菌种培养
第一章无菌操作技术
第一节灭菌技术
一、干热灭菌
1.1、灼烧灭菌
【总操作程序】
主要分两个步骤：点燃火源灼烧2～3次。具体操作如下：
①点燃火源
一般使用酒精灯或煤气灯，点燃酒精灯或煤气灯。
②灼烧2～3次
一般右手持待灭菌的器具，在火焰的外焰上来回灼烧2～3次。
【达标标准】
灭菌后的器具干燥，所有的微生物被杀死。
【注意事项】
①正确使用火源，防止失火。
使用酒精灯时，先要检查灯芯，如果灯芯顶端不平或已烧焦，需要剪去少使其平整，然后检查灯里有无酒精，灯里酒精的体积应大于酒精灯容积的1/4，少于2/3。在使用酒精灯时，应注意，绝对禁止用酒精灯引烧另一盏酒精灯，而应用燃着的火柴或木条来引燃；用完酒精灯，必须用灯帽盖灭，不可用嘴去吹灭，否则可能将火焰沿灯颈压入灯内，引起着火或爆炸。不要碰倒酒精灯，万一洒出的酒精在桌上燃烧起来，不要惊慌，应立即用湿抹布扑盖。灼烧时应用火焰的外焰
②主要用于实验室接种针、接种环、试管口和玻璃棒等的灭菌。涂布平板用的玻璃棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。
【相关知识】
干热灭菌的原理：热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
1.2、干热灭菌
【总操作程序】
主要分五个步骤：装入待灭菌物品升温恒温降温开箱取物。具体操作如下：
①装入待灭菌物品
将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱内，关好箱门。
②升温
接通电源，拨动开关，打开电热干燥箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升，当温度上升到100℃时，关闭排气孔，在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；此时如果还未达到所需的160～170℃,则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，知道达到所需温度。
③恒温
当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，恒温2h。
④降温
切断电源，自动降温。
⑤开箱取物
待电热干燥箱内温度降到70℃以后，打开箱门，取出灭菌物品。
【达标标准】
灭菌后的物品经无菌检测结果符合要求。一般不需要检测，因为SAL值一般大于12。SAL（Sterility assurance level）值是无菌保证值，无菌保证值为灭菌产品后微生物残存率的负对数，表示物品被灭菌后的无菌状态。
【注意事项】
①一般用于培养皿、试管、枪头等的灭菌，灭菌时各种器皿用纸包好，培养皿可直接装入金属制的培养皿筒内，移液管可以放入移液管筒中。
②灭菌期间，要有专人看管，切勿同时干其他事情，以免发生事故。
③物品不要放得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触点燃干燥箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦着火。
④干热灭菌过程中，严防恒温调节器的自动控制失灵而造成安全隐患事故。
⑤干热灭菌温度不能超过180℃，否则包装纸和棉塞就会烧焦，甚至燃烧。
⑥温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
⑦灭菌后的器皿，在使用前勿打开包装纸，以免被空气中的杂菌污染。
【相关知识】
电热干燥箱的使用操作方法，参照产品使用说明书。
二、湿热灭菌
2.1常压间歇灭菌
【总操作程序】
主要分4步：装入待灭菌物品灭菌灭菌后的物品放置室温下连续3d 具体操作如下：
①装入待灭菌物品
需要灭菌的物品包装好后放置于蒸汽灭菌器或蒸笼中。
②灭菌
加热100℃，保持30min。
③灭菌后的物品放置于室温下
取出灭菌后的物品放置于室温下18～24h。
④连续3d
第二天再加热100℃，灭菌30min，灭菌后的物品取出放置于室温下，第三天再同样处理一遍，可达到完全灭菌的目的。
【达标标准】
物品应达到完全灭菌，如果是灭菌培养基放在37℃温箱培养24h，无杂菌生长，即可待用。
【注意事项】
①不能用于怕受潮物品的灭菌。
②适用于不易用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等。
③灭菌后的器皿，在使用前勿打开包装纸，以免被空气中的杂菌污染。
【相关知识】
①根据情况，湿热灭菌也可以采用煮沸灭菌，时间为10～15min,这样可以杀死细菌所有营养细胞和部分芽孢。如延长煮沸时间，并在水中加入1%碳酸氢钠或2%石碳酸，效果更好。
②灭菌一次30min，只能杀死微生物的繁殖体、真菌的孢子和细菌的部分芽孢，而不能
杀死所有的芽孢。当把第一次灭菌后的物品放置室温下时，物品上残存的芽孢就会萌发，变成繁殖体，繁殖体对热力的抵抗力远远弱于芽孢的抵抗力。因此，当第二次灭菌时，又可以杀死芽孢形成的繁殖体。这样进行三次，即可达到完全灭菌的目的。
③湿热灭菌是用饱和水蒸汽、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，所以该法的灭菌效率要比干热法高。
2.2、高压蒸汽灭菌
【总操作程序】
主要分8个步骤：加水装料加盖排气升压保压降压灭菌后的处理。具体操作如下：
①加水
首先将锅内层取出，再向外层锅内加适量的水，使水面与三角架持平为宜，水应用蒸馏水。
②装料
放回内层锅，待灭菌物品包装好后放入灭菌锅内。
③加盖
将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，旋紧锅盖，打开排气阀。
④排气
用电炉或煤气加热，或用自动高压蒸汽灭菌锅，使水沸腾以排除锅内的冷空气，冷空气排净完，关闭排气阀。一般小型排气5min，大型的10min。
⑤升压
排气阀关闭后，压力上升。
⑥保压
当锅内压力升到所需压力时，保持热源，维持压力至所需要的时间。
⑦降压
灭菌时间到后，切断电源，让灭菌锅内的温度自然下降，待压力降到零位时，打开盖子，取出灭菌物品。
⑧灭菌后的处理
每次灭菌完毕，必须倒掉锅内的剩水，按原样放置。灭菌培养基在37℃条件下放置24h，无杂菌生长，即可待用。
【达标标准】
无菌物品经无菌检测合格后即可烘干备用。
【注意事项】
①灭菌时要有专人负责，每次灭菌前都要检测安全阀性能是否良好，以防锅内压力过高，发生爆炸。灭菌时应严格按操作程序进行，避免发生事故。
②各种培养基、溶液、玻璃器皿、金属器械、工作服、橡胶用品等均可用高压灭菌器灭菌。一般灭菌条件为121℃，20min。
③瓶装液体灭菌时，要用玻璃纸和纱布包扎瓶口，如用橡皮塞，应插针头排气。灭菌物品摆放不应该太拥挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果，三角瓶和试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
④灭菌的各种包裹都不应过大、过紧，一般应小于55cm×33cm×22cm。
⑤灭菌时高压锅内冷空气要排除干净。
⑥务必等压力降到零时，才可以打开锅盖，否则因锅内压力突然下降，使培养基或其他液体会发生再次沸腾，液体冲上瓶口沾湿棉塞。
⑦已灭菌的物品应做好标记，以便识别，灭菌后的物品在使用前勿打开包装纸，以免空气中的杂菌污染。
【相关知识】
不同的高压蒸汽锅的使用方法不同，参照说明书。
三、过滤除菌
【总操作程序】
主要有5个步骤：组装、灭菌连接压滤无菌检测清洗。具体操作如下：
①组装、灭菌
微孔滤膜过滤除菌时，首先将滤膜与滤器组装好，包装灭菌后待用。其他过滤装置，过滤前应将过滤器和收集滤液的试管组装好，抽滤瓶口应塞一段棉塞以阻止空气中的细菌进入滤瓶中，用纸包装好进行加压灭菌，在121℃下灭菌20min。
②连接
