生化检测实验剖析

生化检测实验讲义

实验一粮食、油料检验-脂肪酸值测定法

一、实验目的

粮食在储藏过程中受到温度、水分和酶的影响，其脂类物质易发生水解和氧化反应。水解造成粮食游离脂肪酸含量增加，对粮食的种用品质和食用品质产生不良影响。粮食游离脂肪酸含量以脂肪酸值表示,即中和100g粮食试样中的游离脂肪酸值所需氢氧化钾的毫克数。通过脂肪酸值的测定，可以判断粮食品质的变化情况，推测储藏方法是否适当。

通过本实验要求掌握测定脂肪酸值的技术。

二、原理

浸出法。脂肪酸能溶于有机溶剂，利用苯来浸出脂肪酸，然后在酒精溶液中用标准KOH溶液中和脂肪酸，根据滴定时所消耗的碱液数量，就可求出脂肪酸值。

三、材料、仪器和试剂

1、材料

大米

2、仪器

带塞锥形瓶，量筒，移液管，微量滴定管，表面皿，天平，振荡器，漏斗

3、试剂

（1）、0.01N KOH（或NaOH）乙醇(95%)溶液

先配制约0.5N的KOH水溶液，再取20 ml,用95%乙醇稀释至500mL

（2）、苯，95%乙醇

（3）、0.04%酚酞乙醇溶液

0.2g酚酞溶于500ml 95%乙醇溶液中。

四、操作方法

1、浸出

称取事先磨细的大米粉20±O.Olg于200ml或250ml锥形瓶中，加入50ml苯，加塞摇动几秒钟后，打开塞子放气，再盖紧瓶塞置振荡器振荡30min(或用手振荡45min)，取出，将瓶倾斜静置数分钟，使滤液澄清。

注：粉碎后样品如在20℃以上室温放置，脂肪酸值会很快增加，因此，必须及时进行测定。

2、过滤

用快速滤纸过滤，弃去最初几滴滤液后用量筒收集滤液25ml。

3、滴定

将25ml滤液移入锥形瓶中，再用原量筒取25m1 0.04%酚酞乙醇溶液加入锥形瓶中，立即用氢氧化钾乙醇溶液滴定至呈现微红色半分钟内不消失为止。记下所耗用氢氧化钾乙醇溶液毫升数V1。

4、空白试验

取25m1 0.04%酚酞乙醇溶液，用氢氧化钾乙醇溶液滴定，记下耗用氢氧化钾乙醇溶液毫升数V2。

五、结果计算

脂肪酸值以中和100g大米样品中游离脂肪酸所需氢氧化钾毫克数表示。

脂肪酸值=（V1-V2）×N×56.1×50/25×100/W（1-M）

V1：滴定样品所用的氢氧化钾乙醇溶液体积，ml，

V2：滴定25ml酚酞乙醇溶液所用氢氧化钾乙醇溶液的体积，ml,

50：浸泡样品用苯的体积，ml，

25：用于滴定的滤液体积，ml,

N：氢氧化钾(或氢氧化钠)乙醇溶液的当量浓度，

56.1：氢氧化钾毫克当量，

W：样品重量，

M：样品水分百分率，%

100：换算为100g试样重量。

注:浸出液颜色过深，滴定终点不好观察时，改用四折滤纸，在滤纸锥头内放入约0.5g粉末活性碳，慢慢注入浸出液，边脱色边过滤。

六、思考题

1、粮食脂肪酸值测定的意义？

实验二邻甲苯胺法测定血糖浓度

一、实验目的

1、掌握邻甲苯胺血糖测定法的基本原理及操作方法。

2、了解邻甲苯胺血糖测定法的临床意义及应用。

二、原理

血浆样品中的葡萄糖在酸性环境中与邻甲苯胺共热时，葡萄糖脱水转化为5-羟甲基α-呋喃甲醛，后者与邻甲苯胺结合为蓝绿色的醛亚胺（Schiff硷）。血清中的蛋白质则溶解在冰醋酸和硼酸中不发生混浊。将标准葡萄糖溶液与样品按相同方法处理，在680nm波长处比色，即可测得样品中葡萄糖含量。

三、材料、仪器和试剂

1、实验材料：新鲜血浆

2、仪器

722型分光光度计，水浴锅，试管

3、试剂

⑴、邻甲苯胺试剂

称取硫脲2.5g，溶于冰醋酸750ml中。将此溶液转入1L容量瓶内，加邻甲苯胺150ml，2.4％硼酸溶液100ml,再加冰醋酸至1L刻度，置棕色瓶中，至少可应用2个月。

