遗传学实验指导

遗传学实验指导

实验1 细胞有丝分裂与减数分裂

实验1.1 植物根尖细胞有丝分裂过程的制片与观察

目的要求

学习和掌握植物细胞有丝分裂制片技术；观察植物细胞有丝分裂过程中染色体的形态特征及染色体的动态行为变化。

实验原理

有丝分裂是植物体细胞进行的一种主要分裂方式。有丝分裂的目的是增加细胞的数量而使植物有机体不断生长。在有丝分裂过程中，细胞核内的遗传物质能准确地进行复制，然后能有规律地均匀地分配到两个子细胞中去。植物有丝分裂主要在根尖、节间、茎的生长点、芽及其它分生组织里进行。将生长旺盛的植物分生组织经取材、固定、解离、染色、压片等处理即可以观察到细胞内的有丝分裂图象。如若需要进行染色体计数，则需进行前处理，即取材之后采用物理的或化学的方法，阻止细胞分裂过程中纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期。这时，染色体不排到赤道板上，而是散在整个细胞质中。这十分便于对染色体的形态、数目进行观察。

试剂和器材

1材料

均可以大蒜(Allium sativum 染色体数目2n=16)、玉米(Zea mays 染色体数目2n=20)、洋葱(Allium cepa染色体数目2n=16)或蚕豆(V icla faba染色体数目2n=12) 等根尖为实验材料。

2试剂

95％乙醇、冰乙酸、石炭酸品红、l mol／L HCl。

3器材

恒温培养箱、显微镜、水浴锅、载玻片、盖玻片、单面刀片、镊子、培养皿、量筒、吸水纸。

操作方法

1生根

植物根尖是植物的分生组织，取材容易，操作方便。植物根尖细胞分裂旺盛，因此，它是细胞有丝分裂相制备与观察的理想选取部位。大蒜、洋葱易于在水培、沙培、土培条件下生根。采用水培时要注意在暗处培养，以满足根生长条件，使根系生长旺盛。玉米和蚕豆种子可先用温水浸泡1天之后，再转入铺有多层吸水纸或纱布的培养皿中，上面盖双层湿纱布置于24～26℃温箱中培养，每天换水二次。

2取材

待根长至l.5~2.0 cm时，将根取下。若实验只需观察细胞有丝分裂的过程和各时期的特征，可将根尖直接放入Carnoy固定液(95％乙醇：冰乙酸=3：1)中固定；如果要观察染色体形态和数目，则必须对根尖进行前处理后才能固定。取材和固定必须要在细胞分裂高峰期进行，即分裂细胞占细胞总数最大值时进行，这样分裂细胞比例大，便于选择和观察。

不同的植物在不同的环境条件，其细胞分裂高峰的时间是不同的。大蒜和洋葱的细胞分裂高峰期通常

是在上午9～11点，下午15~17点左右。

3前处理

前处理的方法一般采用低温处理和化学药剂处理。

(1)低温处理：将取材的根尖放入盛有蒸馏水的烧杯或其它容器内，放在1～4℃的冰箱或其它低温条件下处理24h。不同的植物对低温的敏感程度不同，效果也不同。对低温较为敏感的植物是小麦。

(2)化学药剂处理：常用的药剂有0.05％~0. 1％的秋水仙素水溶液；饱和对二氯苯溶液；0.002～0.004 mo1/L 8—羟基喹啉等。

秋水仙素溶液对纺锤体的抑制效果最好，一般在室温条件下处理2～4h可达到理想的效果。如果处理时间过长，染色体会变得更短，不利于对染色体结构进行研究。

对二氯苯和8—羟基喹啉对不同的植物效果也不相同。植物染色体数目多，个体小的适合于使用对二氯苯；而染色体中等长度的更适合于8—羟基喹啉，同时能使缢痕区更为清晰。

4 固定

固定是指用化学药剂将细胞迅速杀死的过程。固定的目的是为了把细胞生活状态的真实情况保存下来，避免在对细胞操作中使生活状态发生改变。植物常用的固定剂是Carnoy固定剂。Carnoy固定剂是用3份95％的乙醇和1份冰乙酸配制成的。这二种药品都具有迅速穿透细胞致细胞死亡的特点，但是乙醇是脱水剂，可使细胞脱水变形；冰乙酸又是一种膨胀剂，可使细胞膨胀改变生活状态，把这二种药品按照3：l配制使用，既可达到迅速杀死细胞又可保持细胞真实生活状态的目的。