将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作的方式连接于装有待滤液的注射器上，将针头与出口连接并插入带有橡皮管的无菌试管中。
③压滤
将注射器中的待滤液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拔出。
④无菌检查
无菌操作吸取除菌滤液0.1mL于肉汤蛋白胨平板上，涂布均匀，置37℃室温下培养24h，检查有无菌生长。
⑤清洗
弃去滤膜，清洗干净滤器，换上新的滤膜组装好灭菌待用。
【达标标准】
无菌操作吸取除菌滤液0.1mL于肉汤蛋白胨平板上，涂布均匀，置37℃室温下培养24h，检查有无菌生长，无菌生长即可。
【注意事项】
①许多材料，例如血清、抗生素及糖溶液等原料，用加热消毒灭菌方法，均会被破坏，因此通常采用过滤除菌的方法。
②压滤时，用力要适当，不可以太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。
③过滤时应避免各种连接处出现渗透现象。
④过滤除菌时每次过滤必须用新的滤板。
⑤发酵工业上也可以用过滤的方法制备大量的无菌空气。
【相关知识】
①过滤除菌的原理。
②微生物的大小。
③滤膜孔径大小的选择。
④应用最广泛的过滤器：蔡氏过滤器和微孔滤膜过滤器。
四、化学药品灭菌
【总操作程序】
主要分两个步骤：配制溶液喷洒或浸泡、气体熏蒸、擦拭等。具体操作如下：
①配制溶液
根据需要配制不同浓度的化学药品灭菌剂。
②喷洒或浸泡、气体熏蒸、擦拭
根据灭菌对象的不同，选择不同的灭菌方式。
【达标标准】
环境或手上检测无菌。
【注意事项】
①通常用于生产环境灭菌，接种操作前双手的灭菌。
②注意各种化学灭菌剂的用途、使用浓度及使用方法。
【相关知识】
①化学药品灭菌的原理主要有：使蛋白质变性、脱水、改变细胞壁的通透性等。
②环境灭菌时常用甲醛、乙醇、来苏尔、新洁尔灭、漂白粉、过氧乙酸等。
③环境中微生物的分布状况和微生物的检测。
④甲醛（37%）：将此溶液直接加热，产生气态甲醛用于无菌室的灭菌5；新洁尔灭：可用于擦拭工作台，或浸泡手5min。溶液可以反复使用40次；漂白粉（0.3%～0.5%）可灭空气中的微生物；过氧乙酸：喷雾或蒸汽灭菌（0.1～0.2mg/L），浸泡器具灭菌（5%，20min）。乙醇（75%～80%）：擦拭或浸泡，可用于皮肤表面、操作台及其相关器具的灭菌。
⑤环氧乙烷：可用于物料灭菌和受热易破坏的培养基灭菌。把所需灭菌的物料置于不透气的囊袋中，充入环氧乙烷-二氧化碳，密闭进行灭菌。将培养基温度降至10℃以下，加入1%（V/V）环氧乙烷，将容器密闭1～2h灭菌后，升温至37～45℃，保温数小时或过夜，使环氧乙烷汽化逸出。
五、射线灭菌
5.1单用射线灭菌
【总操作程序】
主要分3个步骤：灭菌前的准备灭菌检查。具体操作如下：
①灭菌前的准备
将无菌室内或在接种室内（如果用于培养基的灭菌，应提前把盛有培养基的培养皿放进来）打开射线电源开关。
②灭菌
照射30min，将开关关闭。
③检查
将盛有培养基的平皿打开15min,然后盖上皿盖。置37℃培养24h，共做三套。检测每个平皿生长的菌落数。如果不超过4个，说明灭菌效果良好；否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。
【达标标准】
无菌室检查，一般培养基无菌检测时，菌落不超过4个。
【注意事项】
①由于紫外对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，所以不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。
②紫外线的穿透力低，只能用于表面灭菌，对固体物料灭菌不彻底，不能用于液体物料灭菌，一般用于无菌室、接种箱、培养间等的空间灭菌。
【相关知识】
①射线灭菌的原理。
②可以利用的有紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子。
③紫外线波长在200～300nm，具有杀菌作用，其中以265～266nm杀菌力最强。此波长的紫外线易被细胞中的核酸吸收，造成细胞损伤而杀菌，紫外线灭菌在微生物工作及生产实践中应用广泛，无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌。
④采用60Co射线灭菌，已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料制作的容器及医用生物敷料皮等的灭菌。γ射线灭菌的最大优点是穿透力强，可在厚包装完好条件下灭菌。
⑤环境中微生物的分布。
5.2、化学试剂与紫外线照射结合使用
【总操作程序】
主要有三个步骤：灭菌前的准备灭菌检查。具体操作如下：
①灭菌前的准备
在无菌室内或接种室内（如果用于培养基的灭菌，应提前把盛有培养基的培养皿放进去）先喷洒3%～5%的石碳酸溶液，无菌室内的桌面、凳子用2%～3%来苏尔擦洗，打开射线电源开关。
②灭菌
照射30min，将开关关闭。
③检查
将盛有培养基的平皿打开15min,然后盖上皿盖。置37℃培养24h，共做三套。检测每个平皿生长的菌落数。如果不超过4个，说明灭菌效果良好；否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。
【达标标准】
无菌室检查，一般培养基无菌检测时，菌落不超过4个。
【注意事项】
紫外线灭菌的正确操作及人身安全。
【相关知识】
①紫外灭菌原理及化学试剂灭菌原理。
②环境中微生物的分布。
第二节无菌操作技术
一、斜面接种
【总操作程序】
主要有三个步骤：接种前的准备接种接种后的处理。具体操作如下：
①接种前的准备
操作前，先用75%的酒精擦手，待酒精挥发后才能点燃酒精灯。
贴标签或标注：将注有菌名、接种日期和接种者姓名的标签贴在试管培养基斜面的正上方离管口约3～4cm处，或接种前用记号笔在距试管口2～3cm位置上注明菌名、接种日期等。
旋松棉塞或试管塞：先将菌种或斜面的棉塞旋转一下，以便接种时更容易拔出。
点燃酒精灯或煤气灯，并将火焰调至适中。
②接种
左手持试管：将菌种管及待接种的斜面管并排放于左手的食指、中指和无名指之间，试
管一般易保持水平位置，两个管口要平齐，斜面朝上，用拇指按住试管的基部（不要遮住整个斜面）
灼烧接种环：右手握住接种环的胶木柄，将镍丝环口和其余部分用火焰烧红，然后将接种环来回通过火焰2～3次。
拔棉塞或试管塞：用右手小指、无名指和手掌拔下棉塞或试管塞，并持于手中。将试管口在火焰上微烧一周，然后让试管稍离火焰，应保持水平状态，以防杂菌落入管内。
接种：将烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死菌体，然后用环在菌苔上轻轻接触，刮下少许培养物，并将接种环慢慢地从试管中抽出，并迅速的伸入另一试管中，自基部开始向上在斜面上划线（波浪或直线），使菌体沾附在培养基上。接种完毕，移出接种环，同时将两支试管口一次过火，最有塞上棉塞或试管塞，并将试管插在试管架上。
杀死环上的残菌：接种完毕应立即灼烧接种环，以杀死残留的菌体。
③接种后的处理
清洗：废弃的菌种管应先拔去棉塞再置于水浴中煮沸20min，立即刷洗干净。
清理桌面。
【达标标准】
接种斜面培养后无杂菌污染，长势良好，符合实验或生产要求。
【注意事项】
①接种要在无菌条件下进行。
②接种时要关闭紫外灯。
③标记要做清楚。
④接种环自菌种管中移出时，不能通过火焰和触及其他物品。
⑤划线时动作要轻巧，以防划破培养基。
⑥所用棉塞必须要松紧合适。
⑦所有器皿必须严格灭菌，接种工具用后经火焰灼烧后才能放在桌子上。
⑧斜面接种一般用于菌种的活化或扩大培养。培养好的菌种放于4℃冰箱保存。
【相关知识】
①无菌室的灭菌。
②一般小规模的接种操作用接种箱或超净工作台。
③培养基的灭菌。
④菌种好坏的分辨。
⑤缓冲间内应有悬挂隔离用的工作服、鞋、帽、口罩，消毒用的药物、手持式喷雾器等。
二、液体接种
2.1由斜面菌种接入液体培养基
【总操作程序】
