电池外部接通两极的导线和负荷构成电池的外电路。 在电极和电解液的接触面有电极电位产生，不同的两极活性物质产生不同的电极电位，有着较高电位的电极叫做正极，有着较低电位的电极叫做负极，这样在正负极之间产生了电位差，当外电路接通时，就有电流从正极经过外电路流向负极，再由负极经过内电路流向正极，电池向外电路输送电流的过程，叫做电池的放电。 在放电过程中，两极活性物质逐渐消耗，负极活性物质 1.电解质 2.负极 3.容量 4.正极 5.隔离物 6.导线 7.负荷 图4-1 电池构造示意图 放出电子而被氧化，正极活性物质吸收从外电路流回的电子而被还原，这样负极电位逐渐升高，正极电位逐渐降低，两极间的电位差也就逐渐降低，而且由于电化反应形成新的化合物增加了电池的内阻，使电池输出电流逐渐减少，直至不能满足使用要求时，或在外电路两电极之间端电压低于一定限度时，电池放电即告终。 电池放电以后，用外来直流电源以适当的反向电流通入，可以使已形成的新化合物还原成为原来的活性物质，而电池又能放电，这种用反向电流使活性物质还原的过程叫做充电。 蓄电池可以反复多次充电、放电，循环使用，使用寿命长，成本较低，能输出较大的能量，放电时电压下降很慢。 1.电动势的产生 铅蓄电池的正极是二氧化铅(PbO 2)，负极是绒状铅(Pb)，它们是两种不同的活性物质，故和稀硫酸(H 2SO 4)起化学作用的结果也不同。在未接通负载时，由于化学作用 使正极板上缺少电子，负极板上却多余电子，如图4-2所 图4-2 铅蓄电池电势产生过程 示，两极间就产生了一定的电位差。 2.放电过程的化学反应 当外电路接上负载(比如灯泡)后，铅蓄电池在正、负极板间电位差(电动势)的作用下，电流Ⅰ从正极流出，经负载流向负极，也就是说，负极上的电子经负载进入正极，如图4-3。同时在蓄电池内部产生化学反应：
wb原理步骤及总结
实验原理 蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。 电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。 蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。 主要溶液 10%分离胶 水 3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL 5%浓缩胶 水 2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/LTris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL 1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液 Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L 2×SDS凝胶加样缓冲液 Tris-HCl（pH6.8） 100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS 转移缓冲液 Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1L TBST Tris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1mL，加去离子水至1L Stripping 1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140μlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL 实验步骤 1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳 ⑴凝胶配置 ①分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约2cm 处，停止灌胶。检查是否有气泡，若有用滤纸条吸出。然后在胶液界面上加蒸馏水进行水封。15~30min后，凝胶和水封层界面清晰，说明胶已经聚合完全，然后用滤纸吸取水封层，滤纸切勿接触到凝胶面。（使蛋白样品分离） ②浓缩胶的配置：将配置好的浓缩胶灌注在分离胶之上，直至短玻璃板的顶端，然后插入样品
激光产生原理(内容清晰)
激光产生原理 了解激光产生原理，我们必先了解物质的结构，与激光的辐射和吸收的原理。 图一碳原子示意图 物质由原子组成。图一是一个碳原子的示意图。原子的中心是原子核，由质子和中子组成。质子带有正电荷，中子则不带电。原子的外围布满着带负电的电子，绕着原子核运动。有趣的是，电子在原子中的能量并不是任意的。描述微观世界的量子力学告诉我们，这些电子会处于一些固定的「能阶」，不同的能阶对应于不同的电子能量。为了简单起见，我们可以如图一所示，把这些能阶想象成一些绕着原子核的轨道，距离原子核越远的轨道能量越高。此外，不同轨道最多可容纳的电子数目也不同，例如最低的轨道 (也是最近原子核的轨道) 最多只可容纳 2 个电子，较高的轨道则可容纳 8 个电子等等。事实上，这个过份简化了的模型并不是完全正确的 [1]，但它足以帮助我们说明激光的基本原理。 电子可以透过吸收或释放能量从一个能阶跃迁至另一个能阶。例如当电子吸收了一个光子 [2] 时，它便可能从一个较低的能阶跃迁至一个较高的能阶 (图二 a)。同样地，一个位于高能阶的电子也会透过发射一个光子而跃迁至较低的能阶 (图二 b)。在这些过程中，电子吸收或释放的光子能量总是与这两能阶的能量差相等。由于光子能量决定了光的波长，因此，吸收或释放的光具有固定的颜色。 图二原子内电子的跃迁过程
