植物抗病基因在进化中形成了几种共有的进化形式
植物抗病基因在进化中形成了几种共有的进化形式。植物祖先抗病基因的复制创造了新基因座。基因间和基因内重组导致了变异，也导致了新特异性抗病基因的产生。另外，与特异性识别相关的富含亮氨酸重复区顺应于适应性选择。同样，类转座元件在抗病基因座中的插入加速了抗病基因的进化。随着抗病基因的进化，抗病反应也呈现出多样化，代表着植物与病原物动态进化的不同阶段。
几种抗病基因进化模式得到提出。重复拷贝对创造新的抗病基因起着重要的作用。抗病基因的复制与随后序列的差异性能创造或扩大基因家族中另一基因簇。不对等重组与基因转化（基因内）创造了基因数量上的多样性。基因外重组与基因转化能创造新的特异性抗病基因。而有的这些重组事件发生在高保守区域上。LRR区域的多态性为识别、配位及防卫大量病原物提供了进化优势。转座元件插入到某些抗病基因座中造成基因断裂或染色体重排，加速了抗病基因的进化。基因座内的过多重组将导致抗病基因特异性丧失，而寄主植物与病原物不断相互作用——双方相互施加压力并不断适应与反适应于选择压力，进行着协同进化，那么抗病基因就必须维持着序列的特异性。实际上，抗病基因的进化是基因变异与基因序列保守性之间的平衡。在抗病基因不断进化的推动下，抗病基因控制下的抗病反应表现出多样化（如过敏性反应、非过敏性反应、系统过敏性反应以及极度抗病等），不同类型的抗病反应代表着植物与病原物动态进化的不同阶段。有关与抗病基因的进化研究还存在一定困难，涂礼莉等人借助其他物种已获得的信息，利用生物信息学的方法来研究海岛棉抗病基因的抗病机制及抗病基因进化。这种研究方法可能也适用于其他农作物，可以说对抗病机制的研究、抗病基因的转育及抗病基因进化的研究具有重要的意义。
近年来抗性基因研究的突破性进展、抗性基因的克隆和序列分析所揭示的其编码蛋白的组
成、拓扑学和亚细胞定位等特征,为揭开抗性基因的作用特点提供了线索。一般来讲,基因克
隆的策略可分为两种:正向遗传学途径和反向遗传学途径。前者以欲克隆的基因所表现的功
能为基础,通过鉴定其产物或某种表型的突变进行,如功能克隆( Functional Cloning) 和表
型克隆( Phenotype Cloning) ;后者则着眼于基因本身特定序列或者在基因组中的特定位
置进行,如定位克隆( Positional Cloning) 和序列克隆( Sequence Cloning) 。
一、抗病基因克隆的方法
（一）功能克隆
功能克隆即已知基因编码产物的克隆方法。当目的基因序列未知,但其编码产物的生理生化及代谢途径研究得比较清楚时,就可以采用这种克隆方法。功能克隆根据克隆基因的原理又可分为两条路线,一条是分离纯化已知的蛋白质或多肽,制备该蛋白的特异抗体,利用标记的特异蛋白抗体作为探针筛选由表达型载体建立的基因组文库或者cDNA文库,通过免疫杂交筛选到重组克隆,并最终克隆目的基因;第二条路线是将蛋白质纯化后测定其N 端一段氨基酸序列,根据蛋白质密码子编码规律和密码子偏爱原则,反向推算出mRNA序列,然后据此人工合成一段寡核苷酸作探针,利用同位素或其它方法标记后筛选一般的基因组文库或cDNA 文库,筛选阳性重组克隆,并最终克隆目的基因。
随着植物抗病反应的深入研究及蛋白质分离纯化技术的发展,相信功能克隆的策略会发挥重要作用,但一部分抗病基因的产物及表达调控特性尚不清楚,因此在一定程度上也限制了该策略的应用。
（二）定位克隆
定位克隆技术是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法,目标基因精确定位在染色体特定位置之后,用目标基因两侧紧密连锁的标记筛选含有大的插入片段的基因组文库(如BAC和YAC) ,通过染色体步行筛选到含有目标基因的克隆,最后通过遗传转化和功能互补实验进行验证。其核心任务是染色体步行,如果能找到与目标基因很近的标记,以至于二者之间的距离小于基因组文库中克隆的平均插入片段大小,就可以直接筛选到含有目标基因的克隆,最终得到候选基因,这种策略称为染色体登陆。
到目前为止,利用定位克隆策略,单基因性状相关基因的鉴定方法已较完善且取得了一个系列成果,已使几十种重要的基因得到了分离。但定位克隆技术需要寻找与目标基因座位连锁