主要分3个步骤：接种前的准备接种接种后的处理。具体操作步骤基本上与斜面接种相同，但使试管口向上以免培养液体流出。接入菌体后，使接种环与管壁轻轻研磨，使菌体擦下。
【达标标准】
接种培养后得到纯的菌种。
【注意事项】
①接种后塞好棉塞，将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。
②若向液体培养基中接大量或定量接种时，可先将无菌水或液体培养基加入菌种试管，用接种环将菌苔刮下制成菌悬液，刮菌苔时要逐步从上向下将菌体洗下，用手或振荡器振匀。再将菌悬液用塞有过滤棉花的无菌吸管定量吸出后加入，或直接倒入液体培养基。
③整个过程无菌操作。
④一般用于观察微生物的生长特性或生化反应测定，也可以用于菌种的扩大培养。
【相关知识】
①培养基的类型。
②培养基的灭菌。
③菌种的扩大培养。
2.2由液体接入液体培养基
【总操作程序】
主要分3个步骤：接种前的准备接种接种后的处理。具体操作步骤基本上与斜面接种相同，菌种为液体，接种工具常用无菌吸管或滴管。接种时在火焰旁边拔去棉塞，将管口通过火焰，用无菌吸管吸取菌液注入培养基内或直接倒入液体培养基，摇匀。
【达标标准】
接种培养后得到纯的菌种。
【注意事项】
①接种后塞好棉塞，将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。
②真个过程无菌操作。
③一般用于观察微生物的生长特性或生化反应测定，也可以用于菌种的扩大培养。
【相关知识】
①培养基的类型。
②培养基的灭菌。
③菌种的扩大培养。
三、穿刺接种
【总操作程序】
主要分三个步骤：接种前的准备穿刺接种接种后的处理。具体操作类型似斜面接种。不同的是接种所使用的接种环换成接种针。
【达标标准】
接种培养后能够清晰观察菌落的形态特征。
【注意事项】
①把接种针在穿刺中可能伸入试管的部分灼烧灭菌；接种针先在培养基部分冷却，再用接种针的针尖沾取少量菌种。
②接种时有两种手持操作法，一种是水平法，它类似于斜面接种法，一种则称垂直法。尽管穿刺时手持方法不同，但穿刺时所用接种针都必须挺直，将接种针自培养基中心垂直地刺入培养基中。穿刺时要做到手稳、动作轻巧快速，并且要将接种针穿刺到接近试管底部，然后沿着接种线将针慢慢拔出。
③穿刺接种的菌种常作为保藏菌种的一种形式，同时也是检查细菌运动能力的一种方法，它只适宜于细菌和酵母的接种培养。
④可用于嫌气性细菌接种或为鉴定细菌时观察生理性能。
⑤试管培养基灭菌后应垂直放置凝固。
【相关知识】
①微生物的营养与生长。
②微生物的种类。
四、平板接种
4.1稀释涂布平板法
【总操作程序】
主要分5个步骤：融化培养基倒平板制备菌种稀释液涂布接种后的处理。具体操作如下：
①融化培养基
取装在三角瓶内的无菌培养基置于水浴中煮沸，融化后取出，待冷却至55～60℃时，混匀后倒平板。
②倒平板
右手持盛培养基的三角瓶或试管置火焰旁，用左手将试管塞或瓶塞轻轻拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管（瓶）塞（也可以将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住，如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞不必夹在手中）。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附件打开一缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝固后即为平板。
③制备菌种稀释液
取一定量的样品加入盛有一定量的无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振摇约20min，使样品与无菌水充分混合，将细胞分散。用无菌吸管从中吸取一定量的菌液用无菌水继续稀释，制备成不同稀释度的菌液
④涂布
在上述每种培养基平板底部标记稀释度，然后用无菌吸管从不同稀释度的菌悬液中吸取0.1mL对号放入平板培养基表面的中央位置。右手拿无菌的玻璃涂棒放在培养基表面轻轻的涂布均匀，将菌悬液先沿着一条直线轻轻的来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿着另一垂直线来回推动，平板边缘处可以改变方向用涂棒再涂几次，室温下静止5～10min，使菌液吸附进培养基。
⑤接种后的处理
培养：根据不同菌种的生长特性在合适的温度下培养一定的时间，观察菌落的特征。
清理桌面。
【达标标准】
培养后长出清晰可分辨的菌落，无杂菌污染。
【注意事项】
①用于倒平板的培养基一定要彻底融化，否则会出现未融化的琼脂块，使平板表面不平整，而且倒平板的培养基温度不能过高（50℃左右为宜），否则会形成较多的冷凝水，不利于单菌落的形成。
②在倒平板过程中，切勿用手抓三角瓶瓶口，以免烫伤手指。
③倒平板和接种操作保证在无菌条件下进行。
④可用于菌种的分离纯化，直至获得纯培养，也可以用于微生物的计数。
【相关知识】
①稀释涂布平板法的原理。
②菌种的分离纯化方法。
4.2平板划线法
【总操作程序】
主要分5个步骤：融化培养基倒平板作分区标记划线操作接种后处理。具体操作如下
①融化培养基
取装在三角瓶内的无菌培养基置于水浴中煮沸，融化后取出，待冷却至55～60℃时，混匀后倒平板。
②倒平板
右手持盛培养基的三角瓶或试管置火焰旁，用左手将试管塞或瓶塞轻轻拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管（瓶）塞（也可以将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住，如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞不必夹在手中）。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附件打开一缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝固后即为平板。
③作分区标记
作标记的范围是整个平板的面积。
④划线操作
挑取菌落（或其他含菌样品）：用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
划线：将平板置于火焰旁，左手拿皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着火焰，这时皿盖朝上，扔留在火焰旁，右手拿接种环现在一区划3～4条连续的平行线（线条的多少应以挑取菌量多少而定）。划完一区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底将其覆盖在皿盖上方，以防杂菌污染。将烧去残菌的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使二区转到上方，接种环通过一区将菌带到二区，随即划数条致密的平行线。再从二区作三区的划线。最后经三区向四区划线。四区的线条应与一区的平行。但划四区时切勿重新接触一区、二区，以免将该两区中浓密的菌液带到四区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中，烧去接种环上的残菌。
⑤接种后的处理
培养：根据不同菌种的生长特性在合适的温度下培养一定的时间，观察菌落的特征。
清理桌面。
【达标标准】
经划线培养后菌落清晰，便于挑取分离、纯化。
【注意事项】
①要多练习，掌握划线的技巧，以提高成功率。
②划线用的接种环，环柄宜稍长，环口宜圆滑，划线时环与平板之间的交角宜小，动作要轻巧，以防划破平板。
③平板不能制作的太薄，在有条件的情况下，平板应在使用前一天倒成，而且培养基不宜太烫。以防冷凝水太多，影响分离效果。
④多用于菌种的分离纯化。
【相关知识】
①平板划线分离菌种的原理。
②菌种的分离、纯化方法。
