CLONTECH酵母双杂中文版
目录
（一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30
方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表
Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置
Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置
Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果
Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs
图片列表
Figure 1．使用BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白-DNA相互作用 4 Figure 2．使用BD Matchmaker单杂交系统筛选蛋白-蛋白相互作用 4 Figure 3．酵母单杂交和双杂交筛选的大致步骤5 Figure 4．构建和筛选BD Matchmaker酵母单杂交和双杂交文库6 Figure 5．酵母菌株AH109和Y187中的报告基因12 Figure 6．BD Matchmaker酵母单杂交文库的构建和筛选16 Figure 7．BD Matchmaker酵母双杂交文库的构建和筛选17 Figure 8．用BD SMART技术合成高质量的ds cDNA 21 Figure 9．BD CHROMA SPIN纯化柱和收集管26 Figure 10．通过酵母重整合作用来构建AD融合文库27 Figure 11．为双杂交筛选AD融合文库32 Figure 12．分析和证明可能的单杂交和双杂交相互作用阳性结果的策略39 Figure 13．通过酵母配对来验证蛋白-蛋白相互作用42 Figure 14．用对照用人胎盘Poly A+ RNA合成双链cDNA 51 Figure 15．p53HIS对照载体的图谱53 Figure 16．pGAD-Rec2-53 AD对照载体的图谱53 Figure 17．pGADT7-RecT AD对照载体的图谱54 Figure 18．pGBKT7-53 DNA-BD 对照载体图谱54 Figure 19．pGBKT7-Lam DNA-BD 对照载体图谱55
（一）介绍
BD Matchmaker TM Library Construction & Screening试剂盒提供一种简便的方法构建cDNA文库用来进行酵母双杂交和单杂交的筛选，这些试剂盒结合了BD Matchmaker TM Systems和BD SMART TM cDNA Synthesis的技术，只需要用任何组织的1 μg poly A+ RNA 或total RNA就能构建cDNA文库。通过一般细胞内克隆步骤，你能利用BD Matchmaker Systems所提供的灵敏的转录方法所构建的文库来进行单杂交或双杂交实验。
单杂交实验的原理——蛋白-DNA相互作用实验
单杂交实验使你能够确定和描述蛋白与目的顺式DNA激活序列的绑定，该序列可能是处于最小限度的启动子上游的用于增强转录的元件。这个实验也可以用于预测或新蛋白的DNA 绑定结构域的确定。通过BD Matchmaker One-Hybrid System你可以很容易的获得这些基因表达的蛋白
在BD Matchmaker One-Hybrid实验中，潜在的DNA绑定蛋白基因是与克隆在pGADT7-Rec2（为单杂交设计的低拷贝载体）上GAL4激活结构域（AD）序列一起融合表达的。一个或多个目的DNA序列的串联拷贝被构建在pHIS2（含有HIS3营养缺陷报告基因的报告载体）。DNA绑定蛋白和目标序列的相互作用会激活HIS3的转录（Figure 1），该过程要在宿主菌株Y187（组氨酸缺陷型）中进行并在缺少组氨酸的培养基生长
双杂交实验的原理——蛋白-蛋白相互作用的原理
双杂实验分析能用于鉴定新的蛋白与蛋白相互作用、确定疑似作用、明确结构域。在一个BD Matchmaker双杂交实验分析中，诱饵基因是与GAL4 DNA（DNA-BD）绑定结构域序列融合表达的，同时其他的基因或其cDNA与GAL4激活域（AD）序列融合表达（Fields & Song, 1989; Chien et al., 1991）。当诱饵与文库融合蛋白在AH109（ADE2, HIS3, lacZ, MEL1）这样的报告菌株中相互作用，DNA-BD和AD相接近结合，并激活报告基因转录（Figure 2)
DNA-BD 和AD的融合序列是将cDNA序列克隆进酵母表达载体pGBKT7 和pGADT7-Rec载体中来实现的。pGBKT7表达了与GAL4 DNA-BD融合的蛋白，而pGADT7-Rec表达与GAL4 AD相融合的蛋白。在酵母中，两种融合基因在组成型启动子P ADH1下高水平表达的。其他的像pGBT9、ADH1、pAS2-1、pBridge基于GAL4的克隆载体与这个试剂盒也相兼容的。pBridge载体能被用于鉴定三蛋白复合体的酵母三杂交实验。
单杂交和双杂交实验分析的生物学基础
单杂交和双杂交方法是基于许多真核转录因子被发现是复合组成的，它们的转录激活和DNA绑第结构域在结构上和功能上是分开的。这使研究者可以构建各种融合基因，当在酵母中表达时，能同时结合到目标DNA序列并激活下游报告基因的转录（Figure1
和Figure2），BD Matchmaker systems 使用的GAL4的转录激活域与DNA绑定域是被完全阐述的的转录因子（Zhu, L. & Hannon, G. J., 2000.）
双杂和单杂文库的建立和筛选
双杂和单杂文库的建立和筛选由四个主要步骤组成，（注：有两个步骤遵从同样的流程）。如果想去筛选双杂交相互作用，第一步是建立一种DNA-BD融合载体。第二步是使用试剂盒所提供BD SMART试剂从你所抽提poly A 和total RNA建立cDNA文库。
就酵母双杂筛选而言，如果你打算我们从预制的BD Matchmaker cDNA文库选取来替代自己准备文库，可以跳过RNA分离、cDNA合成、AD融合文库构建。这些包含非常广泛组织的文库被有效的保存在甘油中或预转化到Y187酵母菌株。我们也提供一种BD Matchmaker文库服务，基于这个服务，提供给我们你想筛选的组织与细胞，我们为你制作AD融合文库。请注意，我们尽管在高拷贝酵母表达载体中建立了很多的预制和预转化的BD Matchmaker cDNA文库，对双杂工作非常理想的，但他们很少适合单杂分析。在单杂分析中我们推荐使用pGADT7-Rec2 and pHIS2等低拷贝载体，因为他们产生较少的假阳性克隆。
其次是cDNA合成，把cDNA克隆到BD Matchmaker AD克隆载体中建立一个GAL4 AD 融合文库，如果是建立双杂文库是pGADT7-Rec载体，单杂则是pGADT7-Rec2载体。克隆在细胞内通过同源重组来进行的，这一步利用酵母替内高效重组系统使ds cDNA和相应的GAL4 AD质粒融合。采用重组介导的克隆，文库的构建和筛选能紧密的完成，而不需要任何的细菌转化和扩增步骤。简单的把cDNA文库和相应的BD Matchmaker载体转化到酵母中，然后把细胞用于成分缺省培养基筛选双杂作用。
Figure 3. 酵母单杂和双杂筛选的一般步骤，更加详细单杂和双杂筛选流程图，请参考Figures 6 and 7.