固定的时间可根据被固定的材料大小而定，根尖组织固定4～24h可达到固定效果。固定时间过长，可去掉细胞中的一些脂肪油滴等，便于染色体观察。但是由于固定时间过长，材料易变脆、变硬，给实验操作带来一定困难。

5解离

解离的目的是将分生组织细胞之间的果胶质和纤维素等物质破坏掉，便于在制片过程中细胞容易散开。常用的解离方法有二种：

(1)酸解：将l mol／L HCl放在60℃恒温水浴锅中预热，当HCl温度达到60℃时，将根尖放入HCl溶液中。解离的时间要根据材料来确定。大蒜、洋葱是百合科植物，纤维素、果胶质的含量相对较低，解离时间约为4~5min。如果是禾本科植物的根尖，酸解时间要相对加长些。解离时要注意观察，如果解离时间过长，分生组织会与伸长区脱离，这时分生区已经被解离过软，很难操作，而且染色效果不好。

(2)酶解：酶解时根尖的伸长区要去掉，只留下分生区。酶的浓度以果胶酶和纤维素酶分别为2％～3％为宜，等量混合后使用。酶解时温度条件非常重要，温度与解离时间成反比，温度高，解离时间就短，但是温度不得超过45℃，否则酶会失去作用。

6水洗与低渗

解离后的材料要用清水或蒸溜水冲洗3～5次；酶解的材料洗后还要在水中浸泡10～15min。水洗的另一个作用是后低渗，对于压片有好处。水洗时一定要洗净，否则会影响染色效果。

7染色与压片

取根尖分生组织的1／3左右置于载片上，先用镊子或解剖针将分生组织碾碎，尽量铺开。然后，再滴上石炭酸品红染液，染色5 min左右；醋酸洋红或醋酸地衣红要染15～30 min。为了增强染色效果，可在酒精灯上加热几秒钟后继续染一段时间。压片时先盖上盖片，在没有用力压之前，先用手固定住盖片，用镊子尖在材料部位垂直轻敲几下之后，再用拇指用力按压盖片。

8镜检

压好的片子要先放在低倍镜下观察，寻找不同分裂时期的典型细胞分裂相，然后，再转换成高倍镜观察。注意观察细胞核内染色质与染色体结构的特点。选择典型的细胞分裂相绘图。

9永久装片的制作

将制作好的片子放在冻片机上或液氮容器中将片子冻透，之后迅速用双面刀片将盖片揭开。空气干燥后，用二甲苯透明，再用中性树胶或加拿大树胶封片。冻片子时至冻透为止，切不可时间过长，否则细胞会冻裂。封片时要注意胶量不宜过多，树胶既能达到盖片的边缘又没有多余是最适量的。

思考题

参照显微镜的观察结果，绘制一套较为完整的植物根尖细胞有丝分裂过程的示意图。

实验1.2 玉米细胞减数分裂过程的制片与观察

目的要求

1 学习和掌握植物细胞减数分裂制片方法。

2了解植物生殖细胞的形成过程及减数分裂过程各期的细胞学特征。

实验原理

减数分裂是生物在形成配子时的一种特殊的分裂方式。减数分裂是在性母细胞中进行的。减数分裂的结果是使二倍染色体数减为单倍染色体数，以便两性配子结合时恢复形成二倍体生物。减数分裂的特点是性母细胞染色体只复制一次，然而连续进行两次细胞分裂（即减数第一次分裂和减数第二次分裂），结果一个小孢子母细胞形成四个小孢子，每个细胞只含单倍数染色体，使原来细胞中的染色体数目减少一半。因此，将这种细胞分裂称为减数分裂。减数分裂的另一个特点是前期特别长，而且变化复杂，其中包括同源染色体联会、交换与分离等。

试剂和器材

1材料

玉米(Zea mays 染色体数目2n=20)

2试剂

95％乙醇、冰乙酸、硫酸高铁铵、苏木精。

3器材

酒精灯、镊子、解剖针、50mL烧杯、10mL烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸、量筒、显微镜。

操作方法

1取材

采集正处于减数分裂时期的玉米雄花，此时雄花序尚未抽出旗叶，约10 cm长左右。用手摸植株的上部(喇叭口下部)，有松软弹性感觉，便可将旗叶一起抽出，扒开旗叶，剥离出雄花序。取材的时间一般应在上午8:30～10 :30，下午2 :00～4:00为宜。取材时透过颖片可看到花药，如果发现花药是黄颜色的，说明减数分裂已经结束，取材已晚。