的遗传标记或部分功能信息。有时需连锁作图,较费时费力。而且在植物的基因组中,大量存在DNA 重复序列经常是染色体步移难以逾越的障碍。
（三）序列克隆
序列克隆即已知所克隆基因序列或同源基因的序列时采用的方法。这种情况下,可以从DNA 序列数据库(如GenBank 数据库) 中查找有关基因的序列,然后可以设计并合成一对寡核苷酸引物,提取所要分离基因的植物染色体DNA 或者用RNA 在逆转录酶的作用下合成cD NA 的第一条链,以此为模板,采取PCR 或RT-PCR 的方法来克隆基因。扩增的片段经纯化后,连接到合适的载体上,经酶切和序列分析并与已知的基因序列作比较。
此方法简便快速,国内利用此方法已经克隆了豌豆外源凝集素基因。有时要从其他的种、属中克隆同源基因时,可以先比较序列已知的基因序列,寻找比较保守的区域,根据此区域的序列设计并合成探针,然后从cDNA 文库或者基因组文库中筛选到目的基因的克隆。如利用酵母菌乙酰乳酸合成酶的基因序列,已从烟草和拟南芥中克隆出抗除草剂的乙酰乳酸合成酶基因。Payne G. 等根据烟草中酸性几丁质酶和碱性几丁质酶的氨基酸序列C 端的同源率为65 % ,以已知的碱性几丁质酶的核酸序列为探针,从烟草的cDNA 文库中筛选了两种酸性几丁质酶的基因PR-P 和PR-Q。
（四）表型克隆
表型克隆是与定位克隆相对的一种克隆基因的策略,它是对因突变而导致的某一特殊表型的目的基因直接进行克隆。1995 年Weissman 在前人的工作基础上首先提出了表型克隆的概念,由于它能较好地解决定位克隆策略所遇到的困难,因此被称作是分子遗传学观念上的
一次革新。它可对因突变而导致的某一特殊表型的目的基因直接进行克隆分析并分离该基因,而不必事先知道其生化功能及在染色体上的精确位置,也不需知道假设基因的数目或其作用方式,将表型与基因结构或基因表达的特征联系起来从而分离特定表型相关基因。表型克隆
与定位克隆相比,省去了用大量遗传标记进行定位分析的繁琐程序,可较容易地检测基因组之间差异或相同区域,大大加快基因克隆的速度。
二、应用较多的几项技术
（一）鸟枪克隆法（Shotgun Cloning）
该方法是随机切割供体基因组DNA ,再转化到受体基因组中,根据对转化子的表型鉴定,然后找出所需克隆的基因,鸟枪克隆战略成功地应用于分离细菌的无毒基因。Staskawica B. J . 等利用这一策略,从大豆病原菌Pseudomonas Syringae pv.Glycinea中克隆到了它的无毒基因。但是在高等植物中,由于基因组很大,因而应用这种方法克隆基因非常困难。例如,如果将此方法应用于番茄的抗病基因筛选,需要以双元载体构建抗病品种的基因文库,然后通过农杆菌等将它们导入感病品种之中,然后筛选抗病转化体来分离抗病基因。但这样鉴定一个单拷贝的基因,需要筛选105株转基因植株,工作量非常大。
(二) 消减杂交法（Subtractive Hybridization）
消减杂交法是利用DNA复性动力学来富集一个样品中有，而另一个样品没有的DNA。消减杂交可以是cDNA 。用来寻找两样品中差异的基因，也可以是基因组DNA，用于样品中特异存在的基因。其方法是将过量的driver DNA和样品中的目的DNA退火，然后复性，样品中的共同序列形成双链，而目的DNA序列大多数为单链。用羟基磷灰石柱或者生物素标记结合等方法不断除去双链DNA序列。经过多轮变性和复性，样品中的特异性目的DNA 序列得以富集，或者用PCR进行体外扩增。通过遗传学分析验证富集的克隆DNA。负性杂交法比其他基因克隆法省时省力。但目前还不能用于复杂的基因组植物的抗病基因克隆。（三）转座子标签法（Transposon Tagging）
就植物抗性基因的克隆工作来讲,转座子标签技术( Transposon Tagging) 可能是应用最为普遍的一种方法。它是利用转座子来克隆基因的技术,其显著特点是可以分离预先不清楚表达产物的基因。其基本原理是:当转座子插入到植物基因组中某个基因或者基因的邻近位点
时,会破坏该基因的结构,引起基因突变使植物表型发生变异,因此可以用转座子作为探针从被标记的突变体植物的基因文库中, 克隆出突变的基因,然后再利用突变基因作为探针从野生型植物中克隆出野生型基因。