Figure 4. BD Matchmaker TM 单杂和双杂文库筛选与构建.
如这个图表所示，As this diagram shows,重组介导克隆使文库构建和筛选更快捷高效，尽管这里没有显示，双杂文库能通过酵母融合筛选（细节参照Section XII）.BD SMART TM 的cDNA合成和扩增，请参照Section IX. pGADT7-Rec被用于双杂文库构建和筛选而pGADT7-Rec2被用于单杂文库构建和筛选。被pGADT7-Rec[2]所显示的两个相关载体有不同复制元件。更多的信息请参照Section X 和相关的载体信息包.i
（二）试剂盒内试剂列表
此试剂盒包含有足够试剂能制备5次单杂或5次双杂文库。
去离子水、BD CHROMA SPIN柱,、NaCl溶液、缺省(DO)补充物、NaOAc、LiAc、PEG、TE Buffer,、YPD Plus培养基在室温下保存；.酵母菌株、对照Poly A +和BD SMART III Oligo 保存在–70°C，其他试剂储存在–20°C.下。
cDNA第一条链合成
cDNA扩增
Trial –Size BD Advantage TM PCR 试剂盒
cDNA 纯化
单杂交文库构建
双杂交文库构建
BD Yeastmaker 酵母转化系统
（三）自备材料
下列试剂自备，无其他特别要求所有的试剂与溶液均储存与室温下。cDNA第一条链合成
●无菌0.5ml离心管
●Poly A+ or total RNA
●矿物油
●热循环仪
●DNA marker (1-kb DNA ladder)
● 1.2% Agarose/EtBr gel
cDNA的分离
● 1.5ml无菌离心管
●带有小架子环型支架
●95%乙醇（-20℃）
●1% 氯代二甲苯
诱饵质粒构建
● E. coli感受态细胞。像DH5α or BD Fusion-Blue 感受态细胞
●T4 DNA连接酶
●10X T4 连接buffer
●LB/amp 平板
●50 mM NaCl
●从E. coli转化子中提取质粒的试剂盒
酵母转化（在无菌容器中准备试剂）
●PEG/LiAc溶液
● 1.1X TE/LiAc溶液
●二甲亚砜
酵母的培养与配对
●YPD培养基(参照Yeast Protocols Handbook)
●YPDA培养基（添加30 mg/L adenine hemisulfate，参照Yeast Protocols
Handbook）
●TE buffer或者无菌的蒸馏水
●适合转化的无菌试管和烧瓶
●100-和150-培养平板
●无菌玻璃棒，用于扑板弯曲的吸管
●X-α-Gal（用于酵母双杂MEL1表达的蓝白筛选）
●有agar的Minimal SD Base和没有agar的Minimal SD Base
●3-AT（抑制SD缺省his培养基背景生长）
●Kanamycin 储存液（50 mg/ml ）保存于-20℃
●Ampicillin 储存液（50 mg/ml ）保存于-20℃
文库长期保存
●100%甘油
●YPD冷冻培养基（25%v/v甘油）
酵母双杂文库的构建与筛选
BD Matchmaker Two-Hybrid Library Construction & Screening Kit不提供下列缺省补充物。用户必须自己从其他公司购买或者按照Yeast Protocols Handbook的附录C的配比自己准备。
●Trp DO Supplement
●–His/–Leu/–Trp DO Supplement
●–His/–Trp DO Supplement
●–Ade/–Trp DO Supplement
PCR 克隆筛选
●BD Matchmaker GAL4 AD LD-Insert Screening Amplimer Set
酵母生长和保藏的其它信息，请参考Yeast Protocols Handbook。我们也推荐Guthrie & Fink的Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (1991)和Heslot & Gaillardin的Molecular Biology and Genetic Engineering of Yeasts (1992)。
A 基因型
TABLE I. BD MA TCHMAKER TM酵母的基因型
a．GAL1, GAL2和MEL1 的上游激活序列（UASs）应答于GAL4转录激活因子。
trp1,his3, gal4和gal80的突变都被删除；leu2-3, 112是一个双突变。
b. AH109衍生于PJ69-2A菌株，包括ADE2 、HIS3营养标记和一个内源的MEL1
基因(James et al., 1996)。lacZ 报告基因被引入PJ69-2A 而得到AH109菌株。
B.表现型
验证AH109 和Y187表现型是很重要的(Table II)。
1.复苏冻存的菌株，用无菌环或者牙签挑少量的细胞划到YPDA平板上。
2.30°C温育平板3到5天直到克隆出现，从这个工作平板上分离克隆增殖其他的平板。
3.按照Table II测试营养需求
a.用无菌环或者牙签，从工作平板上划3-4个克隆带单个合适的SD选择平板上。
b.30°C温育平板3到6天。酵母在SD选择培养基生长比YPDA培养基上要慢一些。
c.参照Table II比对你的结果，只有AH109 和Y181是期望的表现型才继续进行。
4.进行菌株融合或准备感受态细胞的液体培养，要使用已分离好经过验证工作平板克隆，
用保鲜膜密封好经过表型验证的工作平板，包藏在4°C。
TABLE II .BD MA TCHMAKER酵母菌株的表型
注：
●如果TRP1 和LEU2功能基因被导入，AH109 和Y187能够在SD/–Leu/–Trp
上生长。
●如果AH109携带ADE2 and HIS3基因被激活，AH109 and AH109/Y187 二倍体
能在SD/–Ade/–His生长。(i.e., in the presence of GAL4).