2固定

将采集来的玉米雄花序放入新配制的Carnoy固定液（3份95%乙醇 : 1份冰乙酸）中固定一周(中间换二次固定液)。

3保存

采集玉米雄花是有季节性和时间性的，因此每次要多采集一些，保存起来备用。固定好

的材料先用95％乙醇洗3次，然后转入70％乙醇中可长期保存。保存材料时要注意使用封口严密的容器，最好使用广口瓶，避免乙醇挥发。保存材料的乙醇每年要更换两次，以保证乙醇的浓度和材料的质量。

4花药剥离

每朵玉米雄性小花中的所有花药几乎都处于同一个减数分裂时期。不同小花花药之间可能处于不同的减数分裂时期。因此，在剥离花药时要尽可能地多剥离一些大小不等的花药，以保证能够在实验中观察到减数分裂各个不同时期的图象。剥离花药时要注意将小花颖片剥离干净，使用的镊子和解剖针不可刺破花药，否则花粉母细胞可能会从伤口处外流，影响实验效果。

5．媒染

剥离出来的花药放进4％硫酸高铁铵(铁矾)水溶液中进行媒染，媒染的时间需4~24h。媒染的目的是让花药中的花粉母细胞中浸入铁离子，这些铁离子可以和染色液发生反应，增强染色体的染色效果。

6水洗

媒染后的花药要经彻底水洗，洗净花药表面的铁离子，否则花药表面的铁离子会与染色液反应发生沉淀，影响染色效果。为了水洗彻底，可用尼龙网做一个小口袋，把花药装入口袋里，把口袋固定在水龙头上，流水冲洗5～10min。

7染色

将洗净的花药放入0. 5％的苏木精染色液中染色4~24h。为了增强染色效果，可以在25～30℃的温箱里进行染色。若染色时间不足，染色液就很难通过花药壁细胞而进入花粉母细胞中，影响观察效果。

8水洗

染色后的花药还须清水冲洗，主要是洗净花药表面的染料。

9压片

用解剖针和镊子截取1/2枚花药置于载玻片上，然后滴上一滴45％冰乙酸，并在酒精灯上加热3～5秒钟，注意切不可将冰乙酸加热至沸腾。45％冰乙酸的作用是软化花药壁细胞，使花药壁破裂。另一个作用是使细胞质褪色，起到细胞质与染色体分色的作用。如果加热时间过长，也会把染色体上的颜色全部褪掉。因此，45％冰乙酸也是一种褪色剂。

材料加热之后，盖上盖片，用吸水纸折叠二层覆盖在盖片之上，用以吸收多余的醋酸，然后，在盖有花药的部位用镊子垂直轻轻敲打，使花药内的花粉母细胞扩散出来，肉眼观察到花药周边有很多云雾状细小颗粒即可。最后，在材料部位用大拇指用力垂直按压，将载片盖片之间压实。

10镜检

显微镜下的细胞群中既有花粉母细胞，也有花药壁细胞。而且花药壁细胞中的绒毡层细胞也在进行有丝分裂。因此，在观察时要首先区分花粉母细胞和花药壁细胞。花粉母细胞呈圆形，个体较大；花药壁细胞是长方形，个体较小。一个花粉母细胞可相当于4～5个花药壁细胞的体积。另外，多核细胞是绒毡层细胞。

实验观察结果

由于同一枚花药中花粉母细胞减数分裂具有同步分裂这一特点，所以在每枚花药中一般只能看到减数分裂中的一个期。减数第一次分裂时间相对较长、且复杂，前期I中就有五个期：

细线期：染色体呈非常细长的线状交织成网，好似毛线团状。与其紧密相连的是一个看似十分圆滑的原球体，即核仁。此时，虽然染色体都经过了复制后，都含有二个染色单体，但是在显微镜下仍看不到这种结构。

偶线期：染色体进一步螺旋化进入偶线期。这时同源染色体之间开始准确地识别、配对，这一过程称为同源染色体的联会。这时在显微镜下看到个别染色体的某一点或端部具有双重结构或染色体配对的双股结构。

粗线期：染色体进一步螺旋化、缩短变粗。由于同源染色体的联会，玉米的染色体数目由原来的20条染色体变成10个二价体。联会也为非姊妹染色体之间交换提供了条件，通过交换可发生遗传物质的相互转移和基因重组。另外，在玉米的某些染色体上存在着若干个深染的颗粒结构，这些颗粒叫染色体结，是玉米粗线期的特有特征。

双线期：进入双线期以后，联会的同源染色体开始分离。由于配对的二价体在长轴上有一点或几点结合着，而使二价体没有完全分离。这种结合的部位称为交叉，它代表着同源染色体间可能发生交换的位点。

