酶固定化技术及其应用

酶固定化技术及其应用

摘要：

酶因其优良的催化性能而被广泛应用，但游离酶应用过程中有许多缺点，固定

化酶技术因此而产生，并且迅速发展。本文主要介绍传统的固定化酶技术、新

型固定化酶技术、新型载体材料及固定化酶技术的应用。

关键词：酶固定化；载体；应用

The enzyme is widely applied because of its fine catalyzed performance, but

in the dissociation enzyme application process has many shortcomings, the

fossilization enzyme technology therefore produces, and develops rapidly.

This article main introduction traditional fossilization enzyme technology, new

fossilization enzyme technology, new carrier material and fossilization enzyme

technology application.

一、前言

酶的本质是一类具有催化功能的蛋白质，与化学催化剂相比具有反应速度快、反应条件温和、底物专一性强,可在水溶液和中性pH 下操作等优点。但其

高级结构对环境十分敏感，物理因素、化学因素和生物因素均可使没丧失活力。

而且，随着反应过程的进行，反应速率会下降。此外，游离酶在反应液中和产

物在一起，反应后酶不能回收重复利用，也使得产物的分离纯化更为复杂。以

上的这些因素使得酶在工业中的应用受到了极大的限制，找到解决这些问题得

方法十分迫切。

可喜的是，经过专家学者的不断努力，发现将酶用特殊的载体固定，酶仍能与底物有效的进行反应。这中酶的出现，使得酶与产物在反应液中相互分离，具有可回收、重复利用等优点，从而使生产工艺可以实现连续化、自动化。

酶的固定化是指将酶限制或固定在某一局部空间或特定的固体载体上进行其特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术，在催化反应中以固相状态作

用于底物。近年来，固定化酶的研究得到了人们极大的关注，并取得了许多重

要成果。下面以酶的固定化方法为核心,介绍一些有关酶固定化技术的应用及研

究新进展。

二、传统酶固定化技术

由于用于固定化酶的材料多种多样，而且，固定化酶的应用目的和环境各不相

同，因此酶固定化方法也很多。传统的酶固定化方法有：吸附法、包埋法、共

价结合法和交联法4种。

（一）、吸附法

吸附法是利用多种固体吸附剂将酶或含酶细胞吸附在其表面上而使酶固定的方法。吸附法具有制备简单、酶活力高、费用较低等优点，但酶与载体结合力弱，易脱落，因此，有待开发新型载体材料来改善。

吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法两种。

1、物理吸附法

酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。从载体对酶的适应性来看，这

个方法效果好，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变化也不明显，但其缺

点是酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶。此法载体很多，有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳

素及其衍生物等。

2、离子吸附法

离子吸附法是将酶与含有离子交换基的水不溶性载体相结合的固定化方法。

离子吸附法操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被

破坏，因此能得到的酶活回收率较高的固定化酶。采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、β-淀粉酶、纤维素酶等。

（二）、包埋法

包埋法是用一定的方法将酶包埋于半透性的载体中，制成固定化酶，这种载

体的孔径小，因此只允许小分子的底物、产物自由穿过，不允许大分子的酶穿过，从

而使酶易于与产物分离。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很

少改变酶的空间构象，酶活回收率较高，因此可以应用于许多酶的固定化。

（三）、共价结合法

共价结合法是酶蛋白分子上的官能团和固体支持物表面上的反应基团之间形

成化学共价健连接，从而固定酶的方法。共价结合法的优点是酶与载体间连接牢固，

即使用高浓度底物或离子强度的溶液进行反应，也不会导致酶和载体的分离，因此具有良好的稳定性及重复使用性，是目前应用和报道最多的一类方法。其缺点是反应条

件比较苛刻，常常会引起酶蛋白高级结构发生改变，导致酶的活性中心受损。

共价结合法常用的载体有：天然高分子，如纤维素、琼脂糖、淀粉等；合成

高聚物，如尼龙、多聚氨基酸等；无机支持物，如多孔玻璃、金属氧化物等。

（四）、交联法

交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，是酶分子和多功能试剂之间形成共价健，得到三向的交联网架结构。共价结合法的优点是酶与载体间的结合力强，其缺点是制备较难，酶活力低，固定化费用高。常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二

醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，因此常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果。

三、新型酶固定化方法

固定化酶的出现，使酶的功能发挥的更好，使生产工艺效率更高，因此，对

于的固定化酶的研究也在不断的推进，除了上述的传统的酶固定方法外，一些新的酶

固定的方法也在不断的推出。

（一）、定向固定

传统的酶固定化方法，酶是在随意位点和载体进行连接，通常的连接位点是一个ε-氨基酸，一般是赖氨酸，因为酶通常含有多个赖氨酸，所以酶会和载体在许多位

点进行反应，这样，有些位点的反应就会阻碍底物进入到酶的活性位点。另外，当酶

随意固定化在载体上时一般是发生多位点的结合，这样就会降低酶的固定化量。通过

使用不同的方法, 把酶和载体在酶的特定位点上连接起来，使酶在载体表面按一定的方向排列,使它的活性位点面朝固体表面的外侧，有利于底物进入到酶的活性位点里去，这种酶固定方法即定向固定法。

定向固定化是把酶和载体在酶的特定位点上连接起来，使酶在载体表面按一定的方向排列。酶定向固定化的设计是在背离活性中心入口的酶表面通过定点突变在该

酶表面引入低频氨基酸( 半胱氨酸) ，通过该氨基酸残基的特殊侧链来控制固定化方向。定向固定化的酶的活性要远远高于随意固定化的酶。目前，这种有序的、定向固定化

技术已经用于生物芯片、生物传感器、生物反应器、临床诊断、药物设计以及蛋白质

结构和功能的研究。

（二）、共固定技术

共固定化是将不同的酶与酶、细胞与细胞或细胞与酶同时固定于同一载体内

形成共固定化系统的一种技术,综合了混合发酵和固定化技术的优点。这种系统稳定,可将几种不同功能的酶, 细胞和细胞器在同一系统内进行协同作用。

多酶共固技术是酶、细胞固定化技术发展的综合产物，它可以充分发挥不同

酶的特点，将其催化特性结合起来，充分利用协同作用，提高其催化效率。鉴于上述

优越性，采用固定化，共固定化技术生产酒精、啤酒、果酒及食醋的等的研究十分盛行。

（三）、交联酶聚集体

交联酶聚集体(CLEAs)已被纳入无载体固定化酶范畴，它具有操作简便，获得的固定化酶稳定性好、成本低廉、无需其他载体、单位体积活性大、空间效率高等优点，而被广泛应用于蛋白质的分离和纯化及酶固定化等方面。

交联酶聚集体的制备分两个步骤：聚集体形成和聚集体交联，两个步骤前后连续,对最后交联酶聚集体产品的活性和稳定性都有重要影响。

酶聚集体的形成实质上是将酶进行浓缩沉淀, 使酶相互堆积形成超分子结构。该操作与分离纯化中的沉淀完全相同。而酶聚集体的交联是指利用交联剂将酶的物理

聚集体进行共价捆绑, 将酶聚集体形成的超分子结构及活性保持下来, 使其在反应体系中不易被破坏、并可被回收使用。用作交联剂的物质有很多种，戊二醛是最常用的一种。

（四）其他新方法

以上几种新型酶固定方法是报道的比较多，此外，其他的一些新型酶固定方法

也有报道，如微波辅助固定化、光化学固定化、纳米技术辅助下的固定化、点击化学

固定化，这些方法一定程度上克服了传统方法的缺点，但也有一些需要改进的地方，

如光化学固定法虽然固定效果好，但是该固定化局限于天气条件，工程中的应用会受

到很大限制。

四、酶固定化过程中的新载体

酶固定化发展的过程中，除了新方法的不断涌现，一些用于酶固定的新载体也

在不断的被研发出来。

（一）、介孔材料

自从1992 年美国Mobile 公司首次合成出了MCM-41 系列介孔分子筛以来，介孔材料在酶生物催化剂固定化方面的研究和应用日益受到人们的重视，。孔道的结构

和尺寸对酶活力及稳定性有着明显的影响，合适的孔道中酶固定化后其活力可得到提高，而且三维及大孔道有利于固定化与催化过程中酶蛋白和底物、产物的传输，从而能提高酶的固定化和催化效果。目前，大孔道、高比表面和孔容的新型介孔材料不断