Y187 (MA Tα)能够与AH109, HF7c, CG-1945, Y190或SFY526 (all MATa)相融合。
D. 克隆的颜色和大小
●Y187携带的ade2-101突变和AH109在缺乏GAL4显示Ade-表型。在低含量的ade 培
养基上，克隆在几天后将变成粉红色，并在克隆老化后可能变暗。在补充Ade的培养基上生长时，颜色变化不显著。这些克隆生长到直径>2 mm。由于自发缺失线粒体功能的突变，会形成1–2%小的白色克隆。温育培养时要避免这些白色克隆。
●总体上Y187比AH109生长慢并形成明显较小的克隆。
E.报告基因
AH109包含四个在三个远距离GAL4上游调空序列(UASs)和TA TA boxes调控下的ADE2, HIS3, MEL1和lacZ四个报告基因(Figure 5)。ADE2报告基因针对ADE2 and HIS3，单独提供强的高严紧度的营养选择，减少假阳性率(James et al., 1996)。你也可以选择分析编码α-galactosidase的MEL1。由于α-galactosidase是一种内分泌酶，MEL1对于Y187和AH109两者是内源性的，可以通过添加X-α-Ga到选择平板来检测他的的活性，如果X-α-Gal存在，MEL1被激活，克隆将变成兰色。由于在完整的GAL1 UAS调控下，在阳性的双杂分析中Y187的lacZ表现出高水平的诱导β-galactosidase活性。
Figure 5. 酵母菌株AH109 和Y187中的报告基因。AH109是由PJ69-2A派生而来，包括了ADE2和HIS3两个营养合成基因（James et al., 1996）。MEL1是GAL4的内源效应基因。lacZ 报告基因被引入PJ69-2A而建成AH109。HIS3，ADE2和MEL1/lacZ报告基因都在不完全的GAL4效应序列和启动子元件GAL1，GAL2，MEL1的分别控制下
F. 缺失HIS3的表达
●3-AT是酵母HIS3蛋白的竞争性抑制剂。它被用于在缺省方式下阻止低水平的His3p
的表达，抑制缺省his SD培养基的北京生长。
●由于诱饵蛋白内在的dna结合特性，源于AH109的转化子可能表现出稍高HIS3表
达。通常少量3-AT足以抑制SD/–His上的背景生长。然而，如果你的选择是针对his3和ade2两者共同表达的，在初始文库筛选中没有必要去抑制缺省的HIS3。
●某些酵母菌株有相对较高本底水平的His3p，如果你使用Y190作为宿主菌，在培养
基中需要25–45 mM 3-AT去抑制背景生长。
●在你的选择培养基中优化3-AT的浓度
在你开始这个步骤以前，注意这个试剂盒不提供–His/–Trp缺省补充物，你必须自己单独购买或者按照Yeast Protocols Handbook的目录c的配比自己准备。
1.铺酵母转化子于一系列的不同3-AT浓度的SD/–His/–Trp平板上。
●如果你采用是包含有像pGBKT7这样DNA-BD质粒的AH109转化子，我
们推荐你从0 到15 mM之间开始测试3-AT的浓度（0,2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15
mM）
●如果你是采用包含有pHIS2报告质粒Y187转化子，我推荐你从10 到60
mM之间测试3-AT的浓度。
注：这些仅仅是推荐，优化浓度的高低主要依赖于使用的构件和菌株。
2.使用低浓度的3-AT，一周后，仅允许小的克隆去生长。培养基中太多的3-AT能
新的转化细胞。
（五）.酵母载体
A．单杂交系统
1、克隆载体
●信号载体pHIS2：cis-acting DNA片段插在HIS3营养报告基因的上游多克隆位
点（MCS）上，与HIS3基因（P minHIS3）启动子区相链接。在信号载体上还有一
段高度保守的低拷贝的CEN6/ARS4序列。
●克隆载体pGADT7-Rec2: 表达一个与GAL4 激活结构域(AD)相融合的蛋白，用
于酵母中同源重组介导的克隆（图4）。因此用户可以用Sma1消化的
pGADT7-Rec2（提供的）和ds cDNA（BD SMART文库构建法得到的）（Section
IX）通过酵母转化构建cDNA/AD融合文库。
2、对照载体（附录C）
●阳性对照载体p53HIS2：由DNA片段（包含至少3个连续拷贝的p53 cis-acting
DNA序列）插在pHIS2载体的多克隆位点上构成。插入片段在载体中HIS3基
因（P minHIS3）及其启动子的上游。
●阳性对照载体pGAD-Rec2-53：编码一个融合于GAL4 AD的鼠源p53蛋白。包
含p53HIS2和pGAD-Rec2-53的酵母细胞可以在缺组氨酸的SD培养基（如
SD/–His/–Leu/–Trp）上生长。
a、HA是血凝素，这些免疫标记用于通过体外的免疫共沉淀来鉴定蛋白与蛋白相互
作用，使用的抗体和实验方案由BD Matchmaker Co-IP 试剂盒提供。它们不适用于检测、亲合纯化和酵母内表达蛋白的免疫共沉淀。
b、通过SV40 Large T PCR Fragment和pGADT7-Rec共转化，在体内同源重组产生
的。
c、DNA-BD 和AD载体有不同的营养标记，酵母转化子被涂布在缺少特定成分的基
础培养基他们可以被单独地筛选出来。