终变期：染色体高度浓缩使染色体变得更短更粗。具有交叉的染色体上的交叉位点也随之向染色体的末端移动，使带有中部、亚中部和近端部着丝点的染色体形成了“O”形或“V”字形，这一现象叫做端化。终变期也是检查染色体数目的最好时期之一，这时细胞核内有多少个二价体，说明该生物就有多少对同源染色体。另外，在玉米减数分裂的终变期，每个细胞核内总有一个染色体与核仁紧密相连，这是第6号染色体，也是核仁组织者染色体。

减数第一次分裂的中期，端化的同源染色体排列在赤道面处。同源染色体的两个着丝点彼此相对分布在赤道面两侧。此时，核仁、核膜也已消失，纺锤体形成。

进入后期时，二价体的二个同源染色体彼此分开，在纺锤体的作用下，染色体开始向两极移动。由于染色体向两极移动时，是以着丝点为先导的，具有两个染色体比、开始解螺旋。

末期的染色体由于不断解螺旋而变成了染色质状态。核仁核膜重新出现，形成二个子核，每个子核的染色体数目减半为n，即为单倍染色体数，但每条染色体由两个姊妹染色单体所组成。紧接着是细胞质也分裂，便形成了两个子细胞。但这两个子细胞并不分开，一起进入减数第二次分裂，这两个细胞又叫二分体。

减数第二次分裂是实质上的一次典型的有丝分裂。通过这次有丝分裂，姊妹染色单体分离，细胞质再次分裂，由原来的二分体（两个细胞）变成了四分体（四个细胞）。四分体中的每一个细胞都含有单倍染色体数。但是每个细胞尚不具有授精能力。它还需要通过植物雄配子体的过程，发育成小孢子，才能产生能够授精的细胞，即成熟的花粉粒。

思考题

1参照显微镜的观察结果，绘制一套玉米减数分裂过程的示意图。

2 简述减数分裂各个时期的特点和意义。

实验2 染色体制备与染色体组型分析

实验2.1 小白鼠骨髓染色体制备及观察

目的要求

1掌握动物骨髓细胞染色体制备技术。

2学会动物细胞的滴片方法。

3观察小白鼠染色体的形态特征和染色体数目。

实验原理

小鼠骨髓细胞具有旺盛的分裂增繁能力。如果把秋水仙素溶液注射小鼠体内，则可破坏骨髓细胞分裂过程中纺锤体的形成，把分裂细胞阻截在中期。通过对小鼠骨髓细胞的低渗、固定、滴片、染色等处理，可观察到小鼠染色体。这种骨髓染色体制片方法简单，取材容易，不需无菌条件，方便易行。

试剂和器材

l材料

健康小白鼠 (Mus musculus 2n=40)，体重约18～20g，雌雄不限。

2试剂

甲醇、冰乙酸、石炭酸品红、秋水仙素、KCl、生理盐水。

3器材

恒温培养箱、普通离心机、显微镜、分析天平、架盘天平、离心管(5～10 mL)、吸管注射器(5 mL)、100 mL烧杯、载玻片。

操作方法

l药品的配制

(1)0.01％秋水仙素：称10 mg秋水仙素，溶于100 mL生理盐水中。

(2)低渗溶液：称5.59克KCl溶于1,000 mL蒸馏水中，其浓度为0.075 mL／L。

(3)生理盐水：8.5g NaCl溶于1,000 mL蒸馏水中，浓度为0.85％。

2秋水仙素注射

解剖前2 h，向小鼠腹腔内注射秋水仙素溶液0.5 mL。秋水仙素的作用是破坏骨髓细胞分裂中纺锤体的形成，积累细胞中期分裂相。

3解剖小鼠

秋水仙素注射2h后，将小鼠脱臼处死，取出股骨胫骨，剔净肉，再用纱布块将剩余的肉拧下来，用剪刀剪去骨两端，把注射器针头插入骨腔中，用生理盐水将骨髓细胞冲入离心管中，要反复冲几次尽可能收集更多的细胞。

4离心

离心管配平以后，以800～1,000 r／min离心7 min收集细胞。

5低渗

离心之后，去掉上清液，轻轻敲打离心管底部，加入5 mL低渗液，让细胞与低渗液充分混匀，达到最佳低渗效果。低渗的目的是为了在滴片时细胞容易破裂，便千染色体散开。低渗需要在37 ℃条件下进行，低渗时间为20 min。低渗之后再离心一次，方法同前。

6固定

离心后去掉上清液。轻轻敲打离心管底部使离心作用粘在一起的细胞松动开，加入固定液时要有冲力，将细胞迅速冲开，以防止把细胞固定成团块。在室温条件下,细胞需固定15min.，固定后还需离心一次。