菌种培养
第一章无菌操作技术 第一节灭菌技术 一、干热灭菌 1.1、灼烧灭菌 【总操作程序】 主要分两个步骤：点燃火源灼烧2～3次。具体操作如下： ①点燃火源 一般使用酒精灯或煤气灯，点燃酒精灯或煤气灯。 ②灼烧2～3次 一般右手持待灭菌的器具，在火焰的外焰上来回灼烧2～3次。 【达标标准】 灭菌后的器具干燥，所有的微生物被杀死。 【注意事项】 ①正确使用火源，防止失火。 使用酒精灯时，先要检查灯芯，如果灯芯顶端不平或已烧焦，需要剪去少使其平整，然后检查灯里有无酒精，灯里酒精的体积应大于酒精灯容积的1/4，少于2/3。在使用酒精灯时，应注意，绝对禁止用酒精灯引烧另一盏酒精灯，而应用燃着的火柴或木条来引燃；用完酒精灯，必须用灯帽盖灭，不可用嘴去吹灭，否则可能将火焰沿灯颈压入灯内，引起着火或爆炸。不要碰倒酒精灯，万一洒出的酒精在桌上燃烧起来，不要惊慌，应立即用湿抹布扑盖。灼烧时应用火焰的外焰 ②主要用于实验室接种针、接种环、试管口和玻璃棒等的灭菌。涂布平板用的玻璃棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。 【相关知识】 干热灭菌的原理：热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 1.2、干热灭菌 【总操作程序】 主要分五个步骤：装入待灭菌物品升温恒温降温开箱取物。具体操作如下： ①装入待灭菌物品 将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱内，关好箱门。 ②升温 接通电源，拨动开关，打开电热干燥箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升，当温度上升到100℃时，关闭排气孔，在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；此时如果还未达到所需的160～170℃,则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，知道达到所需温度。 ③恒温 当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，恒温2h。 ④降温 切断电源，自动降温。 ⑤开箱取物
污水处理培养菌种方法
培菌方法： 1、所谓活性污泥培养，就是为活性污泥的微生物提供一定的生长繁殖条件，即营养物，溶解氧，适宜温度和酸碱度。 （1）营养物：即水中碳、氮、磷之比应保持100∶5∶1。 （2）溶解氧：就好氧微生物而言，环境溶解氧大于0.3mg/l，正常代谢活动已经足够。但因污泥以絮体形式存在于曝气池中，以直径500μm活性污泥絮粒而言，周围溶解氧浓度2mg/l时，絮粒中心已低于0.1mg/l，抑制了好氧菌生长，所以曝气池溶解氧浓度常需高于3－5mg/l，常按5－10mg/l控制。调试一般认为，曝气池出口处溶解氧控制在2mg/l较为适宜。 （3）温度：任何一种细菌都有一个最适生长温度，随温度上升，细菌生长加速，但有一个最低和最高生长温度范围，一般为10－45oC，适宜温度为15－35oC，此范围内温度变化对运行影响不大。 （4）酸碱度：一般PH为6－9。特殊时，进水最高可为PH 9－10.5，超过上述规定值时，应加酸碱调节。 2、培菌法： （1）生活污水培菌法：在温暖季节，先使曝气池充满生活污水，闷曝（即曝气而不进污水）数十小时后，即可开始进水。引进水量由小到大逐渐调节，连续运行数天即可见活性污泥出现，并逐渐增多。为加快培养进程，在培菌初期投加一些浓质粪便水或米泔水等，以提高营养物浓度。特别注意，培菌时期（尤其初期）由于污泥尚未大量形成，污泥浓度低，故应控制曝气量，应大大低于正常期曝气量。 （2）干泥接种培菌法：最好取水质相同已正常运行的污水系统脱水后的干
污泥作菌种源进行接种培养。一般按曝气池总溶积1％的干泥量，加适量水捣碎，然后再加适量工业废水和浓粪便水。按上述的方法培菌，污泥即可很快形成并增加至所需浓度 （3）数级扩大培菌法：根据微生物生长繁殖快的特点，仿照发酵工业中菌种→种子罐→发酵罐数级扩大培菌工艺，分级扩大培菌。如某工程设计为三级曝气池，此时可先在一个池中培菌，在少量接种条件下，在一个曝气池内培菌，成功后直接扩大至二三级。 （4）工业废水直接培菌法：某些工业废水，如罐头食品、豆制品、肉类加工废水，可直接培菌；另一类工业废水，营养成分尚全，但浓度不够，需补充营养物，以加快培养进程。所加营养物品常有：淀粉浆料、食堂米泔水、面汤水（碳源）；或尿素、硫氨、氨水（氮源）等，具体情况应按不同水质而定。 （5）有毒或难降解工业废水培菌：有毒或难降解工业废水，只能先以生活污水培菌，然后再将工业废水逐步引入，逐步驯化的方式进行。 （6）直接引进种菌种培菌：有些特殊水质菌种难于培养，还可利用当地科研力量，利用专业的工业微生物研究所培养菌种后再接种培养，如PVA（聚乙烯醇）好氧消化即有专门好氧菌。此法，投资大，周期长，只有特殊情况才用。 3、驯化：在培菌阶段后期，将生活污水和外加营养物量，逐渐减少，工业废水比例逐渐增加，最后全部转为受纳工业废水，这个过程称为驯化。理论上讲，细菌对有机物分解必须有酶参与，而且每种酶都要有足够数量。驯化时，每变化一次配比时，需要保持数天，待运行稳定后（指污泥浓度未减少，处理效果正常），才可再次变动配比，直至驯化结束。
香菇菌种生产的方法与步骤
香菇菌种生产的方法与步骤 (一)母种生产培养基的配方选择 一是马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基(PDA)：去皮马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂16~23克，水1 000毫升。氢离子浓度1 000~10000纳摩／升(pH5~6)，用于分离、培养菌种。 二是PDA改良培养基(甲)：马铃薯(去皮)200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾(KH2PO4)2克，硫酸镁(MgSO4)0．5克，维生素B110毫克，琼脂20克，水1000毫升，灭菌后氢离子浓度3163～10000纳摩／升(pH5．0～5．5)，用于培养、分离菌种。 三是PDA改良培养基(乙)：马铃薯(去皮)200克，麸皮或米糠50克，硫酸镁0.5克，维生素B110毫克，琼脂20克，灭菌后氢离子浓度3163～3981纳摩／升(pH5．4～5．5)。 四是PDA改良培养基(丙)：心材木200克，细米糠(或麸皮)100克，硫酸铵1克，麦芽糖(或葡萄糖)20克，琼脂20克，水1 000毫升，灭菌后氢离子浓度3163～10000纳摩／升 (pH5.0～5.5)，用于分离菌种。 五是麦芽浸膏、酵母浸膏、琼脂培养基(MYD)：麦芽浸膏3克，葡萄糖10克，酵母浸膏3克，琼脂20克，蛋白胨5克，水1 000毫升(用于菌种培养)。 六是麦芽浸膏、蛋白胨培养基(MPA)：麦芽浸膏20～25克，蛋白胨10克，琼脂20克，水1 000毫升(用于分离、培养、保存菌种)。 上述6个培养基配方中，马铃薯、葡萄糖、琼脂(PDA)配方应用最普遍。在此着重介绍PDA培养基的配制方法与步骤： 1．制备培养基的操作程序 选择优质马铃薯，去皮或挖去发芽眼，削去发青皮，切成薄片，称取200克，置于钢精锅，加水1 000毫升，煮沸后小火保持30分钟，趁热用8层纱布过滤后放人有1 000毫升刻度的量杯(或量筒)中，补充水到1 000毫升，倒回钢精锅，加琼脂继续加热，待琼脂溶化后，再加葡萄糖，再补水至1000毫升，用玻璃棒搅均匀，趁热分装试管，或装入三角瓶备用。 2．分装试管 将配制好的PDA培养基，趁热(60℃)倒人事先准备好的量杯或玻璃漏斗，分装试管。每支试管装培养基为管长的1／4，培养液不可贴附管口内壁，如有沾附物必须揩拭干净。 3．做棉塞 取适量棉花做成较紧实的棉塞，塞入试管约2厘米左右，外留1厘米，紧贴试管内壁，松紧度
羊肚菌菌种制作技术(课件)