B．双杂交系统
2.克隆载体
●pGBKT7：被用于表达一种与GAL4 DNA结合结构(DNA-BD域融合的蛋白。
●pGADT7-Rec：被用于表达一种与GAL4 激活结构域(AD)融合的蛋白。这个载
体被设计成针对同源重组介导的克隆。提供的pGADT7-Rec是被Sma I消化的
线形DNA。
3.对照载体
a.阳性对照
●pGBKT7-53编码一种GAL4 DNA-BD和鼠源的p53融合蛋白。
●SV40 Large T PCR Fragment编码SV40 large T-antigen。一起使用这个
DNA片段和pGADT7-Rec去检测酵母转化重组的效率。SV40 Large T
PCR Fragment和pGADT7-Rec重组形成pGADT7-RecT，它编码GAL4
AD 和large T-antigen的融合蛋白。
●p53和SV40 large T-antigen在酵母双杂分析中相互作用
b.阴性对照
●pGBKT7-Lam编码一种GAL4 DNA-BD和人类lamin C融合基因，提
供一个对照，针对一种不相关的蛋白和pGADT7-RecT 和你的
AD/library的质粒两者之一的意外作用。Lamin C既不形成复合体也不
于大多数蛋白相互作用。
TABLE IV. 双杂系统的载体
a.HA是血凝素，这些免疫标记被用于通过体外的免疫共沉淀来鉴定蛋白与蛋白相互作用，
使用的抗体和实验方案由BD Matchmaker Co-IP Kit 提供。它们无意被用于去检测、亲合纯化或者酵母内表达的蛋白的免疫共沉淀。
b.通过SV40 Large T PCR Fragment和pGADT7-Rec共转化，在体内同源重组产生的。
c.DNA-BD 和AD载体有不同的营养标记，当酵母转化子被扑到缺少特定成分的基础培养
基他们可以被单独的选择。
d.载体可以携带不同的抗生素标记因此可以在E. coli.中单独选择。
VII、构建酵母单杂实验的信号载体
A、背景
如果用BD Matchmaker单杂体系从cDNA库中筛选DNA-结合蛋白，必须先确定一个正确的或预测的靶元件。比如，敲除和点突变分析必须非常精确的运用。所构建的含有一个或多个拷贝的连续靶调控元件，其边界包含限制性酶切位点，重组入pHIS2的多克隆位点（MCS）。这就使得靶元件和HIS3信号基因联系到一起。插入靶元件后可能会影响HIS3表达的强度。因此，在做单杂实验前，要先检测一下构建的载体是否会减弱HIS3的表达。背景克隆的生长是由于HIS3的表达遗漏造成的，这可以通过在选择培养基中添加3-AT来控制，在第IV、F部分有详述。
B、靶元件的合成
每个靶-信号载体的构建都应在报告基因上游插入包含至少DNA靶元件的一个拷贝。早期的许多研究都提出，信号蛋白应包含至少3个连续拷贝的DNA靶元件。然而，Wei et al. (1999)证实了在许多情况下，单拷贝就已经足够了。关于靶元件数量问题可以参见Ghosh et al., 1993。连续的拷贝可通过多种方法制备，我们发现的最便捷、可靠的方法是寡核苷酸合成法。该方法之所以受欢迎是因为对于≤20 bp长度的调控元件该方法都很有效。
1、设计两条反向平行核苷酸链，一条为正义链，另一条为反义互补链。
注：正义链应包含一个或多个拷贝的靶元件和两端不同的酶切位点。当两链退火时，双链DNA会在每个末端有不同的突出来定向连入pHIS2。设计载体时参照pHIS2载体的多克隆位点信息（PT3705-5）。
2、合成不含5’磷酸盐的双链（参照合成方法）。
C、将靶DNA插入pHIS2的多克隆位点
1、正反义链核苷酸各0.1μg在10μl 50mM NaCl中混匀
2、核苷酸置于70℃5min退火，慢慢冷却至室温（~30min）
3、20μl体系完全酶切0.1μg pHIS2。37℃ 2hr或者按生产商的指导。
4、取2μl样品进行1%的琼脂糖凝胶电泳，确定质粒是否完全线性化。
5、将5μl酶切后的质粒、1μl退火后的寡核苷酸和4μl水混匀。
6、加入1.2μl 10×T4连接酶buffer和0.8μl（至少0.8units）T4 DNA连接酶，置于室温4hr。
注：寡核苷酸和载体的摩尔分子量为比100：1或者更大，无需通过胶回收来出除小片段。
7、用标准方法，每个构建的载体各自转化大肠杆菌（Sambrook et al., 1989）。我们推荐用DH5α或者BD Fusion-Blue TM提供的感受态细胞。
8、涂布在LB/Kan平板上，３７℃过夜。
９、用任意标准方法制备纯净的DNA（Sambrook et al., 1989）。通过用２％琼脂糖凝胶电泳和测序来鉴定靶片段插入是否正确。
Ｄ、鉴定靶－信号载体的HIS3背景表达
１、靶－信号载体用小规模方法转化Y187（参见第XI、C部分）
２、按第IV、F部分的方法来决定优化选择性培养基中３-AT的浓度。比如，我们发现１０mM ３-AT 就足够抑制Y１８７细胞转化p53HIS2对照实验的背景生长了。
VIII、为双杂分析建立一个与DNA-BD融合的载体
A. 建立一个DNA-BD融合基因
●如果相同的酶切位点在测试基因和相应的载体都存在，你可以建立一
个GAL4 DNA-BD融合基因。如果不，你可以通过PCR扩增基因片段，