7按照6的方法再进行第二次固定。

8制备细胞悬浮液

第二次固定离心后去掉上清液，加入少量固定液制成细胞悬浮液。细胞悬浮液不能太浓，细胞密度过大，细胞重叠，影响观察。细胞悬浮液的密度也不能太稀、细胞太少，这样会影响观察时速度。

9滴片

把细胞悬浮液滴在预先冰水浴的载片上，每张载片滴2滴细胞悬浮液，分别滴在载片的1／3处和2／3处。滴完之后，用嘴用力吹散细胞。冰水片子的作用是细胞受温差作用

容易破裂。为了让细胞破裂、分散得更好，滴片时，滴管与载片之间保持一定距离，让细胞

“摔”破。

10空气干燥

滴片之后，一定让片子自然干燥后才能染色，否则细胞和染色体会飘浮在染液面上，水洗时被冲掉，影响实验效果。

11染色

彻底干燥之后的片子可以放置在染色缸内或染色板上染色，也可以把染液直接滴在载片上。由于整个载片表面都有细胞，所以，染色液要铺满载片。染色时每张载片滴二滴染液。然后，用玻棒再铺展均匀。注意，玻棒与载片之间不能有接触和磨擦，玻棒始终浮在染液表面，以保证细胞和染色体的完整性。

12水洗

染色之后，流水冲洗载片背面，让多余的水分从边缘把染料带走。冲洗后，马上把片子再翻过来，将有细胞的一面朝上放置。

13显微镜观察结果

显微镜观察可采用“弓”字形搜寻的观察方法，保证观察时不漏掉每一个细胞。另外，要熟练地使用推进器的座标尺，记录良好细胞分裂相的位置，以便最后比较观察和分析。

小鼠染色体为2n=40，所有染色体全部为端着丝点。秋水仙素的浓度，注射量和作用时间对小鼠染色体形态影响很大。如果秋水仙素浓度高、剂量大时，小鼠染色体短粗，进行组型分析会有一定困难。秋水仙素作用时间长时，小鼠染色体多是晚中期。

思考题

1绘制小鼠骨髓细胞染色体图。

2如果有条件时，要进行显微摄影，然后进行组型分析。

实验2.2 人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法

目的要求

1学习人体细胞离体培养的方法。

2掌握制作人染色体标本的方法。

3观察人类染色体的形态和染色体数目。

实验原理

正常情况下人的外周血中很少有分裂相细胞，只有在异常的情况下才能出现。上个世纪60年代Moorhead等人建立了人体外周血白细胞培养技术，在医学、病毒学、药理学、遗传学得到广泛应用。目前，经过实验技术的改进，仅用0.3～0.5 mL全血就能做一次实验。

外周血液中的小淋巴细胞几乎都处于G l期或G0期，PHA(植物血球凝集素)能有效地促进小淋巴细胞转化成为淋巴母细胞而进入有丝分裂。将细胞在体外培养3天之后，经过用秋水仙素处理，低渗、固定和离心等操作之后,即可制成人类染色体标本玻片.通过显微镜可以对人的染色体形态和染色体数目进行观察和分析。结合临床医学上的病例还能进行染色体畸变遗传病的鉴定。

试剂和器材

1材料

人的肘静脉外周血。

2试剂

M199或RPMI l640培养液、胎牛血清、肝素、PHA、青霉素、链霉索、5％NaHCO3、碘酒、75％乙醇、秋水仙素、生理盐水、甲醇、冰乙敢、石碳酸品红、KCl低渗液等。

3器材

恒温培养箱、电冰箱、高压灭菌锅、离心机、真空泵、分析天平、显微镜、超净工作台、注射器、离心管、培养瓶、试管架、量桶、烧杯、酒精灯、抽滤瓶、G6型号细菌过滤漏斗。

操作方法

1药品器皿的无菌处理

(1) 实验用的所有器皿、器具都必须按规定洗净，高压灭菌处理备用。

(2) 实验用全部药品都要经高压灭菌或过滤除菌处理。具有生物活性的药品要经G6型号细菌过滤漏斗抽滤除菌，其它药品可经过高压灭菌。

2各种药品及培养基的配制

(1) M199基础培养基的配制称取M199 培养粉 9.8g溶于1,000 mL双蒸水中，经G6型号细菌过滤漏斗抽滤后备用。使用前最好做热源培养以确保实验顺利进行。