羊肚菌菌种制作技术 羊肚菌是世界上珍贵的稀有食用菌之一，属高级营养品。它富含蛋白质、碳水化合物、多种维生素及２0多种氨基酸，特别是有机锗含量高,具有补肾、壮阳、补脑、提神的功能；主治精肾亏损、阳痿不举、性欲冷淡；对头晕失眠、肠胃炎症、脾胃虚弱、消化不良、饮食不振有良好的辅助治疗作用;还可以防癌抗癌、预防感冒、增强人体免疫力，在医学上有重要的开发价值.由于它功能齐全,香味独特，食疗效果显著,目前国内每千克售价８０0~1００0元,尤其在西欧国家供应十分紧俏,价格更昂贵。 因羊肚菌与其它食用菌不同,栽培适应性较差，特别是在异地栽培稳定性差。因此，利用当地的羊肚菌品种分离制出的菌种，能适应当地环境，可避免异地购种的地区性差异和邮寄途中的影响,建议种植户最好分离当地的品种.它能适应当地环境，但也要注意羊肚菌的菌种隔年使用效果不好,有变异现象。这就给大面积栽培和推广带来了困难.所以羊肚菌的菌种最好每年分离、驯化.这是迄今尚未实现商品化栽培的原因之一,加上栽培管理或环境达不到要求就会不出菇。这就是羊肚菌人工栽培困难的奥秘.?一、制种注意事项 羊肚菌的菌种性能与其它食用菌不同,菌种分离方
法和育种手段及栽培管理技术与其它食用菌也有很大差异。最大的缺点就是容易退化、变异、生霉。这对栽培羊肚菌带来很大困难。对此，首先要控制菌种传代，无论母种、原种、栽培种，若违反技术要求,多传一代就会出现上述不良反应或不长子实体.母种只能经过原种栽培种,到栽培中的一次流程和3次破菌愈合才能保住质量;若超过3次菌丝断裂而重新萌发的新菌丝，会失去或降低酶的分解作用,以致抗病力差，易生杂菌，不出菇。 二、母种制作? (一）培养基配方 ①黄豆芽500克（煮汁)，白糖20克，琼脂20克，羊肚菌基脚～50克,水1升。?②黄豆芽5０0克（煮汁），白糖20克,琼脂20克，水１升。 ③栎木屑５00克（煮汁),白糖20克，琼脂20克，水1升。 ④马铃薯２0０克（煮汁)，白糖20克，琼脂２0克,蛋白胨0。5克,牛肉膏0.５克，水1升。 ⑤蛋白胨１克，葡萄糖20克，琼脂20克,酵母膏1克,磷酸二氢钾１克，硫酸镁１克，维生素B1，1克，水１升。ｐＨ值自然。?上述配方任选一组。将木屑或豆芽加水１升煮30分钟,过滤取汁,并将余下的水补足1升,加入其它原料，煮至溶化后,按母种制作常规方法，分装于18毫米×1８０毫米或2０毫米×２00毫米试管的1/５，塞
菌种保存方法
菌种保藏方法 中国工业微生物菌种保藏管理中心 微生物菌种保藏对于微生物菌种的研究和利用至关重要。以下是中国工业微生物菌种保藏管理中心整理的目前国际国内常用的菌种保藏方法，包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法，各种菌种保藏方法都有详细的步骤说明。 定期移植法 亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断
搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。 2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。 2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。2.1.4 密波状蜿蜒划线法
污水处理菌种培养方法
污水处理菌种培养方法 培菌方法： 1、所谓活性污泥培养,就是为活性污泥的微生物提供一定的生长繁殖条件,即营养物，溶解氧,适宜温度和酸碱度。 (1）营养物：即水中碳、氮、磷之比应保持1００∶5∶1。?(２)溶解氧:就好氧微生物而言,环境溶解氧大于0.3mg/ｌ,正常代谢活动已经足够。但因污泥以絮体形式存在于曝气池中，以直径5０0μm活性污泥絮粒而言,周围溶解氧浓度２ｍｇ/l时,絮粒中心已低于0.1mｇ/l,抑制了好氧菌生长,所以曝气池溶解氧浓度常需高于3-５mｇ/ｌ，常按5－10mｇ/ｌ控制。调试一般认为，曝气池出口处溶解氧控制在2mg／ｌ较为适宜。 (３）温度:任何一种细菌都有一个最适生长温度，随温度上升，细菌生长加速,但有一个最低和最高生长温度范围，一般为10-４5oC，适宜温度为15-35oC,此范围内温度变化对运行影响不大。?(4）酸碱度:一般PH为6-9。特殊时,进水最高可为PH 9-１0.5,超过上述规定值时,应加酸碱调节。?2、培菌法:?（1）生活污水培菌法:在温暖季节，先使曝气池充满生活污水，闷曝（即曝气而不进污水）数十小时后，即可开始进水。引进水量由小到大逐渐调节，连续运行数天即可见活性污泥出现,并逐渐增多。为加快培养进程,在培菌初期投加一些浓质粪便水或米泔水等,以提高营养物浓度。特别注意,培菌时期（尤其初期)由于污泥尚未大量形成，污泥浓度低，故应控制曝气量，应大大低于
正常期曝气量。 (2)干泥接种培菌法:最好取水质相同已正常运行的污水系统脱水后的干污泥作菌种源进行接种培养。一般按曝气池总溶积1%的干泥量，加适量水捣碎，然后再加适量工业废水和浓粪便水。按上述的方法培菌，污泥即可很快形成并增加至所需浓度(3）数级扩大培菌法：根据微生物生长繁殖快的特点，仿照发酵工业中菌种→种子罐→发酵罐数级扩大培菌工艺,分级扩大培菌。如某工程设计为三级曝气池，此时可先在一个池中培菌,在少量接种条件下,在一个曝气池内培菌，成功后直接扩大至二三级。?（4)工业废水直接培菌法：某些工业废水，如罐头食品、豆制品、肉类加工废水，可直接培菌;另一类工业废水，营养成分尚全,但浓度不够,需补充营养物,以加快培养进程。所加营养物品常有:淀粉浆料、食堂米泔水、面汤水(碳源);或尿素、硫氨、氨水(氮源）等，具体情况应按不同水质而定。 (5）有毒或难降解工业废水培菌：有毒或难降解工业废水,只能先以生活污水培菌,然后再将工业废水逐步引入，逐步驯化的方式进行。?(6)直接引进种菌种培菌：有些特殊水质菌种难于培养,还可利用当地科研力量,利用专业的工业微生物研究所培养菌种后再接种培养，如PVA(聚乙烯醇）好氧消化即有专门好氧菌。此法,投资大,周期长,只有特殊情况才用。 ３、驯化:在培菌阶段后期，将生活污水和外加营养物量,逐渐
菌种活化方法
低温保存管（cryo tube）中之一般菌种临时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryo tube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以 37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 ?l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示 （1）金属接种环
（2）平板划线法 冷冻干燥管之开管说明 下列步骤请在无菌环境下操作： 1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。 2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。 3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。 4、( a ) 适用于细菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。 ( b ) 适用于霉菌、酵母菌 用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。 5、取0.1-0.2 ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。 6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期 ( lag period ) 较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养 (Subculture) 后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。 7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。