（四）图位克隆法(Map - based cloning)
图位克隆法是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法,在目标基因精确定位到染色体的特定位置以后,运用与目标基因紧密连锁的分子标记筛选含有目标基因的大片段基因组文库(BAC或YAC) ,再通过染色体步行筛选到含有目标基因的亚克隆,最后通过遗传转化和功能互补实验进行验证。图位克隆法是以高密度的分子标记图谱为基础,其关键是寻找与目标基因紧密连锁的分子标记,核心任务是染色体步行。但是对于基因组较大,重复序列较多的一些植物,采用该方法分离克隆抗病基因不仅投资大而且效率低,因此,该方法也受到一定的限制。
除了上面介绍的几种技术，在植物抗病基因克隆工作上还会用到的有: DNA 转染法(DNA Transfection) 、代表性差异分析技术(Representational Difference Analysis) 、mRNA 差异显示(mRNA Differential Display) 、抑制消减杂交法(Suppression Subt ractive Hybridi zation)、产物导向法、插入诱变法、作图克隆法等。
将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。人们常说的"遗传工程"、"基因工程"、"遗传转化"均为转基因的同义词。经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为"遗传修饰过的生物体"（Genetically modified organism，简称GMO）。
转基因植物：
优点是开发周期较动物短；种子易于保存；易于放大；表达量高；基因结构清楚；无植物病毒影响人类；生产费用低。
转基因植物的生态风险
转基因植物在减少化学农药对环境的影响、提高作物产量、改善品质和保持水土等多方面具有潜在优势。转基因作物的应用为农业生产带来了一次新的革命，但以重组DNA技术为代表的现代生物技术在带来巨大利益和效益的同时，也可能对人类健康和生态环境安全造成不必要的负面影响。目前，国际上对转基因植物及其产品的安全性评价主要涉及3个方面：一是受体植物安全性风险，即导入的外源基因及其产物对受体植物是否产生不利影响；二是生态环境安全性风险，即转基因植物的使用带来的直接或间接的生态影响；三是毒理安全性风险，主要指以转基因植物为原料的产品(食品、饲料)和其他方面的安全性。现就转基因植物的生态安全性风险进行阐述。
1 目标害虫对转基因植物的抗性
自然界生物间的协同进化或生物与非生物抑制因子问的对抗可能出现适应或被淘汰的结果。根据协同进化理论，转基因抗病虫作物的应用也将会面临目标病虫害对抗性植物的适应和产生抗性的问题。通常选择压力越大，害虫抗性产生得越快。以转Bt基因为例，Bt毒蛋白在植物各营养器官中的表达通常是高剂量的持续表达，因此提高了对害虫的选择压力，可能促使害虫对Bt作物产生抗性，从而削弱Bt 作物的经济效益和优势。希望通过制备转不同Bt基因的植物来延长害虫抗性的产生并不可行，因为害虫普遍存在多重抗性和交互抗性。此外，抗虫转基因作物的大量种植，还可能发生目标害虫的“行为抗性”和寄主转移现象。一方面害虫可能区分Bt毒蛋白在植株不同部位的表达量，从而选择性地取食Bt毒素含量较低的部位，提高种群的存活率；另一方面，如果目标害虫寄主植物来源较广，在不适口的情况下转移至非转基因作物上危害。目前尚无证据表明靶标害虫对转基因植物产生抗性，Wu等对我国华北棉田棉铃虫抗性的长期监测(1994～2002)表明，自1997年推广 Bt棉以来，Bt棉田棉铃虫对Bt的抗性未见显著提高，由于化学农药使用量减少，Bt棉田棉铃虫对高效氯氟氰菊酯、辛硫磷和硫丹的抗药性甚至大大降低。尽管如此，国际上普遍提倡通过转基因植物种子和非转基因种子混合播种、提供非转基因作物庇护所、种植替代寄主植物或提高自然植被多样性等策略，预防和应对目标害虫对转基因植物产生抗性。
2 转基因植物对非目标害虫的毒性及其寄主嗜好性的影响