(2) 5％ NaHCO3的配制称取5g NaHCO3，溶于100mL蒸馏水中，高压灭菌备用。

(3) 生理盐水的配制称取0.85g NaCl 溶于l00mL蒸馏水中高压灭菌备用。

(4) PHA(植物血球凝集素)的配制称取PHA 50mg配制成浓度为lmg／mL (生理盐水配制)的溶液。由于PHA使用量较少，配制时使用注射器式无菌过滤器，以减少药品损失。

(5) 肝素溶液的配制用生理盐水按效价单位配成500单位／mL，高压灭菌后备用。

(6) 双抗溶液的配制将青、链霉素用生理盐水按效价单位配成l0万单位／mL，配制过程要求使用注射器式无菌过滤器。

(7) 秋水仙素溶液的配制用生理盐水配制成浓度为40微克／mL) 秋水仙素溶液，使用注射器式无菌过滤器进行除菌操作。

(8) 低渗液溶液的配制称取5.59g KCl溶于1,000mL双蒸馏水中，配制成溶液浓度为0.075 M 的低渗液溶液。

(9) 细胞培养基的配制在每个培养瓶中假如M199 基础培养基 4mL，小牛血清l mL，肝素3滴，PHA 0.3 mL, 加入双抗至最终浓度为 100单位／mL，NaHCO3调pH至7. 2～7. 4。

3接种全血

用无菌注射器从肘静脉抽取适量人的外周血，应由专业护士操作。在无菌条件下，向每瓶培养液内加入全血0.3mL即可。

4血细胞培养

将细胞培养瓶放在37℃±0.5的恒温培养箱中培养，每天至少摇动培养瓶一次，以保证培养液通气。

5秋水仙素处理

细胞培养至68h，向培养瓶中注入秋水仙素0.05～0.1 mL，使最终浓度为0.4～0.8ug ／mL，继续培养2~4 h。

6低渗处理

细胞培养至72h后，小心地从培养箱中取出培养瓶，轻轻地打开瓶塞，切记不要震荡,避免沉淀的细胞悬浮起来,不利于实验操作。然后用吸管弃去上清液，再加入经37℃培养箱预温的低渗液5mL，盖上瓶塞，轻轻摇动让细胞悬浮起来与低渗液充分混匀。再放回37℃温箱中，保温低渗20min。

7收集细胞

把低渗后的细胞悬液全部移入离心管中，以1,000转／分速度离心7min。

8固定

离心后弃去上清液，轻轻敲打离心管底部以便让沉淀细胞松动开，再加入新配制的5mL 固定液。加固定液时要有冲力，靠冲力把细胞冲散，以防细胞固定成团块。室温下固定15min 以后，再离心。

9重复固定

去掉清液后，再重复做8的过程。

10滴片

弃掉上清液之后，根据离心管壁回留量与沉淀细胞量的多少，再加入少量（约0.2～0.3 mL）固定液制成细胞悬浮液。然后，将2-4滴细胞悬浮液均匀地滴在冰水预冷的载片上。为了便于细胞分散和破裂，滴片时应使滴管与载玻片之间保持一定距离，大约20-30 cm为宜。最后，空气干燥。

11染色

在干燥后的载片上，滴加2滴石炭酸品红。用玻棒将染色液展匀，染色5 min之后，自来水冲洗载片的背面（以防冲走细胞），洗去多余染色液，晾干。

12显微镜观察

载片晾干以后，先用低倍镜观察，找到分散好的细胞相后灾转至高倍镜下观察。观察时要使用推进器座标尺记录分散良好的细胞位置，便于重新查找。

13实验结果

人的染色体2n=46，其中22对常染色体，一对性染色体。男性是XY、女性是XX。按照染色体个体大小和着丝点位置，人们将46条染色体分为A、B、C、D、E、F和G等 7个组，各组别中染色体的特征参见表1。

表1 人染色体组型及其特征

思考题

1试绘制人类细胞的染色体图相。

2 比较人与小鼠染色体的形态差别。

实验2.3 生物染色体组（核）型分析

目的要求

掌握染色体组型分析的基本方法。

实验原理

染色体组型通常是指生物体细胞所有可测定的染色体表型特征总称，包括染色体的总数、染色体组的数目、组内染色体基数、每条染色体的形态、长度、着丝点位置、随体或次缢痕等。染色体组型是物种特有的染色体信息之一，具有很高的稳定性和再现性。染色体组型分析不仅能对细胞内的染色体进行分组，还能对每条染色体的特征进行定量和定性的描述，是研究染色体的基本手段之一。利用这一方法可以鉴别出染色体结构变异，染色体数目变异，B 染色体及真假杂种等。同时，这也是研究物种的起源、生物的遗传与进化、细胞遗传学和现代分类学的重要手段之一。