使用的引物带有相应的酶切位点，通过合并期望的突变PCR引物，一
个在基因末端酶切位点可以被改变成不同的位点或者加入到不同的阅
读框。另外，如果你已经把一个基因克隆到BD Creator Donor Vector
中，使用Cre recombinase把你的基因转到pLP-GBKT7中。参考BD
Creator DNA Cloning Kits User Manual。
●更多关于克隆的具体信息，请参照Sambrook et al. (1989)
TABLE V. BD MA TCHMAKER TM DNA-BD载体的比较
a.包含两个检测三蛋白复合体的远距离表达框。
b.在以前BD Matchmaker Two-Hybrid Systems使用的DNA-BD载体。
c.BD Creator Acceptor Vector (LP = loxP). 从任何BD Creator Donor Vector
接受基因，作为GAL4 DNA-BD融合蛋白表达它。
1.纯化基因片段。（我们推荐使用NucleoSpin Extraction Kit (#K3051-1, -2)快速纯化DNA
片段）。
2.用合适的内切酶消化DNA-BD载体，进行磷酸化和醇化处理
3.连接相应的载体和插入片段，转化连接混合物到E. coli。
4.用酶切分析或PCR来鉴定被插入的质粒
B. 检测DNA-BD融合基因的转录激活
1. 使用少量转化方案（Section XII.A.7），使AH109 和Y187转化杂交。扑转化子在下列
平板上：
●SD/–Trp/X-α-Gal
●SD/–His/–Trp/X-α-Gal
●SD/–Ade/–Trp/X-α-Gal
包括一个假阳性对照，例如利用空载的DNA-BD载体转化细胞。
注：BD Matchmaker Library Construction & Screening Kit (#K1615-1)不提供制作这些培养基所要求的却省培养物。你必须自己单独购买或者按照Yeast Protocols Handbook 的目录c的配比自己准备。
2. 结果分析
●诱饵蛋白不被激活，如果转化子克隆是白色的并不能在SD/–His/–Trp 或者
SD/–Ade/–Trp上生长，继续5-6步。
●诱饵蛋白没有激活，如果转化子克隆是兰色的，并能SD/–His/–Trp 或者
SD/–Ade/–Trp生长，用3-4步骤继续。
4.如果诱饵菌株在缺少His的培养基显示背景生长，在你可以通过添加3-AT到选择培
养基（Section IV.F）。也可以使用–Ade/–His/–Leu/–Trp培养基筛选文库。
5.如果一个诱饵菌株在缺少Ade和His的培养基上显示背景生长，很难在双杂筛选中使
用这个诱饵蛋白。请参照故障处理指导。
6.如果就你的诱饵蛋白而言已知蛋白可用，用他去核对用这个特别DNA-BD/bait fusion
双杂相互作用的是否有可检测性。
7.蛋白表达的鉴定
●用转化的菌液做Western印记，用GAL4 DNA-BD的抗体做印记探针。使用没有
转化的酵母菌液做对照。
注：使用多克隆抗体可能导致多重交叉反映带；pGBT9 和pBridge的表达水平太低不允许使用GAL4 DNA-BD单克隆抗体检测。
C. 测试DNA-BD融合蛋白的毒性
●对比转化空载DNA-BD载体和DNA-BD/诱饵质粒的液体培养Y187细胞的生长
率，如果诱饵菌株生长明显减慢，你的DNA-BD/诱饵质粒可能有毒。
●使用少量酵母转化方案去准备转化子。在SD/–Trp上选择转化子，如下方案贮备
过夜培养：
1.用50 ml SD/–Trp/Kan (20 μg/ml)温育一个大的克隆（2-3mm）
2.30°C，250–270 rpm 摇晃，过夜培养(16–24 hr)。
3.检测培养物OD600。它应该≥0.8，如果OD600远小于0.8/，DNA-BD
融合蛋白可能有毒。如果融合基因不阻止酵母的生长，她是无毒的，
你可以计划用酵母融合去筛选你的双杂文库，用步骤4-7继续。如
果你打算用共转化去筛选，你可以停在这里并采用Section IX。
4.离心600 x g，5分钟。
5.弃上清
6.在5 ml SD/–Trp液体培养基重新悬浮，用计数器计算细胞数。细胞
密度应该≥1 x 10 cells/ml.
7.融合这些诱饵菌株和你的AD融合文库的宿主菌(Section XII.A.4)。
注：Y187 (MATα)能与AH109, HF7c, CG-1945, Y190, or SFY526
(MATa)菌株融合。μ
（九）建立一个cDNA文库
A. 用BD SMART技术建立一个cDNA文库
使用BD SMART技术mrna的转录产物能被有效的复制成ds cDNA，由于它可以保持序列的完整性同时可以高通量产生cDNA，非常适合单杂和双杂文库的构建.通过保持器官组织的复杂性，BD SMART步骤可以提供你检测稀有的和潜在的未知相互作用良好机会，在酵母单杂和双杂筛选过程中。
B. BD SMART cDNA 合成与扩增是如何进行的
在首链cDNA合成步骤中，MMLV反转录酶用于把RNA反转录成DNA.就cDNA合成的引物RNA，你即可以使用被修正的oligo(dT)引物（CDS III Primer）也可以使用随机引物(CDS III/6 Primer).