微生物菌种的扩大培养技术
菌种的扩大培养是发酵生产的第一道工序，该工序又称之为种子制备。种子制备不仅要使菌 体数量增加，更重要的是，经过种子制备培养出具有高质量的生产种子供发酵生产使用。因此，如何提供发酵产量高、生产性能稳定、数量足够而且不被其他杂菌污染的生产菌种，是 种子制备工艺的关键。 种子扩大培养的任务 工业生产规模越大，每次发酵所需的种子就越多。要使小小的微生物在几十小时的较短 时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。菌种扩 大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。因为发酵时间的 长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会。因此，种子 扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的菌体，而且还要获得活力旺盛的、接种数量足够的菌体。对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数，抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖较慢，常常采用三级种子扩大培养。一般50 t发 酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级发酵，如链霉素生产。有些酶制剂发酵生产也采用 三级发酵。而谷氨酸及其他氨基酸的发酵所采用的菌种是细菌，生长繁殖速度很快，一般采 用二级发酵。 种子制备的过程 细菌、酵母菌的种子制备就是一个细胞数量增加的过程。细菌的斜面培养基多采用碳源 限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。细菌培养温度大多数为37 ℃， 少数为28 ℃，细菌菌体培养时间一般1～2天，产芽孢的细菌则需培养5～10天。 霉菌、放线菌的种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的孢子制 备和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。 ⒈孢子制备 孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌 丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。不同菌种的孢子制备工艺有其不同的特点。 ⑴放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些 适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。碳源和氮源不要太丰 富(碳源约为1％，氮源不超过0.5％)，碳源丰富容易造成生理酸性的营养环境，不利于放线 菌孢子的形成，氮源丰富则有利于菌丝繁殖而不利于孢子形成。一般情况下，干燥和限制营 养可直接或间接诱导孢子形成。放线菌斜面的培养温度大多数为28 ℃，少数为37 ℃，培养 时间为5～14天。
微生物菌种操作方法汇总
常用的几种微生物接种方法 接种细菌应用接种针（环）来沾取细菌标本，进行接种。接种环与接种针为用白金丝或合金丝所制，亦可用电炉丝代替，因它能耐高热且散热快，便于接种前后通过火焰灭菌（整个接种环烧红即达到灭菌目的）。在使用接种环时一般用右手持笔式较为方便，左手可持培养基进行配合，其接种程序可分为：灭菌接种环→稍冷→沾取细菌样品→进行接种（包括：启盖或塞、接种划线、加盖或塞）→进行接种环灭菌等五个程序。不同培养基，接种方法也不同，分述如下： 一、平板划线接种法（分离培养法） 是将细菌分离培养的常用技术，其目的是将混有多种细菌的培养物，或标本中不同的细菌（病原菌与非病原菌）使其分散生长，形成单个菌落或分离出单一菌株，便于识别鉴定。平板划线接种方法较多，其中以分段划线法与曲线划线法较为常用。 （一）分段划线法 平板分段划线(左)及培养后菌落分布图 本法多用于含菌量较多的标本。方法是以接种环沾取少许样品先涂布于平板培养基表面一角作为第一段划线（划线时接种环与培养基表面呈45度角），然后将接种环置火焰上灭菌，俟冷（可接触平板试之，如不融化琼脂，即已冷却），于第二段处再作划线，且在开始划线时与第一段的划线相交接数次，以后划线不必再相接，待第二段划完时，再如上法灭菌，接种划线，依次划至最后一段，灭菌接种环。这样每一段划线内的细菌数逐渐减少，即以获得单个菌落，划线接种完毕，盖好平皿盖，倒置（平板底部向上）于37℃温箱中培养。 （二）连续划线法：此法多用于接种材料中含菌数量不太多的样品或培养物。方法是先将样品或培养物涂于平板表面的一角，然后用接种环自样品涂擦处开始，向左右两侧划开并逐渐向下移动，连续划成若干条分散的平等线。
菌种培养方法
菌种培养方法 污水处理-生活污水培菌法：在温暖季节，先使曝气池充满生活污水-污水处理，闷曝（即曝气而不进污水）数十小时后，即可开始进水。引进水量由小到大逐渐调节-污水处理，连续运行数天即可见活性污泥出现，并逐渐增多。为加快培养进程-污水处理，在培菌初期投加一些浓质粪便水或米泔水等，以提高营养物浓度。特别注意，培菌时期-污水处理（尤其初期）由于污泥尚未大量形成，污泥浓度低，故应控制曝气量-污水处理，应大大低于正常期曝气量。 1. 前期准备阶段 1.1. 物料准备①污泥准备对于万立方米级污水处理装置而言，其 生化池体积较大，为了保证生化池初始污泥浓度，需要准备投加的原始污泥量很大。理论上讲，投加后生化池的污泥的质量浓度最好控制在2 500mg/L左右。实际运行时，为了节约成 本，调试期间初始污泥的质量浓度可控制在1 500mg/L左右，一日处理1×104m3污水生化 时间为12h的污水处理装置为例，调试前需准备含水率在80%的活性污泥约40m3。污泥品种最好是同类或相似的活性污泥。如有困难，其它活性较强的污泥也可使用。污泥在使用前为保证一定的活性，对待用的污泥需进行喷水保湿处理，在保湿条件下污泥的活性至少可保持15d以上。 ②碳源培养前的准备生化调试过程中理想的碳源是大粪及淀粉。一般来说调试前期以加入大粪为主，中后期以加入淀粉为主，为接生成本，淀粉可用地脚面粉替代。由于大粪无法事先储存，因此，事前需和有关部门确定好调试期间需要的数量。调试期间碳源准备量一般按如下原则进行估算。每天投加到生化池的COD量按混合后生化池COD的质量浓度在200~300mg/L水平计，其中地脚面粉COD的质量折算量约为1t[COD]/t[面粉]。大粪的COD 折算比较困难，根据经验，在整个调试期间需100~150 m3的大粪。加入大粪的目的除补充 碳源外，还可增加生化池菌种的引入。地脚面粉可准备10~15t。③磷源、氮源的准备补 充碳源一般以普钙Ca（H2PO4)2为主，补充的氮源以尿素CO（NH2）2为主。生化池COD的质量浓度在300mg/L时估计BOD5值一般以100mg/L计，补充量按 m（BOD5）：m（N）：m （P）=100：5：1折算，每天需补充淀粉2000-3000kg，尿素100kg，补普钙200kg，质量比按照淀粉：尿素：普钙=20-30：1：2补给。调试期间需准备尿素2~3t，普钙5~6t。另外如有条件可准备10~20kg粉状阴离子聚丙烯酰胺（PAM）。 1.2. 物料化制及输送设备由于调试期间需要的物料量很大，加之生化调试无污水进入，池内污水流动性较差，为提高接种速度，需要将污泥及补充碳源尽可能均匀地输入各生化池内。因此，对于一定规模的污水处理设施设置物料化制及物料输送系统，对减轻劳动强度提高调试效率是必需的。根据经验，物料化制池宜设于地下，池内设空气搅拌装置，池容积一般在20~30m3。池内分二区，一区为化制区，该区需设置物料化制及初级垃圾清理装置；二区为输送取，设置潜水泵或液下泵，同时在泵周围设置垃圾同以防泵发生堵塞。输送管道在生化池附近宜使用软管以便根据需要调整投加料点位置。另外，物料化制旁最好设置一个消火栓或供水管，用于化制污泥及其它物料时供水。 1.3. 监测仪器准备为配合生化调试，需对生化池中的COD（铬法）、溶解氧、pH值、细菌等指标进行监测。一般生化处理调试需配备以下监测仪器：COD测定仪、溶解氧测定仪、pH值测定仪、显微镜。 2. 调试阶段 2.1. 初期（3d）①首先将生化池注入一定量的清水和部分待处理的污水， 然后将污泥倒入物料化制池。一般第1次投加20m3污泥，同时投加大粪等培养料，加水搅