材料和器材

1材料

可以用不同生物为分析对象，如大蒜(Allium sativum)、洋葱 (Allium cepa )、蚕豆 (Viola faba)、大麦 (Hordenm spp )、人等，选择各自10个以上染色体分散相好、染色体个体相对较长的细胞，经图象采集、放大、打印后，对其进行分析。

2器材

显微镜、测微尺、毫米尺、镊子、剪刀、绘图纸、计算器。

操作方法

1染色体制片（略）。

2 制备显微摄影的放大图像

将选定的染色体图象进行拍摄和打印输出。

3染色体测量

参照测微尺的放大倍数，对输出图像中的染色体进行实际测量，获取每条染色体各臂的长度数据，测算染色体长度和臂比率，求出着丝粒在染色体上的位置、染色体臂比值、着丝粒位置与染色体类型（参见表2）。

臂比率

（p）（q）

短臂长度长臂长度臂比率=

1.01~1.70

中部着丝点区 m 1.71~3.0

亚中部着丝点区 sm 3.01~7.00

亚端部着丝点区 st 7.01~∞

端部着丝点区 t ∞

端部着丝点 T

着丝粒指数

100?=该染色体的长度

短臂长度着丝粒指数 总染色体长度

细胞单倍染色体总长度，包括性染色体在内。

相对长度

求出每条染色体占总染色体的长度。

相对长度=100 总染色体长度

每一条染色体的长度 4列表

将以上测量项目列表，并将测量结果填入表3中。

5染色体配对

根据测量数据进行同源染色体剪贴配对。

6排列染色体组型图

把染色体对从大到小、短臂在上、长臂在下，各染色体的着丝点排列在一条直线上。 7翻拍或绘图

完成上述步骤的染色体剪贴，可以通过翻拍摄影或描图成为染色体组型图。

8核型的描述公式

结合核型分析的结果，用公式的形式加以表示，既简明扼要又利于记忆和比较。以海岛棉（Gossypium barbadensc ）为例，其核型可写成：2n=4x=52=38m+12sm(2SAT)+2st(SAT) 9核型的综合描述

说明分析对象的染色体数目，所含染色体组的数目及来源（同源或异源），每个染色体组的基数，染色体大小和核型。

思考题

分析某一种生物的染色体组型，包括文字和图片的综合分析结果。

实验3 染色体畸变观察

实验3.1 果蝇唾腺染色体制片与染色体畸变观察

目的要求

1练习解剖果蝇幼虫和分离果蝇唾腺的方法。

2掌握唾腺染色体的制片技术。

3了解唾腺染色体的结构及其变异特点。

实验原理

果蝇唾腺染色体是永久性间期染色体，由于间期染色体不螺旋化，而且DNA 不断地进行复制，细胞并不进行分裂，这样就使唾腺染色体变成了巨大染色体(多线染色体)。唾腺染色体可以比果蝇其它细胞染色体大几百倍。果蝇唾腺染色体能进行体细胞配对(拟联会)，配对时所有染色体的着丝点聚集在一起形成染色中心

，同源染色体的两条臂紧密配合自由伸展。因此，在唾腺细胞里，查不出2n的染色体数目，只能观察到从染色中心向空间伸展的染色体臂。与其它细胞染色体相比的另一个特点是，唾腺染色体上有深浅不同、宽窄不一的带纹。这些带纹的数目和位置是恒定的，代表着种的特征和一些基因的位置。由于这些带纹的存在，染色体上发生缺失、重复、倒位、易位等很容易在唾腺染色体上识别出来。

试剂和器材

1材料

果蝇 (Drosophila virili s 染色体数目2n=12) 三龄幼虫。

这种果蝇幼虫比黑腹果蝇(Drosophila melanogaster染色体数目2n=8)幼虫个体大，唾腺大、脂肪少，便于操作和观察。

2试剂

乙醚、丙酸、酵母粉、绵白糖、琼脂条、玉米粉、1mo1／L HC1、0. 85％NaC1、石炭酸品红、蒸馏水。

3器材

恒温培养箱、高压灭菌锅、显微镜、天平、培养瓶、棉花塞、滤纸片、载片、盖片、镊子、解剖针

操作方法

1三龄幼虫培养

实验前将果蝇（D．virilis），转接到新配制的培养基中，放在23～25℃的条件下饲养约10天左右。为了让果蝇幼虫长得肥大更便于操作，在实验前一天，将溶解好的酵母液添加在培养基里，添加前要先把培养瓶中的成虫转移掉。添加的数量因培养基的情况而定，一般约0. 5～l mL。