得到的cDNA文库的复杂性可能不同，主要依赖于你选择哪种引物.如果你使用CDS III引物，它杂交到poly A RNA的3'末端，在接近5'的反转录序有稍低的保真性.如果你使用CDS III/6引物替代，随机引物可以能杂交到RNA摸板序列的不同部位，你的文库应该包括很多不同5'- 和3'-端的序列，他们可能被均等的表达。
MMLV RT遇到摸板的5'末端时候，酶的末端转移活性就回增加一些额外的核酸到cDNA的3'末端，主要是脱氧胞啶。那么具有oligo(G)序列3'末端的BD SMART III寡核苷与脱氧胞啶骨架配对，产生一个延伸摸板。此时RT转换摸板继续复制到核苷酸的末端。在大部分的合成中，生成的ss cDNA包含有完整的可以与BD SMART III Oligo互补mrna 5'末端，它可以后续扩增作为长距离PCR的通用引物，仅这些具有BD SMART 5' 末端锚定序列的ss cDNAs可以做为摸板，被LD PCR呈指数级扩增。
在第二步中，ss cDNA被LD PCR扩增产生ds cDNA库。Library Construction &Screening Kits 包括一个免费试用包装BD Advantage(TM)2 PCR Kit，因而你可以产生和扩增ds cDNA。BD Advantage 2 Polymerase Mix包括有：BD TITANIUM(TM) Taq DNA Polymerase（没有n 末端检测能力的Taq DNA polymerase），适用于hot-start PCR的BD TaqStart(TM) Antibody，少量的具有校正能力的聚合酶。这个酶可以允许你比普通的PCR更高的保真度来扩增cDNA （大约20 kb）
Figure 8．使用BD SMART(TM) 技术高质量ds cDNA的合成
酵母双杂实验步骤
2.1.1酵母双杂交 2.1.1.1Gateway入门克隆 设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TT G-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TT G-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。 通过PCR扩增获得带有att B位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下： att B-PCR产物（≥10 ng/μL）1-7μL pDONR221 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL 将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。 进行BP反应时，需注意以下几项： (1)对于BP反应来说，最高效的是采用线性的att B-PCR产物和超螺旋的att P 入门载体； (2)为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可 以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对 于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的； (3)提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物 最好不要超过250ng。 2.1.1.2诱饵载体构建 重组的入门载体测序正确后，通过LR反应来构建酵母双杂交的诱饵载体，LR反应体系如下： 入门载体(50-150 ng)1-7μL pDEST32 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL
CLONTECH酵母双杂中文版
目录 （一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表 Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs
酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？ 各种SD培养基： 1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4) SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）
酵母双杂(共转)
酵母双杂交的原理及实验步骤 吴健2015.12.25 一酵母双杂交的原理 在酵母细胞中，有半乳糖存在的情况下，GAL4 可以激活半乳糖代谢酶GAL1 的转录。GAL4 蛋白包含两个结构域，单独的N 端的结构域(BD)可以特异地结合DNA 但是不能够激活转录；单独的C 端包含一个激活区域（AD）但是如果不能结 合到17-mer 上游激活序列USA G 也不能激活转录。将来自大肠杆菌的LecA DNA 结合域BD 和酵母的GAL4 转录激活域AD 重组后，在酵母中实现了下游基因的转录激活。说明转录因子的BD 和AD 功能域可相互独立地发挥各自的作用，并且在 重组后仍然具有基因转录的活性(Brent and Ptashne, 1985)。酵母双杂交系统就是在 这一分子基础上开发出来的，GAL4 的BD 和AD，分别与能够互作的蛋白X 和Y 融合表达。由于XY 蛋白的结合，实现了GAL4 的BD 和AD 重组，GAL4 就重新获得了转录活性，转录因子就可以驱动报告基因表达(Fields and Song, 1989)。除了 将两个杂合载体BD-X 或AD-Y 转化入同一酵母细胞外，利用两个不同性别的酵母杂交（mating）也是实现BD 和AD 蛋白重组和蛋白互作检测的有效方法(Bendixen et al., 1994)。 Fig1. 酵母双杂原理图
Fig2. 常用两种酵母菌的基因型 Fig3. 常用两种酵母菌的报告基因
Fig4. 常用AD和BD载体图Fig5. 酵母双杂流程图
二酵母双杂交的基本步骤 1 酵母感受态的制备 配制培养酵母YPAD 培养基，以及筛选和转化酵母的SD 培养基，灭菌备用。 1) 用灭菌的接种环从保存的菌种中挑取一小块，在YPAD 培养基上划线分离单菌 落，在30℃培养箱中倒置培养 3 d 活化菌种； 2) 用灭菌的接种环挑取一个2-3 mm，生长时间小于一个月的单克隆到3 ml 的 YPAD 培养基中，剧烈震荡1 min，打散所有的细胞块，30℃震荡培养8 h； 3) 接种5 μl 的培养物到含有50 ml YPAD 的250 ml 的烧瓶中，30℃，250 r/min 震 荡培养20 h，直到OD 600 =0.3； 4) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用100 ml 的YPAD 重悬细胞块，30℃230-250 r/min 震荡培养3-5 h，直到OD 600 =0.4-0.5； 5) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用60 ml 的灭菌的dd H2O 重悬细胞块； 6) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用3 ml 的1.1×TE/LiAc 溶液重悬细胞块； 7) 将上清分装到2 个无菌的1.5 ml 的离心管，室温13200 g 离心15 sec； 8) 去除上清，用600 μl 1.1×TE/LiAc 溶液悬浮细胞块，感受态制备完成。制好的 感受态细胞应该立即使用（2 h 以内），不能长时间保存。 2 酵母小规模转化 2) 在预冷无菌的1.5 ml 的离心管中依次加入： 质粒DNA 0.5 μg herring testes carrier DNA（10mg/ml） 5 μl （使用前沸水煮5min，立刻放入冰上）感受态细胞50 μl 轻轻震荡混匀； 3) 加入0.5 ml 的PEG/LiAc 溶液，轻轻在振荡器上震荡混匀； 4) 在30℃水浴中孵育30 min，每隔10 min 混匀一次； 5) 加入20 μl 的DMSO（Dimethyl sulfoxide），42℃水浴热休克15 min，每隔5 min 混 匀一次； 6) 最高转速离心15 sec，去除上清，用1 ml YPD plus 液体培养基悬浮细胞块； 7) 30℃震荡培养90 min； 8) 最高转速离心15 sec，去除上清，用1 ml 的0.9%的NaCl 溶液悬浮； 9) 取1:10, 1:100, 1:1000 的稀释度涂皿；或者直接取100 μl涂于相应的SD平板上， 10) 30℃倒置培养直到单克隆长出，统计转化效率。挑取单克隆检测以及保存菌种， 备用。
蛋白的酵母双杂交操作手册大全
蛋白的酵母双杂交实验 ——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用 第一部分 系统简介 1. 实验原理 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在 Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示： 图一：酵母双杂交系统工作原理 Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA
酵母双杂交系统
酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA 结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。 2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。 1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活
(完整版)酵母双杂交原理
酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转
酵母双杂试验