活性污泥菌种培养复习课程
活性污泥菌种培养
活性污泥有多种培养方法，但不同的方法所要求的培养时间和人力物力均不同。应根据废水水质、气候、实际许可的条件等情况来选择培养方法。 1.培养前的准备工作 （1）各构筑物建成，并经清池清除建筑垃圾，静压试验证明无渗漏，无下沉位移，最后按有关规程验收合格。 （2）电器、机械、管路等全部设备建成并经单机试车、联动试车正常。最后按有关规程（说明书）验收合格。 （3）根据日后运行管理需要，有条件的污水处理厂（站）需进行最基本的常规化验测试，如pH、水温、COD、DO、生物相等，用以指导活性污泥的培养过程和日常运行。 （4）基础数据的调查摸底，包括污水流量昼夜变化情况，水质（pH、水温、COD、BOD5/CODCr、含氮、含磷、有毒物质等）及其变化情况，各种设施和设备的技术参数。有条件的地方最好对受纳水体(如接纳排污的河流等)本底水质调查备案，以便考察若干年后对受纳水体的影响提供依据。
（5）根据处理水质状况备足必需的营养物(碳源、氮源、磷源)，以备缺什么补什么。采用接种培菌法还需备足污水性质相似其他污水处理厂（站）的干（或浓缩）污泥作为活性污泥微生物培养用的菌种。 （6）操作人员应熟悉整个系统的管道布置和公用工程方面的情况，了解污泥培养的基本过程和控制要求。 （7）人员到位，自培养和驯化后一般应使系统连续运行，不能脱人。 （8）编制必要的化验和运转的原始记录报表以及初步的建章立制。从培菌伊始，逐步建立较规范的组织和管理模式，确保启动与正式运行的有序进行。 自然培菌 自然培菌，也称直接培菌法。它是利用废水中原有的少量微生物，逐步繁殖的培养过程。城市污水和一些营养成份较全、毒性小的工业废水，如食品厂、肉类加工厂废水，可以考虑这种培养方法，但培养时间相对较长。自然培菌又可分为间歇培菌和连续培菌二种。 （1）间歇培菌。将曝气池注满废水，进行闷曝（即只曝气而不进废水），数天后停止曝气，静置沉淀1 h，然后排出池内约1/5的上层废水，并注入相同量的新鲜
设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定 以及保藏技术
设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术 一．实验目的 1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。 二.实验原理 菌种的分离纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1.涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 2.平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 大肠菌群的培养鉴定 大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。 菌种保藏 菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。 保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的 三.实验器材 1.菌种：污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌 2、培养基：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基 和马铃薯固体斜面培养基。 3.器材：接种环、安培瓶、干燥器、冰箱、产气管、试管、培养皿、无菌平皿、无菌玻璃涂棒移液管、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 4.试剂：革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三（95%乙醇）、 革兰氏四（蕃红）；试剂：医用液体石腊（比重0.83～0.89）。 四．试验方法及步骤 1.大肠菌群的分离纯化 第一天 a．涂布平板法：将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。 第二天 b．平板划线法：经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果
污水处理菌种培养方法(1)
污水处理菌种培养方法 污水处理生化段需要用到哪些微生物菌种？目前市面感觉比较好用的是甘度污水处理菌种，比如甘度复合菌种、甘度反硝化细菌、甘度硝化细菌等；这些菌种都可以去除什么指标？今天我们就来聊聊甘度复合菌种、甘度反硝化细菌、甘度硝化细菌污水处理常用菌种培养方法？ 具体污水处理菌种对应的功效介绍： 1、甘度复合菌种：降解COD/BOD/氨氮/总氮/总磷等污染物；助力新老系统快速启动。 复合菌种主要是降解COD/BOD/氨氮/总氮/总磷等污染物，复合菌种是一个复合型菌种，属于兼性菌种，主要成分硝化细菌属、反硝化细菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属和活化酶以及多糖等等。同时应用于新老系统启动也具有非常好的效果。 2、甘度硝化细菌：主要降解氨氮 氨氮的去除所用的细菌是硝化细菌，硝化细菌属于好氧菌种，主要应用于好氧池，其成分主要是亚硝酸菌和硝酸菌组成。 3、甘度反硝化细菌：主要降解总氮 总氮的去除所用的细菌是反硝化细菌，属于厌氧菌，主要应用于厌氧池或缺氧池，其主要成分是假单胞菌属、芽孢杆菌科等等。 硝化阶段 硝化阶段：含氮有机物（有机氮）在有氧货无氧环境中被氨化为氨氮，改部分污水进入有氧的处理构筑物后，在亚硝酸细菌和硝化菌的做一下转化为硝酸盐氮，为后续反硝化提供准备。 控制条件： 1、溶解氧：溶解氧控制在2~3mg/l之间，溶解氧低于0.6mg/l硝化过程将受到较大抑制， 2、水温：硝化菌比较合适的水温25~35℃之间。通常低于5℃时，细菌的活性会受到抑制，硝化菌就很难发挥它的作用。 3、PH值：硝化菌最佳的PH值7.5~8.5之间 4、底物浓度：硝化细菌是自养型好氧菌，底物浓度对于硝化菌不是其生产的必要因素。 5、污泥龄：需要保证好氧系统的微生物有足够的硝化菌，提供硝化菌的浓度，通常将污泥龄控制在10d左右。 反硝化阶段 反硝化阶段：承接硝化段的产物硝酸盐氮，对其进行反硝化反应，使硝酸盐氮转化为氮气排出水体。 PH值：反硝化过程合适的PH值6.5~7.5，PH值控制不当，将影响反硝化细菌的生长速率及
细菌培养技术