⑵、葡萄糖贮存标准液（100mg/ml）

将少量无水葡萄糖置于硫酸干燥器内一夜。精确称取此葡萄糖1.000g，以饱和苯甲酸溶液溶解并转移入100ml容量瓶内，再以饱和苯甲酸溶液稀释至100ml刻度。置冰箱中可长期保存。

⑶、葡萄糖标准液（1.5mg/ml）

在100ml容量瓶内，加入葡萄糖贮存标准液15.0ml，用饱和苯甲酸溶液稀释至100ml刻度，混和。

⑷、12mmol/L苯甲酸溶液

称取苯甲酸1.4g，加入蒸馏水900ml,加热助溶，冷却后加蒸馏水至1000ml。

四、实验操作

1、采得待测血样（抗凝）后立即离心以分离血浆（3,000转离心15分钟）。

2、取干燥试管3支，分别标出号码，按下表添加试剂。

邻甲苯胺法测血糖操作表

管别

测定管标准管空白管试剂(ml)

血清（浆）0.20ml ────

葡萄糖标准液──0.20ml ──

蒸馏水────0.20ml

邻甲苯胺试剂 6.0ml 6.0ml 6.0ml

3、混匀各管内容物置沸水浴中加热15分钟后取出用流水冷却。

4、以空白管校正零点，读取各管680nm处吸光度值。

五、结果计算

六、思考题

1、如何获得血浆？血浆的主要成分是什么？

血液由细胞部分和非细胞部分组成。细胞部分（占45％）有红细胞、白细胞、血小板；非细胞部分（占55％）是血浆，血浆的主要成分是水、蛋白质、糖类、脂类、激素、无机盐等。离开血管的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，可获得不含细胞成分的液体，即血浆。

2、测定血糖时为什么要在空腹状态下取血？

3、试讨论血糖测定的临床意义及应用？

附：注意事项

1、本法不需要除去蛋白质，邻甲苯胺试剂只与糖醛起反应，不与血中其他还原物质起反应。

2、显色反应与水的含量有关，故应使标准管和测定管的含水量一致。

3、温度对显色反应有明显影响，煮沸时间和温度应准确控制。

4、显色后颜色不稳定，室温每放置1分钟，颜色降低0.15％。

5、邻甲苯胺试剂中冰醋酸浓度很高，使用不当容易损坏比色仪器。

6、邻甲苯胺是致癌剂，测定过程中应小心使用。

实验三不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶

一、目的

掌握不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的基本原理和操作方法，同时对同工酶有一个感性的认识。

二、原理

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是指使用不同凝胶孔径和不同缓冲系统的电泳。系统的不连续性体现在：

1、凝胶板的不连续性

凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

2、缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同

样品缓冲液（pH6.7的Tris-HC1），浓缩胶缓冲液（pH6.7的Tris-HC1），分离胶缓冲液（pH8.9的Tris-HC1）和电极缓冲液（pH8.3的Tris-甘氨酸）

3、电位梯度的不连续性

在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。

（1）、样品的浓缩效应

浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。

在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。待分离的蛋白质样品加在样品槽中，浸在pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。在pH6.7条件下，甘氨酸（pI=6.0）很少解离，其有效泳动率很低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。带负电荷的蛋白质，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。

由于快离子快速向前移动，在快离子的后边形成一个离子浓度低的区域即低电导区。因为电位梯度V、电流强度I和电导率S之间有如下关系：V=I/S。所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于蛋白质和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。当快离子和慢离子的移动速度相等时，则快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳板移动的界面。也就是说在高电位梯度区和低电位梯度区之间的地方形成一个迅速移动的界面，由于蛋白质样品的有效迁移率恰好介于快慢离子之间，因此也就聚焦在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层。由于两层凝胶孔径不同，蛋白质向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢,使得在该界面处的待分离蛋白质区带变窄，浓度升高。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种蛋白质又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被初步分离，形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”。

当蛋白质和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大，使它越过蛋白质并直接在Cl-后移动。不连续的高电位梯度不再存在。于是，此后的电泳过程

中，蛋白质分子在均一的电压梯度和pH值中泳动，并根据其固有的带电性和分子大小进行分离。与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。