2解剖幼虫

取一洁净的载片，滴上2滴生理盐水。在瓶壁上挑选肥大，行动迟缓的三龄幼虫放在生理盐水中，这时生理盐水如果很混浊，要更换生理盐水或把幼虫转移到另一张载片上。唾腺位于幼虫头部两侧，长度约占身体总长1／3～1／4左右。解剖时要用解剖针压住头部，压住的地方越小越好。用镊子夹住幼虫身体后2／3部分，将幼虫在身体前端拉开。

唾腺是半透明的囊状物，会飘浮在生理盐水里，无沦怎样触动都不发生形状改变。唾腺找到以后，用解剖针将唾腺与其它组织分开，只留唾腺在载片上。在显微镜下观察，唾腺仍呈半透明状态，由单层细胞构成，细胞形状不规则，细胞轮廓清晰，细胞大，细胞核也大，甚至可以看清楚细胞核是由染色体卷缩在一起形成的，一个唾腺约几十个细胞构成。

3解离

用滤纸条吸净唾腺周围的其它物质，然后在唾腺上滴上1mol／L HC1解离2～3min，以解除细胞间联系，便于染色体散开。

4水洗

解离后的唾腺用蒸馏水洗3~4次，水洗时要注意不要把唾腺弄丢，水洗要彻底，否则影响染色效果。另外，水洗过程也是细胞低渗过程。

5染色压片

水洗后的唾腺周围要用滤纸条清理干净，然后在唾腺上滴上一滴石炭酸品红，染色5min 后盖上盖片，先用滤纸吸去盖片周围溢出的染液，最后在有材料的位点上用力压实。

6显微镜观察

先用低倍镜观察，发现分散好的染色体图像后再转换至高倍镜观察。

果蝇(D. virilis)的体细胞染色体数2n=12，全部为端部着丝点。其中有5对染色体臂较长，一对染色体臂很小是点状染色体。唾腺染色体是5条长臂，点状染色体附着在染色中心附近。另外，在染色体臂上有明显深浅不同、宽窄不一的带纹。在染色体臂的不同部位有时会出现疏松区(胀泡)，这是转录活性区。

我院遗传学实验室饲养的果蝇(D. virilis)唾腺染色体中，常见某一条染色体局部区域出现不联会的分叉或分枝现象，该区域的带纹彼此间也存在明显差异。这表明，这对同源染色体之间存在着遗传上的差异。关于这种差异产生的畸变原因是否与某种环境因素有关，目前尚不清楚。

思考题

1认识唾腺染色体的结构特点，绘制唾腺染色体变异结构图像。

2讨论染色体结构变异的类型及其特点。

实验3.2 紫萼玉簪染色体结构变异的显微镜观察

目的要求

1进一步掌握染色体结构变异的特点及细胞学特征。

2了解染色体结构变异在遗传上的意义。

实验原理

染色体结构变异是自然界中存在的一种生物进化和新物种形成的重要因素之一。染色体结构变异主要有缺失、重复、倒位、易位四种。其中易位是最容易发生的一种染色体结构变异，也是自然界中存在的最广泛的一种结构变异。不同的染色体结构变异具有各自不同的特殊表型。臂内倒位杂合体在倒位圈内发生交换后形成一条具有双着丝粒染色体和一个无着丝粒的染色体片段。在减数分裂后期I，同源染色体由纺锤体拉向两极时形成染色体桥和落后的断片。染色体断裂之后，不论是有着丝点的缺失染色体还是无着丝粒的断片，都可能形成微核，尤其是无着丝粒的染色体片段最终都可能形成微核。有时可以利用对微核测试方法检测环境污染等因素对染色体畸变的影响。染色体的变异现象越丰富，说明诱变因素的作用越大。

试剂和器材

1材料

紫萼玉簪花蕾(东北师大校园内栽培种)。

紫萼玉簪花染色体数目多，个体差异大。由于染色体数目和结构有严重的变异，不能产生有效配子，因而导致有性生殖率极低，几乎不产生种子或只产生少数败育的种子，繁殖方式主要依赖分根法进行无性繁殖。这种紫萼玉簪是一份天然的、不需人工诱导即可观察染色体结构变异的好材料。

2试剂

乙醇、冰乙酸、硫酸铁铵、苏木精。

3器材

广口瓶、酒精灯、镊子、载片、盖片、吸水纸、解剖针、小烧杯、表玻皿。

操作方法

1取材

东北师大校园内栽培的紫萼玉簪花开花的时间是每年夏天的7月上旬，取正处于减数

分裂时期尚未开花的花蕾，取材的时间一般在上午8～9点，下午2～3点为宜。