被引入酶固定化领域，因为大孔道、高比表面、高孔容的介孔材料中酶的负载量大，且酶的负载能快速完成。

（二）、纳米管

研究发现将青霉素酰化酶固定化吸附固定化于碳纳米管中，由于纳米管的内表面与酶蛋白之间存在着强烈的作用，从而使得管内酶蛋白结构稳定且保留相当的催化活力。同时，酶的热稳定性、pH 耐受性等性能也明显改善。

（三）、磁性载体

由于磁性粒子易于分离，其作为酶固定化载体一直受到人们的青睐。用磁性载体固定化的酶在催化过程中表现出极佳的稳定性，而且，因载体具有磁性而能更方便地实现固液分离。

（四）、离子液体

将酶固定化于离子液体，酶不但显示出很好的催化活力，而且酶很容易从反应体系中分离。

（五）、尼龙材料及棉布

用尼龙布作为载体用于酶的固定化过程中，酶的稳定性较好，固定化酶与产物的分离也很方便。但工业中应用时该类固定化酶的稳定性还有待于进一步提高。

五、固定化酶的应用

酶固定化技术已在食品工业。精细化学品工业、医药，特别是手性化合物等行业得到广泛应用，在废水处理方面也取得进展。

（一）、在食品工业的应用

酶固定化技术在食品行业最早发展起来的一个领域,其中最著名、规模最大的就是利用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆。还有应用固定化L - 天冬酶从富马酸铵生产天冬氨酸等。

牛奶是一种营养丰富的食品, 但含有一定量的乳糖,体内缺乏B- 半乳糖苷酶的人, 食用后会出现消化不良、肠痉挛和腹泄的现象。将固定化乳糖酶用于低乳糖制品的生产工艺已实现工业化。

将固定化酶法应用于茶饮料及果蔬饮料生产中, 可去除异味, 提高适口性、营养价值。

（二）、在化工行业的应用

随着绿色化学工业的不断发展，固定化酶生物催化剂在化工行业中的应用越来越深入，其主要作用是代替化学催化剂制备化工原料。

（三）、在生物传感器方面的应用

固定化酶技术生物传感器的发展使食品检验得以迅速发展。它的问世不仅使食品成分的快速、低成本、高选择性分析测定成为可能, 而且生物传感器技术的持续发展将很快实现食品生产的在线质量控制, 降低食品生产成本, 并给人们带来安全可靠及

高质量的食品。

在医学领域, 生物传感器因快速简单、专一、灵敏、响应快等优点也发挥着越来越重要的作用。目前, 生物传感器已应用于检测多种细菌、病毒及其毒素等多个方面。高精度血糖分析仪是采用固定化酶的生物传感分析仪。

（四）、在环境保护中的应用

在环境监测方面, 根据固定化酶用于化学分析的原理, 固定化酶也可以用于测定有毒物质含量以进行环境监测。在废水处理中, 固定化酶也受到了越来越多科学家的关注，由于单一酶处理污水效果不是很好，因此，用多种酶共同处理污水成为研究热点。

六、结束语

由于酶具有催化作用的高效性，其应用越来越广泛。固定化酶技术的出现使得

酶在工业中的大规模应用成为可能。固定化酶克服了游离酶的许多缺点，具有

稳定性好，可重复利用，效率高等优点。但固定化酶技术目前还存在固定效率

低、载体的有毒性、成本高等问题。因此，只有不断探索新的固定化方法，以

及开发新的载体，才能提高固定化酶的活性回收率，延长其半衰期，从而达到

人们理想的使用效。随着生物技术及材料、化工等各相关学科的不断发展, 固

定化酶的工作会有新的突破。将更多固定化酶取得工业化规模的应用,仍然是固

定化技术领域追求的目标。