当原子内所有电子处于可能的最低能阶时，整个原子的能量最低，我们称原子处于基态。图一显示了碳原子处于基态时电子的排列状况。当一个或多个电子处于较高的能阶时，我们称原子处于受激态。前面说过，电子可透过吸收或释放在能阶之间跃迁。跃迁又可分为三种形式﹕ 1.自发吸收 - 电子透过吸收光子从低能阶跃迁到高能阶 (图二 a)。 2.自发辐射 - 电子自发地透过释放光子从高能阶跃迁到较低能阶 (图二 b)。 3.受激辐射 - 光子射入物质诱发电子从高能阶跃迁到低能阶，并释放光子。入射光子与释放的光子有相同的波长和相，此波长对应于两个能阶的能量差。一个光子诱发一个原子发射一个光子，最后就变成两个相同的光子 (图二 c)。 图三红宝石激光的示意图 激光基本上就是由第三种跃迁机制所产生的。图三显示红宝石激光的原理。它由一枝闪光灯，激光介质和两面镜所组成。激光介质是红宝石晶体，当中有微量的铬原子。在开始时，闪光灯发出的光射入激光介质，使激光介质中的铬原子受到激发，最外层的电子跃迁到受激态。此时，有些电子会透过释放光子，回到较低的能阶。而释放出的光子会被设于激光介质两端的镜子来回反射，诱发更多的电子进行受激辐射，使激光的强度增加。设在两端的其中一面镜子会把全部光子反射，另一面镜子则会把大部分光子反射，并让其余小部分光子穿过﹔而穿过镜子的光子就构成我们所见的激光。 图四粒子数反转的状态 产生激光还有一个巧妙之处，就是要实现所谓粒子数反转的状态。以红宝石激光为例 (图四)，原子首先吸收能量，跃迁至受激态。原子处于受激态的时间非常短，大约?秒后，它便会落
最详细的WesternBlot过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
激光焊接基本原理讲解-共14页
一、激光基本原理 1、 LASER 是什么意思 Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation(通过诱导放出实现光能增幅的英语开头字母 2、激光产生的原理 激光――“受激辐射放大”是通过强光照射激光发生介质,使介质内部原子的电子获得能量,受激而使电子运动轨道发生迁移,由低能态变为高能态。处于激发态的原子,受外界辐射感应,使处于激发态的原子跃迁到低能态,同时发出一束光;这束光在频率、相位、传播方向、偏振等方面和入射光完全一致,此时的光为受激辐射光。 为了得到高能量密度、高指向性的激光,必须要有封闭光线的谐振腔,使观光束在置于激光发生介质两侧的反射镜之间往复振荡,进而提高光强,同时提高光的方向性。含有钕 (ND的 YAG 结晶体发生的激光是一种人眼看不见的波长为 1.064um 的近红外光。这种光束在微弱的受激发情况下,也能实现连续发振。 YAG 晶体是宝石钇铝石榴石的简称,具有优异的光学特性,是最佳的激光发振用结晶体。 3、激光的主要特长 a 、单色性――激光不是已许多不同的光混一合而成的,它是最纯的单色光 (波长、频率 b 、方向性――激光传播时基本不向外扩散。 c 、相干性――激光的位相 (波峰和波谷很有规律,相干性好。 d 、高输出功率――用透镜聚焦激光后,所得到的能量密度是太阳光的几百倍。 二、 YAG 激光焊接
激光焊接是利用激光束优异的方向性和高功么密度等特点进行工作。通过光学系统将激光束聚焦在很小的区域内,在极短的时间内使被焊处形成一个能量高度集中的热源区,从而使被焊物熔化并形成牢固的焊点和焊缝。 常用的激光焊接方式有两种:脉冲激光焊和连续激光焊。前者主要用于单点固定连续和薄件材料的焊接。后者主要用于大厚件的焊接和切割。 l 、激光焊接加工方法的特征 A 、非接触加工,不需对工件加压和进行表面处理。 B 、焊点小、能量密度高、适合于高速加工。 C 、短时间焊接,既对外界无热影响,又对材料本身的热变形及热影响区小,尤其适合加工高熔点、高硬度、 特种材料。 D 、不需要填充金属、不需要真空环境 (可在空气中直接进行、不会像电子束那样在空气中产生 X 射线的危险。 E 、与接触焊工艺相比 . 无电极、工具等的磨损消耗。 F 、无加工噪音,对环境无污染。 G 、微小工件也可加工。此外,还可通过透明材料的壁进行焊接。 H 、可通过光纤实现远距离、普通方法难以达到的部位、多路同时或分时焊接。 I 、很容易改变激光输出焦距及焊点位置。 J 、很容易搭载到自动机、机器人装置上。
WB实验原理