转基因植物本身及其转入基因编码产物不仅会对目标生物起作用，还有可能会对非目标生物产生直接毒性作用，或通过食物链和食物网对非目标生物产生间接影响。这方面的评估指标通常包括非目标生物的生物学特性指标，如：发育历期、繁殖力、体型、控害效能等。室内研究表明，Bt玉米品种“176”的花粉对菜粉蝶(Pieris rapae)、大菜粉蝶(Pieris brassicae)和小菜蛾(Plutella xylostella)的生长和存活均具有显著的不利影响。转Bt基因棉对棉蚜(却his gossypii)的发育和繁殖没有不利影响，但转Bt和CpTI的双价抗虫棉短期内会对棉蚜产生不利影响，l一2代棉蚜的存活率降低，繁殖期缩短，寿命延长，对第3代棉蚜则未见显著不利影响。在田间，由于转基因作物对目标害虫具备很强的针对性，目标害虫的种群数量下降，导致生物群落中种与种间竞争格局发生变化，某些非目标害虫由于其较强的适应性而成为主要害虫。例如，Bt棉田由于施用化学农药防治棉铃虫的次数减少，棉盲蝽(Lygus lucorum)和Adefphocoris spp．的为害加重；对棉蚜种群的影响在不同调查年份和地点并不一致，二点小绿叶蝉(Amrasca biguttula)、三叶斑潜蝇(Liriomyza trifolii)、烟粉虱(Bemisia taba— ci)、稻绿蝽(Nezar viridula)、棉红蝽(Dysdercus koe— nigii)和尖筒象(Myllocerus undecimpustulatus)的为害则与对照无显著差异。
3 转基因植物对有益生物及天敌的影响
种植转基因植物不仅要控制靶标害虫，而且必须与天敌协调共存，才能融人有害生物综合治理(IPM)体系。转基因植物的大面积推广，其花粉对家蚕等经济昆虫和传粉蜂类的潜在影响受到关注。此外，转基因植物的环境释放，有可能通过基因水平转移、根系活性分泌物改变和残体中生化成分的改变来影响土壤动物和微生物区系的组成和结构，进而影响整个土壤生态系统的功能。
对天敌的生态毒性。转基因抗虫植物表达的杀虫蛋白不仅作用于目标害虫，也必然影响到非目标害
虫和天敌的生活力。这些影响包括转基因作物表达的毒蛋白或改性蛋白对天敌存活和发育的直接毒害或通过害虫对天敌产生的间接毒害，天敌对转基因作物上的目标害虫行为／生理／生殖的反应，天敌种类及种群数量的变化，天敌群落结构和种群动态的变化等。针对捕食性天敌，多数研究表明取食了转基因作物的植食性昆虫猎物对捕食性昆虫的个体生长发育、生殖、捕食行为等特性均无不良影响；转基因植物花粉和汁液对捕食性天敌没有直接毒性。但也有研究表明转基因抗虫植物对捕食性昆虫生物学特性产生不利影响，如：取食Bt玉米的害虫对普通草蛉(Chry- soperla carnea)幼虫具有毒害作用，使其发育时间延长、死亡率增大；龟纹瓢虫(Propylaea japonica)幼虫取食Bt棉上的棉蚜，成虫的畸形率上升；取食用Bt棉饲养的斜纹夜蛾初孵幼虫，龟纹瓢虫1龄幼虫体重低于对照，较少发育至2龄。针对寄生性天敌，部分研究表明取食了转基因植物的植食性昆虫寄主对寄生性昆虫的个体寄生、发育、行为等产生不良影响；也有研究表明转基因植物或其产物对寄生蜂生物学特性无不良影响。
对天敌种群和群落的影响。迄今，多数研究表明转基因作物对田间捕食性天敌和寄生性天敌种群数量或群落组成的影响较小，对天敌的生态功能也未见显著影响；但也有研究表明，转基因作物田天敌群落发生显著变化，如：转Bt基因玉米田和转Cry3A基因马铃薯田的步甲数量均明显少于常规作物田；转Bt基因棉田龟纹瓢虫等捕食性天敌与寄生蜂的种群数量下降，天敌亚群落的多样性显著降低。
对经济昆虫的影响。家蚕(Bombyx mori)和柞蚕(Antheraea pernyi)是我国的重要经济昆虫，与Bt 作物的靶标害虫同属鳞翅目。Bt作物的花粉会飘落到柞树或桑树上，特别是我国南方养蚕地区的传统作物种植模式是桑稻间种，所以，Bt作物的大面积推广可能会对这两种经济昆虫造成不良影响。研究表明，转CrylAb基因水稻在我国南方养蚕地区推广可能对家蚕的生长发育产生负面影响；转 CrylAc基因棉花、转CrylAc和CpTI基因棉花和转 CrylAb基因玉米的花粉对家蚕发育和产卵均无显著影响，且无明显的剂量效应；转基因棉花花粉对柞蚕1—3龄幼虫的发育及取食也无显著影响。