由于电泳基质的四个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。

（2）、分子筛效应

分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同

的迁移率。

（3）、电荷效应

每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。

本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。

三、材料、仪器和试剂

1、实验材料

小麦幼苗

2、仪器

（1）垂直板电泳槽及附件（玻璃板、硅胶条、梳子、导线等）

（2）稳压稳流直流电泳仪

（3）高速离心机（10,000r/min）

（4）量筒：500mL×1，10mL×1，5mL×1

（5）烧杯：250mL×4

（6）微量注射器（50μL）

（7）其他：玻棒、大培养皿等

3、试剂

序号试剂名称配制方法

1 1.5％琼脂 1.5g琼脂，100mL pH8.9分离胶缓冲液浸泡，用前加热溶化。

2分离胶缓冲液，pH8.9

(pH8.9 Tris-HCl缓冲液)

取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用无离子水溶解后定容至100 mL。

3浓缩胶缓冲液，pH6.7

(pH6.7 Tris-HCl缓冲液)

取48 mL 1 mol/L HCl，Tris 5.98g，用无离子水溶解后定容至100 mL。

4分离胶丙胶贮液

(Acr-Bis贮液Ⅱ)Acr 28.0g，Bis 0.735g，用无离子水溶解后定容至100 mL，过滤除去不溶物，装入棕色试剂瓶，4℃保存。

5浓缩胶丙胶贮液

(Acr-Bis贮液Ⅰ)Acr 10g，Bis 2.5g，用无离子水溶解后定容至100 mL，过滤除去不溶物，装入棕色试剂瓶，4℃保存。

610％过硫酸铵溶液（Ap）10g过硫酸铵溶于100 mL无离子水中(当天配制)。7四甲基乙二胺（TEMED）原液。

8核黄素溶液核黄素4.0mg，无离子水溶解后定容至100mL。

9电极缓冲液，pH8.3

(pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液)Tris 6 g，甘氨酸28.8 g，溶于无离子水后定容至1 000 mL，用时稀释10倍。

1040％蔗糖溶液蔗糖40 g，溶于100 mL无离子水中。

11pH4.7乙酸缓冲液乙酸钠70.52 g，溶于500 mL蒸馏水中再加36 mL冰乙酸，蒸馏水定

容至1 000 mL。

127％乙酸溶液19.4 mL 36％乙酸稀释至100 mL。

13样品提取液，pH8.0

(pH8.0 Tris-HCl缓冲液)

Tris 12.1 g，加无离子水1 000 mL，以HCl调节pH至8.0

140.5％溴酚蓝溶液0.5 g溴酚蓝溶于100 mL无离子水中。

15联大茴香胺染色液联大茴香胺250 mg溶于140 mL 95％乙醇中，加20 mL蒸馏水，使用

前加3％H2O2 5 mL（当天配制）

四、实验步骤

1、夹心式垂直电泳槽的安装

（1）将电泳用的玻板，洗净烘干备用。

（2）将长短玻璃板分别插在凹形橡胶框中，安装成凝胶模具。切勿用手接触两玻璃板相对的内面。（3）将安装好的凝胶模具安放在储液槽之间，注意短玻璃板面对负极，插上固定螺丝将储液槽和凝胶模具固定好，固定螺丝在拧紧时应双手以对角线的方式旋紧螺丝。

（4）待电泳槽安装好后，用胶头滴管沿长玻璃板外侧面将琼脂灌入，将长玻璃板下部与胶框的缝隙密封，注意不要产生气泡。一旦用琼脂封板后，模具不应再挪动，以防产生裂缝在灌胶时发生泄漏。

2、凝胶的制备

将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液。

按下表比例配制分离胶

分离胶取样表

名称分离胶缓冲液分离胶丙胶贮液10%AP TEMED 无离子水

用量mL 3 6 0.03 0.06 15

加过硫酸铵前，溶液应抽气。

将分离胶沿长玻璃板加入胶室内，小心不要产生气泡，加至距短玻璃板顶端3cm处，立即覆盖2～3mm的水层，静置待聚合（约40min），当胶与水层的界面重新出现时表明胶已聚合。

按下表比例配制浓缩胶

浓缩胶取样表

名称浓缩胶缓冲液浓缩胶丙胶贮液TEMED 核黄素溶液蔗糖

用量mL 1 2 0.03 1 4

用滤纸小心吸去表面的水层，切勿破坏胶面的完整性。立即加入浓缩胶，插入梳子（即样品槽模板），待胶凝后，小心取出梳子。将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，前槽（短板侧）缓冲液要求没过样品槽，后槽（长板侧）缓冲液要求没过电极。

3、样品的制备

称取小麦幼苗茎部0.5 g，放入研钵内，加pH 8.0提取液1 mL，于冰水浴中研成匀浆，然后以2 mL提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8 000r/min离心10min，倒出上清液，以等量40％蔗糖及1/5体积溴酚蓝指示剂混和，留作点样用。