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立，主要用于测定蛋白质亚基分子量。Western 印迹是在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上，将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上，应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点，针对特定蛋白进行鉴别和定量。 原理 1．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂，例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚，使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。在水溶液中蛋白质-SDS胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。 2．Western 印迹 在Western印迹法中，待测样品溶解于去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持物上（常用硝酸纤维素滤膜），然后可被染色。随后滤膜可与抗靶蛋白的一抗反应。最后，结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂（与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的A蛋白或抗免疫球蛋白）检测。Western 印记法可测出1-5ng中等大小的待检蛋白。 方法 1.样品的制备 从细胞中提取蛋白质样品用于Western印记的方法有两种，一是可以在加样缓冲液中直接溶解完整细胞；二是制备细胞提取液。可根据不同的目的采用不同的方法。如果仅是定性实验，可应用第一种方法；如果需测定蛋白含量并进行定量实验，可应用后一种方法。1.1 凝胶加样缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品 1）裂解细胞或组织 a.单层培养细胞：用PBS缓冲液漂洗细胞2次，弃去洗液并吸尽残余的PBS液体， 加入一定体积（50～200μl）的加热到85℃的1×SDS凝胶加样缓冲液[50mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 100mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 2% SDS, 0.1% 溴酚蓝，10%甘油] 溶解细胞，用细胞刮刀把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中，用于步骤2）。 b.悬浮培养细胞：用冷的PBS充分洗涤细胞后，去尽残液，加入一定体积用冰预冷 的悬浮缓冲液[0.1mol/L NaCl，0.01mol/L Tris.Cl（pH 7.6），0.001mol/L EDTA （pH 8.0），1μg/ml Aprotinin，100μg/ml PMSF]，涡流振荡混匀后，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液[100mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 4% SDS, 0.2% 溴酚蓝，20% 甘油]，混匀后，用于步骤2）。
激光的理论基础讲解
激光的理论基础 直到二十世纪初，人们才在实验的基础上揭开了原子结构的奥秘。原子结构像是一个小小的太阳系，中间是原子核，电子围绕原子核不停地旋转，同时也不停地自转。原子核集中了原子的绝大部分质量，但却只占有很小的空间。原子核带正电，电子带负电，一般原子核与电子所携带的正负电荷数量相等，因此对外呈中性。电子绕核旋转具有一定的动能，同时负电荷的电子与正电荷的原子核之间存在着一定的位能。所有电子的动能与位能之和就是整个原 直到二十世纪初，人们才在实验的基础上揭开了原子结构的奥秘。原子结构像是一个小小的太阳系，中间是原子核，电子围绕原子核不停地旋转，同时也不停地自转。原子核集中了原子的绝大部分质量，但却只占有很小的空间。原子核带正电，电子带负电，一般原子核与电子所携带的正负电荷数量相等，因此对外呈中性。电子绕核旋转具有一定的动能，同时负电荷的电子与正电荷的原子核之间存在着一定的位能。所有电子的动能与位能之和就是整个原子的能量，称为原子的内能。 这种原子模型是1911年由英国科学家卢瑟福提出的。紧接着，1913年，丹麦物理学家玻尔提出了原子只能处于由不连续能级表征的一系列状态——定态上，这与宏观世界中的情况大不相同。人造卫星绕地球旋转时，可以位于任意的轨道上，也就是说可具有任意的连续变化的能量。而电子在绕核运动时，却只能处于某些特定的轨道上。从而原子的内能不能连续的改变，而是一级一级分开的，这样的级就称为原子的能级。 不同的原子具有不同的能级结构。一个原子中最低的能级称为基态，其余的称为高能态，或激发态。