pGBKT7和pGADT7不要同时转入细胞，要先转入一个，平板培养，挑单菌落做液体培养，再转入另一个质粒，同时转入两个质粒的效率太低。我做的时候转化率很高，从来没有出现过问题，转入第一个质粒（pGBKT7）通常在SD-Trp平板上可以有3000-4000个菌落，再转入pGADT7后，在双选择平板SD-Trp-Leu上至少也可以收获400-500个菌落。需要注意的是，细胞转入pGBKT7后，在-Trp上挑选单菌落做液体培养时，不要用YPD培养液，要用SD-Trp培养液，这样才可以使转化的细胞充分生长。 转化实验的条件也很重要，如果你觉得这中间有什么不放心，你可以把protocol发给我看看。我这里AH109长得很好，但实验室在国外，估计没法给你。 另外，你说AH109培养不好，是在什么选择平板上？在转完两个质粒以后做实验筛选时，应该先做LacZ和MEL1的显色，再做HIS3，最后做ADE2（因为ADE2的选择是最stringent 的）。还有什么问题可以继续问我。 1.YPDA配制方法如下： 先称好Yeast Extract 和Tryptone ，各10g/L 和20g/L ，加水885ml/L 另外称取葡萄糖20g/L，放入另一个容器内，（如果量不多，也可以用50ml离心管）加水定容至100ml。以上两个瓶子同时灭菌：115摄氏度，20min 。 灭菌完后，再混合。最后加入已经过滤除菌的0.2％的ADE储液，15ml/L 。 121° 15min -80°取菌种，划线，30° 培养3天, 表面光滑而湿润，把平板用封口膜封好，4°冰箱保存，防止霉菌污染。 2.设置阴性对照最好用空载体，因为pGBKT7-Lam+pGADT7-T组成的阴性对照，在SD\-Trp-Leu-His 板上是能够生长的，但生长速度要比阳性对照慢好多。而Y187或AH109空菌株，在SD\-Trp-Leu-His 板上不能生长，这说明，阴性对照在三缺板上有背景生长。 常用试剂的配制 (1) Kana ( 50rng/ml)溶液的配制:2.5g卡那霉素溶于40 ml双蒸水中,待完全 溶解后定容到50 ml, 0.22^011滤膜过滤除菌,-2(rC保存. (2) Amp(100rng/ml)溶液的配制:5g氨节青霉素溶于40 ml双蒸水中,待完全溶 解后定容到50 ml, 0.22^m滤膜过滤除菌,-201保存. (3) 20%葡萄糖溶液的配制:20g葡萄糖溶于40ml去离子水中,待葡萄糖完全溶 解后定容至100ml,在超净工作台中用0.22^011滤膜过滤除菌,4°C保存。 (4) 0.2%腺噪呤半硫酸盐:0.03g腺嘿呤半硫酸盐溶于12ml去离子水中,待完 全溶解后定容至15ml,在超净工作台中用0.22^1111滤膜过滤除菌,4°C保存。 (5) 60%甘油的配制:60ml甘油,加人去离子水,定容到100ml,混匀后,121 °C高温蒸汽灭菌20min,4°C保存。 (6) Tris-乙酸(TAE)的配方: 50X储存液:242g Tris 碱+57.1 ml 冰乙酸+100ml0.5inol/LEDTA(pH8.0) 工作液:40mmol/L Tris-乙酸+lmmol/LEDTA YPD培养基 20g/L Difco peptone lOg/L Yeast extract 20g/L Agar(for plates only) 对于包含腺嚼呤的YPD (YPDA)培养基,每升培养基中可加入15ml0.2%的腺 噪呤半硫酸盐溶液(终浓度为0.003%)。 加水至900 ml,调pH值为6.5,然后高温蒸汽灭菌。待培养基冷却到55°C左右
CLONTECH酵母双杂中文版
目录 一）介绍4二）试剂盒物品清单7三）额外附加物品列表9四）酵母菌株11五）酵母载体14六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16方法简述：双杂交文库的构建和筛选17七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19九）构建生成cDNA文库21十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35十三）分析阳性相互作用结果38十四）问题解决指南44十五）参考文献47十六）相关产品50附录A:双链cDNA 合成的典型结果51附录B:酵母感受态的制备—LiAc 法52附录C：单杂交对照载体信息53附录D：双杂对照载体信息54表格列表 Table I．BD Matchmaker 酵母菌株的基因型11 Table II．BD Matchmaker 酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI．RNA 起始浓度和PCR 扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII．用于PCR 筛选菌落的Assembling Master Mixs
酵母双杂交实验流程
模块七蛋白质之间的相互作用 1. 实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料，学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术；让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用；掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2. 实验原理 1989年Fields和Song等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识（即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与），提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统，酵母双杂交系统具有以下优点：（1）检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3）检测结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。（5）通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先，经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的初期阶段，由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制，因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的原因可能有许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、磷酸化和二硫键形成，还有些蛋白的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。 现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因，如AH109酵母株含有三类报告基因—ADE2、HIS3、MEL1/lacZ，这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的GAL4-反应元件和三类启动子元件-GAL1、GAL2以及MEL1（如图6-1-1）。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性，一类是融合蛋白可以直接与GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性；另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定的TA TA盒上所带来的假阳性。ADE2一种报告基因就已经能够提供较强的营养选择压力，这时选择性地使用HIS3报告基因，一来可以降低假阳性率；二来可以控制筛选的严格性（如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，就可以同时使用ADE2、HIS3两种报告基因；如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，就可以使用ADE2或HIS3两者中的一种）。MEL1和lacZ分别编码α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，可以作用于相应的底物
酵母双杂交实验步骤
LexA酵母双杂交系统简介 一、LexA酵母双杂交系统的设计原理 报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。 质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。 质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。 根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。 如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。 二、商品化酵母双杂交系统的组成 1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库 2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株） 3. 大肠杆菌菌株： KC8株 4. 对照质粒：
酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理 1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。 酵母双杂交系统由三个部分组成： (1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。 (2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。 (3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。 二.所用的载体及相关信息 1. pGBKT7载体的图谱和相关信息 The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1). b. pGADT7载体的图谱和相关信息
酵母双杂总结
酵母双杂原理：酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有：GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物(mammal;mammalian)的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。
酵母双杂交实验