4、点样

用微量注射器吸取少量样液，在浓缩胶上层点样，每个点样槽15-50μL。点样时须小心，防止样品液的扩散。

5、电泳

接好电源线，打开电源开关，调节电流到20mA左右，样品进入到分离胶后加大到30mA，维持恒流。待指示染料下行到距胶板末端1cm处，即可停止电泳。把调节旋扭调至零，关闭电源，电泳约3h。

6、剥胶

电泳结束后，取出电泳胶板，去掉胶套，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。去掉浓缩胶，用玻棒协助将分离胶放到盛有pH4.7的乙酸缓冲液的大培养皿中浸泡10min。

7、染色

倒去乙酸缓冲液，加联大茴香胺染色液，使淹没整个胶板，于室温下显色20min，即得到过氧化物酶同工酶的红褐色酶谱。

该酶活性染色过程如下：过氧化物酶分解H2O2产生氧基，后者使联大茴香胺发生反应生成褐色化合物。所以用染色液浸泡凝胶时，有过氧化物酶同工酶蛋白质条带的部位便出现褐色的谱带。

倒掉染色液，重新加入7％的乙酸溶液，于日光灯下观察记录酶谱，绘图或照相。

五、结果记录

绘制示意图，将样品的各个酶带如实地描绘下来，并计算各酶带的相对迁移率(R f)

Rf＝酶带迁移距离/前沿指示剂迁移距离

测量迁移率时，应以酶带的中部位置为准

六、思考题

1、浓缩胶中加入蔗糖的目的是什么？

2、分离胶分别在pH4.7的乙酸缓冲液和7％乙酸溶液中浸泡的目的是什么？

3、过氧化物同工酶染色的原理？

4、样品中加少许溴酚兰和一定浓度的蔗糖溶液的作用分别是什么？

实验四谷丙转氨酶活力测定

一、目的

1、了解血清谷丙转氨酶（ALT）活性测定的临床意义

2、掌握谷丙转氨酶活力的测定方法

二、原理

在氨基酸的分解代谢过程中，联合脱氨基是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与氧化脱氨基作用偶联完成。本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸作为谷丙转氨酶作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作为辅酶，在一定条件及时间作用后来测定所生成的丙酮酸的含量来确定其酶的活力。

丙酮酸能与2，4二硝基苯肼结合，生成丙酮酸-2，4二硝基苯腙，后者在碱性条件溶液中呈棕色，其最大吸收波长为505nm，可用于测定丙酮酸的含量。

α-酮戊二酸也能与2，4－M硝基苯肼结合生成相应的苯腙而干扰比色结果。但是：①后者在碱性溶液中的吸收光谱与丙酮酸二硝基苯腙有所不同，在505nm比色时，α-酮戊二酸二硝基苯踪的光吸收远较丙酮酸二硝基苯腙为低；②在反应后，a一酮戊二酸减少而丙酮酸增加，使干扰减少。

三、材料、仪器和试剂

1、材料

取空腹静脉血2ml，经离心分离得到血清，保存于冰箱中待用，因为血细胞中转氨酶活性较血清中高，故应防止溶血。若血清中此酶活性过高，则可适当稀释后再用。

2、仪器

试管，水浴锅，离心机、721型分光光度计

3、试剂

（1）、.0.1mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液

称取13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于蒸馏水中，定容到1000ml。加氯仿数滴，4℃保存。（2）、标准丙酮酸：2.0μmol/ml

取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为50ml。此液须当日用当日配。

（3）、ALT底物液

0.90g L-丙氨酸，29.2mg α-酮戊二酸，先溶于pH7.4 0.1M 的PBS中。然后用1 M NaOH调节pH到7.4，再用pH7.4 0.1M 的PBS定容到100ml，贮存于冰箱中，可使用1周。

（4）、2,4-二硝基苯肼溶液

取分析纯2,4二硝基苯肼19.8mg，用1mol /L HCl溶于100ml，置棕色瓶中保存。

（5）、0.4mol/L NaOH溶液

称取16g NaOH定容到1000ml

四、操作步骤

取干净试管12支，按下表所示操作：

五、结果计算

以每毫升血清在pH 7.4，37℃保温条件下与底物作用30min后，每生成2.5ug丙酮酸为1谷-丙转氨酶单位。计算样品血清中的转氨酶活力。

六、思考题

1、血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？

2、血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要避免溶血？