原子从高能态E2过渡到低能态E1时，会向外发射某个频率为ν的辐射，满足普朗克公式：hv = E1 - E2 式中h为普朗克常数。反之，该原子吸收频率为ν的辐射时，就会从低能态E1过渡到高能态E2。 爱因斯坦在玻尔工作的基础上于1916年发表《关于辐射的量子理论》。文章提出了激光辐射理论，而这正是激光理论的核心基础。因此爱因斯坦被认为是激光理论之父。在这篇论文中，爱因斯坦区分了三种过程：受激吸收、自发辐射、受激辐射。前两个概念是已为人所知的。受激吸收就是处于低能态的原子吸收外界辐射而跃迁到高能态；自发辐射是指高能态的原子自发地辐射出光子并迁移至低能态。这种辐射的特点是每一个原子的跃迁是自发的、独立进行的，其过程全无外界的影响，彼此之间也没有关系。因此它们发出的光子的状态是各不相同的。这样的光相干性差，方向散乱，而受激辐射则相反。它是指处于高能级的原子在光子的“刺激”或者“感应”下，跃迁到低能级，并辐射出一个和入射光子同样频率的光子。这好比清晨公鸡打鸣，一个公鸡叫起来，其他的公鸡受到“刺激”也会发出同样的声音。受激辐射的最大特
westernblot原理及步骤
一、配胶 原理： 30% acrylamide mix：产生凝胶的基本物质 1.5M Tris(ph 8.8) ：使分离胶PH为8.8（与甘氨酸的pka接近，从而使不同分子量的蛋白产生不同的电泳速度，从而使不同分子量的蛋白分开）1.0MTris(ph 6.8)：使浓缩胶PH为6.8（可以通过甘氨酸和氯离子的作用产生压缩，从而使蛋白条带压细） 10% SDS阴离子去污剂：断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质二三级结构，消除蛋白质在迁移过程中结构的影响。与蛋白质形成SDS-蛋白质复合物，由于SDS带有大量负电荷，蛋白质本身的电荷被掩盖，从而消除蛋白质迁移过程中自身电荷的差异造成的影响。同时能够助溶，蛋白质变为亲水，容易在水相中迁移。每克多肽可以与1.4g 去污剂结合，当分子量在15kd-200kd之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，logMW（分子量）=K-bx（迁移率）AP：提供acr丙烯酰胺和bis亚甲丙烯酰胺聚合的氧自由基，是acr 和bis聚合的引发剂 TEMED：催化AP释放氧自由基，是反应的催化剂 1、清洗干净1.5mm或1mm玻璃板，检漏（有豁口和字的朝上） 2、倒掉水，配10ml 10%的分离胶（1.5mm板需要7ml，1mm 板需要4.5ml） 10%方案如下： H2O 4.0ml
30% acrylamide mix 3.3ml 1.5M Tris(ph 8.8) 2.5ml 10% SDS 0.1ml 10% ammonium persulfate 0.1ml TEMED 0.004ml 3、混合后上下摇晃，注意不要放在手中配（否则温度太高凝固的快），静置15s后用1ml枪二档吸一档打（在一角加即可，不用来回加，否则容易出气泡。不过出气泡了也没事，加水压一下就浮上来了） 4、加进玻璃板中，随后均匀来回加水到满 5、等待20分钟 6、倒掉水，将架子倒置过来让水排干，用纸巾擦拭斜角（一定要擦干净所有的水！否则两层胶之间出现水层就废了），同时配浓缩胶4ml H2O 2.7ml 30% acrylamide mix 0.67ml 1.0M Tris(ph 6.8) 0.5ml 10% SDS 0.04ml 10% ammonium persulfate 0.04ml TEMED 0.004ml 7、加满分离胶后插入1.5mm或1mm的梳子，注意不要有气泡，
WesternBlot实验详解(--)
Western Blot 实验详解 、实验材料 Western Blot 相关试剂： 甘氨酸，最后加入 200ml 甲醇。4 C 保存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 30%储备胶：丙烯酰胺 Acr 29.0g 、亚甲双丙烯酰胺（Bis ） 1.0g ，混匀后加入去离子水 37 C 溶解，定容至100ml 。4C 避光保存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 10%AP （过硫酸铵）：称取1gAP ，加入10ml 去离子水搅拌。分装，-20C 保存。 Western BIot 相关仪器： 电泳仪；转移仪；摇转仪。 二、实验原理 经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体 （例如硝酸纤维素薄膜） 上，固相载体 以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载 体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应， 再与酶或同位素标记的第二抗体 起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 该 技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 文档收集自网络，仅用于个人学习 2X Sample Buffer : 1ml Glycerol （甘油）；0.5ml Beta mercaptoethanol （B -巯基乙醇）；3ml 10%SDS; 1。