酵母双杂交相关实验方法 一、酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法） 1、酵母质粒提取试剂 Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol 0.1mol/L EDTA Buffer II 50mM/L Tris 20mM/L EDTA Buffer III 10mM/L Tris 1Mm/L EDTA 2、操作步骤： (1)收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶（30mg/ml）。. (2)37℃水浴1h。 (3)10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。 (4)加入25μl 10% SDS，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。 (5)加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。 (6)4℃12000rpm离心15min，取上清。 (7)在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小时以上。 (8)取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。 (9)加入150μl buffer III 溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。 (10)12000rpm离心15min。 (11)将上清转入新的离心管中，加入6μl(10U/μl)RNA酶37℃放置30min。 (12)取上清，加入等体积的异丙醇。 (13)4℃静置10min，1小时以上或过夜。 (14)4℃10000rpm 离心5min。 (15)弃上清，并把沉淀溶于10μl buffer III 中。
二、小规模酵母转化 1、酵母转化试剂： 转化用试剂除PEG采用过滤灭菌外，其它试剂均需高温高压灭菌，条件同普通培养基灭菌。 (1)M 醋酸锂（Lithium Acetate） (2)聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）分子量3350，浓度50%（w/v） (3)PEG/LiAc 溶液的配制（现用现配） 800μl 50%PEG 100μl 10×TE 100μl 10×LiAc 1ml 总体积 (4) 1.1×TE/LiAc溶液（现用现配）11ml 10×TE (5)11ml 10×LiAc (6)78ml ddH20 2、操作步骤： (1)第一天下午3点将酵母接种于5ml YPDA中，30℃摇菌。 (2)第二天上午10点测OD600，转2.5×108个于50ml YPAD中。 (3)下午3:00收集菌体。 (4)室温离心，700g，5min。 (5)弃上清，用60ml 灭菌ddH20重悬细胞。 (6)室温离心，700g，5min。 (7)弃上清，用3ml 1.1×TE/LiAc 重悬细胞。 (8) 1.5ml/管分装细胞。 (9)12000rpm离心15-30s。 (10)弃上清，每管加入600μl 1.1×TE/LiAc重悬细胞，100μl分装到1.5ml管中。 (11)冰上准备转化混合物(与收集菌体同步进行)： PEG3350 (50%) 240μl LiAc (1.0M) 36μl Carrier DNA (10mg/ml) 10μl
酵母双杂交实验
酵母双杂交相关实验方法 1、酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法） 1、酵母质粒提取试剂 Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol 0.1mol/L EDTA Buffer II 50mM/L Tris 20mM/L EDTA Buffer III 10mM/L Tris 1Mm/L EDTA 2、操作步骤： (1) 收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶 （30mg/ml）。. (2) 37℃水浴1h。 (3) 10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。 (4) 加入25μl 10% SDS，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一 次。 (5) 加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。 (6) 4℃12000rpm离心15min，取上清。 (7) 在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小 时以上。 (8) 取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。 (9) 加入150μl buffer III 溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽 提。 (10) 12000rpm离心15min。 (11) 将上清转入新的离心管中，加入6μl(10U/μl)RNA酶 37℃放 置30min。
(12) 取上清，加入等体积的异丙醇。 (13) 4℃静置10min，1小时以上或过夜。 (14) 4℃10000rpm 离心5min。 (15) 弃上清，并把沉淀溶于10μl buffer III 中。 2、 小规模酵母转化 1、酵母转化试剂： 转化用试剂除PEG采用过滤灭菌外，其它试剂均需高温高压灭菌，条件同普通培养基灭菌。 (1) M 醋酸锂（Lithium Acetate） (2) 聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）分子量3350，浓度 50% （w/v） (3) PEG/LiAc 溶液的配制（现用现配） 800μl 50%PEG 100μl 10×TE 100μl 10×LiAc 1ml 总体积 (4) 1.1×TE/LiAc溶液（现用现配） 11ml 10×TE (5) 11ml 10×LiAc (6) 78ml ddH20 2、操作步骤： (1) 第一天下午3点将酵母接种于5ml YPDA中，30℃摇菌。 (2) 第二天上午10点测OD600，转2.5×108个于50ml YPAD中。 (3) 下午3:00收集菌体。 (4) 室温离心，700g，5min。 (5) 弃上清，用60ml 灭菌ddH20重悬细胞。 (6) 室温离心，700g，5min。 (7) 弃上清，用3ml 1.1×TE/LiAc 重悬细胞。
酵母双杂交
酵母双杂交 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。 1、基本思想 酵母双杂交由Fields在1989年提出.他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究.GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域.位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）和位于C端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain,AD).DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)，并与之结合.而AD则是通过与转录机构（transcriptionmachinery）中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录.DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录. Fields建立了一个双杂交系统，BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，使GAL4两个结构域重新构成，则会启动特异基因序列的转录.他们利用Snf1与Snf4的相互作用，将Snf1与BD融合，Snf4与AD融合，构建在穿梭质粒上.其中Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4是他的一个结合蛋白.研究者将二种穿梭质粒转化酵母GGY：171菌株，该菌株含有LacZ报告基因，并已去除相应转录因子基因.该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录.一般地，将BD-X的融合蛋白称作诱饵（bait),X往往是已知蛋白，AD-Y称作猎物（prey），能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因，通过对报告基因的检测，反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用. 2、基本原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的（modular）,即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域（DNA binding domain，简称为BD）和转录激活结构域（activation domain，简称为AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。两个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。单独的BD虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的BD与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。主要有二类载体：a含DNA-binding domain的载体；b含DNA-activating domain的载体。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd）；另一个蛋白的基因融合到转录激活结构域（如GAL4-ad，VP16）。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动