第二节细菌培养检测技术 节概述 细菌的培养技术是微生物实验中基本技术之一。大多数细菌均可用人工方法培养，只有将细菌培养出来才能对它进行研究和鉴定 知识点导航 一.培养基的种类 培养基（culture medium）是细菌生长繁殖所需要的各种营养物质的人工制品。适宜的培养基 能使细菌在体外迅速生长繁殖，便于对细菌进行分离和鉴别。可分为基础培养基、营养培养基、选 择培养基、鉴别培养基、厌氧菌用培养基和特殊培养基。 （一）基础培养基 只含有细菌生长所需的最基本营养成分，应用最广泛，为制备多种培养基的基础，常见的有肉 汤培养基、琼脂培养基。 （二）营养培养基 在基础培养基中加入葡萄糖、血液、血清、腹水或酵母浸膏等有机物，可供营养要求较高的细 菌生长需要或增菌用。如结核分枝杆菌培养基中添加鸡蛋、马铃薯、甘油等。 （三）选择培养基 利用不同种类细菌对化学物质的敏感性不同而制成，使分离菌大量繁殖而抑制其它细菌生长的 培养基。培养基中含有的抑制剂能抑制非目的菌生长或使其生长不佳，有利于目的菌的检出和识别 。选择培养基多为固体平板，用于从标本中分离某些特定的细菌。 （四）鉴别培养基 培养基中加有某些特定成分，如糖、醇类和指示剂等，用于检查细菌的各种生化反应，以资鉴 别和鉴定细菌。 （五）厌氧菌用培养基 专性厌氧菌须在无氧条件下才能生长，故需在培养基中加入半胱氨酸、硫乙醇酸钠等还原剂，降低培养基中氧化还原电势，并应与外界空气隔绝，使培养基本身为无氧的环境。 （六）特殊培养基 为某些需要在特殊条件下才能生长的细菌培养之用。如高渗盐增菌培养基、高渗糖增菌培养基、改良Kagan氏培养基等。 二.培养基的制备 制备一般培养基的主要过程基本相似，包括调配、溶化、调整pH、过滤、分装、灭菌及检定和 保存。 三.细菌检验室的注意事项及无菌技术
菌种培养技术
如何选育菌种？ 为了获得适合大规模工业生产所需的优良生产菌种，一般首先是从自然界分离筛选具有产生目标产物能力的菌种，但这样获得的菌种的生产能力往往较低，生理生化特性不一定能满足生产要求，还需要进行大量的诱变选育，进一步提高其生产能力，改善性能；也可以对现有的生产菌种进行改造，即经诱变育种，选育出符合实际生产需要的菌株。 自然界中微生物资源异常丰富，土壤、水、空气、腐败的动植物残骸，都是微生物的主要集居和生长繁衍的场所。其种类之多，至今仍然是一个难于估测的未知数。以其集居环境（包括特殊和极端环境）、营养类型、生存方式、生理类型、代谢途径、合成能力等比较，均居生物界之冠。因此，微生物资源的开发和应用是当今世界瞩目的重大课题。 菌种的分离，不仅是把混杂的各类微生物有效地分开，得到纯种，更重要的是依着生产实际的要求，有的放矢、快速、准确地将能产生所需产物，或具有某种生化反应性能的菌种，从大量的微生物中挑选出来。有时是设计一种在分离阶段便能识别所需菌种的方法，更多的是利用特定的方法分离，获得所需菌种后，再进行识别。为了使获得的菌种能满足工业生产的需要，须考虑各种性能指标。因此，菌种分离和筛选的方法和策略就十分重要。 一般的菌种分离纯化和筛选步骤可分为采样、增殖与分离、发酵与性能测定等几个步骤。步骤和方法如下图所示：
3.发酵培养基如何配制？ 首先需了解微生物需要的营养物质。 （1）微生物需要的营养物质 营养物质应满足微生物的生长、繁殖和完成各种生理活动的需要。它们的作用可概括为形成结构（参与细胞组成）、提供能量和调节作用（构成酶的活性和物质运输系统）。 微生物的营养物质有六大类要素，即水、碳源、氮源、无机盐、生长因子和能源。 ① 水 水是微生物的重要组成部分，在代谢中占有重要地位。水在细胞中有两种存在形式：结合水和游离水。结合水与溶质或其他分子结合在一起，很难加以利用。游离水（或称为非结合水）则可以被微生物利用。 ② 碳源 碳在细胞的干物质中约占50%，所以微生物对碳的需求最大。凡是作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质，称为碳源。
菌种的分离与培养
菌种的分离与培养 在自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。菌种分母种、原种、栽培种。 (一）母种的分离培养 食用菌母种的分离，可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。 1.孢子分离法 孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。 （l）单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子，让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。 （2）多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。具体操作方法，有以下几种：
①种菇孢子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。形 成一层粉末状孢子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇为褐色，香菇、金针菇孢子印白色）。用接种针沾取少量孢子在试管 中的琼脂外面或培养皿上划线接种。待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。 还可用孢子采集器收集孢子。方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。并在纱布上倒少许升汞或无菌水。移入20℃ 左右恒温箱培养。 ②褶上涂抹法：按无菌操作分离时；应选择成熟的种菇， 用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。 ③钩悬法：取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳〕，用无菌不锈钢丝（或铁丝、棉线等其他 悬挂材料）悬挂于三角瓶内的培养基的上方，勿使接触到培
各级菌种制作方法
1,母种:又叫一级种,用直径18-22cm的试管制备.常用配方:去皮马铃薯200克,葡萄糖20克,琼脂10-20克,水1000毫升,先把土豆去皮称重,切成小块煮至熟而不烂,过滤加水至1000毫升,再把琼脂剪成小段,放入锅内,边搅边煮,待琼脂溶化后加入葡萄糖,由于琼脂质量各有不同加入份量要看情况而定，装管前取一小勺浮在凉水中冷却观察其硬度适合然后分袋试管,用棉花塞塞住试管口,放入小高压锅内灭菌,当压力表达到1.5个压力时,再灭菌30分钟,取出试管放成斜面,放置2-3 天后,无杂菌感染再放入接种箱内接种,接了种的试管放入培养室内进行培养,温度要求25℃左右,相对湿度75%以下.
2,原种:二级种,一般采用原种瓶和罐头瓶.培养料不要装的太满,装至瓶肩.原种的制备多采用谷粒种,锯沫种和棉子壳种. ①谷料种:用玉米,小麦为原料,精选后煮沸,使种子变软即成,不要煮的太熟,开花.熟后离火泡5分钟（不开盖而能吸足水份）而后装瓶,用小型或中型高压锅灭菌,放至温度25℃左右接入母种,放培养室内培养.一般25-30天即成. ②木屑种:木屑78%,麦麸20%,石膏1%,糖1%,料:水=1:1.3,拌匀装瓶,灭菌,接种培养.一般25-30天即成. ③棉子皮:因棉子皮各种营养丰富,一般不需要加其它物质,只加1%的糖和石膏,用料1.3-1.5倍的水拌匀即可,而后装瓶,灭菌,接种,培养即可.
推荐通用配方：木屑（或秸秆粉或棉籽壳）：80斤糠夫：6斤糖：0.5斤菇耳壮：1.6两石膏：1斤 3,生产种:三级种可用木屑,玉米,棉籽皮,菌草,麦秸等为原料,根据所栽培的品种,采用不同的配方,用聚乙烯或聚丙烯,直径15-28cm塑料袋装料,然后用常压灭菌锅灭菌,达到100℃后,再维持100℃8-10小时.待袋稍凉后出锅,使栽培袋温度降至25℃左右再用原种接种,而后放到培养室的培养架上培养. 推荐配方： ■地栽木耳配方锯沫（或秸秆粉或棉籽壳）：80斤 糠夫：5斤 豆粉：2斤
菌种保藏的几种方法
菌种保藏的几种方法 基本原理 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 三、器材 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与 100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1．斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，