25ml 4 X Upper buffer; 4.25ml dH 2O; Add bromop he nol blue （溴酚蓝）to color 。 文档收集自网络，仅用于个人学习 10X 电泳缓冲液（pH 8.3 ）:在1L 大烧杯中加入800ml 去离子水，称取 Tris 30.2g 、甘氨酸 188g ，混匀，加入100ml 10%SDS ，定容至1L 。（注：SDS 在68C 水浴中溶解）。工作液：1 X 电泳缓冲液 去离子水稀释 室温保存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 1.5M Tris-HCl （pH8.8） : Tris 181。7g 去离子水溶解，用浓盐酸调至 pH8.8，定容至1L 室温 保存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 1M Tris-HCl （pH6.8） : Tris 121.1g 去离子水溶解，用浓盐酸调至 pH7.5，定容至1L 存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 10X TS （洗膜液）：在 800ml 去离子水，加入 NacI 90g ， 1M Tris-HCl （pH7.5） 100ml ， 水定容至1L 。工作液：1 X TS 室温保存。文档收集自网络，仅用于个人学习 1M Tris-HCl （pH7.5） ： Tris 121.1g 去离子水溶解，用浓盐酸调至 存。 文档收集自网络，仅用于个人学习 10%SDS :称取十二烷基磺酸钠（SDS ）10g,加入约80ml 去离子水， 调 pH 至 7.2，定容至 100ml 。 文档收集自网络，仅用于个人学习 1X Transfer Buffer : 在 1L 大烧杯中加入 800ml 去离子水，加入 pH7.5 ，定容至 1L 室温保 去离子 室温保 68 C 加热溶解。用10%HCI 3.03g Trisgrams ， 14.43g
铅酸蓄电池的工作原理
铅酸蓄电池的工作原理 1、铅酸蓄电池电动势的产生： A)铅酸蓄电池充电后，正极板是二氧化铅（PbO2），在硫酸溶液中水分子的作用下，少量二氧化铅与水生成可离解的不稳定物质——氢氧化铅（Pb（OH）2），氢氧根离子在溶液中，铅离子（Pb）留在正极板上，故正极板上缺少电子。 B)铅酸蓄电池充电后，负极板是铅（Pb），与电解液中的硫酸（H2SO2）发生反应，变成铅离子（Pb+2），铅离子转移到电解液中，负极板上留下多余的两个电子（2e）。可见，在未接通外电路时（电池开路），由于化学作用，正极板上缺少电子，负极板上多余电子，两极板间就产生了一定的电位差，这就是电池的电动势。 2、铅酸蓄电池放电过程的电化反应： A）铅酸蓄电池放电时，在蓄电池的电位差作用下，负极板上的电子经负载进入正极板形成电流I ，同时在电池内部进行化学反应。 B）负极板上每个铅原子放出两个电子后，生成的铅离子（Pb+2）与电解液中的硫酸根离子（SO4-2）反应，在极板上生成难溶的硫酸铅（PbSO4）。 C）正极板的铅离子（Pb+4）得到来自负极的两个电子（2e）后，变成二价铅离子（Pb+2）与电解液中的硫酸根离子（SO4-2）反应，在极板上生成难溶的硫酸铅（PbSO4）。正极板水解出的氧离子（O2）与电解液中的氢离子（H+）反应，生成稳定物质水. D）电解液中存在的硫酸根离子和氢离子在电力场的作用下分别移向电池的正负极，在电池内部形成电流，整个回路形成，蓄电池向外持续放电。 E）放电时H2SO4浓度不断下降，正负极上的硫酸铅（PbSO2）增加，电池内阻增大（硫酸铅不导电），电解液浓度下降，电池电动势降低。 F）化学反应式为： 正极活性物质电解液负极活性物质正极生成物电解液生成物负极生成物↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ PbO2 + H2SO4 + Pb → PbSO4 + 2H2O + PbSO4 氧化铅稀硫酸铅硫酸铅水硫酸铅 3、铅酸蓄电池充电过程的电化反应 A）充电时，应在外接一直流电源（充电极或整流器），使正、负极板在放电后生成的物质恢复成原来的活性物质，并把外界的电能转变为化学能储存起来。 B）在正极板上，在外界电流的作用下，硫酸铅被离解为二价铅离子（Pb ）和硫酸根负离子(SO4￣2)由于外电源不断从正极吸取电子，则正极板附近游离的二价铅离子（Pb ）不断放出两个电子来补充，变成四价铅离子（Pb ），并与水继续反应，最终在正极极板上生成二氧化铅（PbO ）。 C）在负极板上，在外界电流的作用下，硫酸铅被离解为二价铅离子（Pb ）和硫酸根负离子（SO4￣2），由于负