对传粉昆虫的影响。自然界75％一85％的显花植物是虫媒花，一些转基因植物需要蜂类传粉，或可作为传粉昆虫的食物来源。随着转基因植物种类的增加和种植面积的迅速扩大，蜂类等传粉昆虫受影响的可能性也越来越大，特别是抗虫转基因植物对传粉蜂类的影响。目前，转基因植物对蜂类的安全性评估已在不同层次展开。实验室层次上的研究表明，某些种类的PIs(如POT、BPTI、sB． TI、BBI)会对蜂类的生存、中肠蛋白酶活性和嗅觉学习行为等产生不良影响；Bt棉的花粉对蜜蜂工蜂无急性毒性作用，工蜂的寿命和过氧化物酶活性也未受显著影响；抗性转基因植物对蜂类间接影响的研究集中于转基因植物对蜜蜂取食偏好性的影响，目前未发现转基因植物对蜜蜂取食行为产生显著影响。半大田层次的试验则多未发现负面影响。根据现有研究，转基因植物对蜂类的影响与转基因植物的生物学特征、目的基因的类型和性质、转基因在植物不同部位的表达特异性及表达量等密切相关。
对土壤微生物的影响。转基因植物对土壤微生物的直接影响取决于转基因植物产生的外源蛋白质的作用范围及其在土壤环境中的积累量。由于外源基因的导入和表达，转基因植物的代谢、生理生化性质及根系分泌物组成可能产生变化，这些变化将对土壤微生物产生间接影响。目前国内外这方面的报道较少，结论也不一致。如：用 T4一溶菌酶基因转化的转基因抗细菌病害马铃薯对土壤中的好氧微生物总量和有益微生物数量均无显著影响；Bt棉可提高土壤中细菌和真菌的数量；不同生育期Bt棉根际微生物的数量与对照差异不显著；Bt水稻田土壤中真菌数量提高，细菌数量显著降低，放线菌数量没有显著变化； Bt水稻对土壤中反硝化细菌和产甲烷细菌种群有显著抑制作用，对厌氧发酵细菌种群有显著刺激作用，对厌氧固氮细菌种群有一定刺激作用；种植转基因番茄的土壤中微生物的数量和种类产生一定变化，但土壤的总DNA及菌株DNA中均未检测到外源基因扩增产物。可见，由于目前此类研究报道中转基因植物种类、考察的微生物种类和研究方法不同，结果也不相同，因此难以分析、比较并得出明确结论。转基因植物的推广种植品种趋于多样化后，对土壤微生物区系的的影响也有待研究。
对土壤动物的影响。土壤动物功能群在土壤物质转化及养分释放中起着重要作用，可反映不明污染
物在生态系统中造成的影响。土壤微生物的变化可影响到土壤动物的数量和分布。近年来已发现转基因植物会影响土壤动物群落。如：Bt玉米影响土壤弹尾目昆虫的繁殖率；转GNA和 Con A基因马铃薯降低土壤微生物和原生动物的活性；转基因烟草(蛋白酶抑制剂I)增加土壤线虫的密度，导致土壤动物群落和植物残留物分解的改变；Bt棉提高土壤线虫和分解者的密度；转几丁质酶和葡聚糖酶基因水稻可降低弹尾目昆虫Fol— somia candida和线蚓(Erichytraeus crypticus)的密度，提高弹尾目Sinella curviseta的密度，对Folsomia．fimetaria则无显著影响。这方面的研究报道尚少，转基因植物对土壤动物区系的影响有待深入研究。
4 转基因作物对生物多样性及环境生态系统的影响
在生态环境中稳定下来的转基因作物，可能会在生态系统中通过食物链产生累积、富集和级联效应。转基因作物由于有较强的针对性和专一性，会使生物群落结构和功能发生变化，一些物种种群数量下降，另一些物种数量急剧上升，导致均匀度和生物多样性降低，系统不稳定，影响正常的生态营养循环流动系统。转基因植物对生物多样性和生态系统的影响可能是微妙的、难以觉察的，需要长期的监测和研究。目前影响较大的相关报道有：美国黑脉金斑蝶事件、墨西哥玉米受污染事件、加拿大抗除草剂油菜事件、抗除草剂作物由于大量使用草甘膦除草剂对微生物群落产生负面影响等，现举例如下：“黑脉金斑蝶”事件。Losey等报道Bt玉米的花粉对濒危蝴蝶黑脉金斑蝶(Danus plexippus)具有明显毒副作用，推断玉米扬花季节飘落的Bt玉米花粉会对金斑蝶幼虫产生毒性，可能威胁到该物种的生存。这则报道受到强烈置疑，因此美国农业部专门组织了研究团队，在自然环境条件下就Bt玉米花粉对黑脉金斑蝶的潜在影响进行了全面评价，结果表明，综合考虑玉米田黑脉金斑蝶的比例、玉米扬花期与幼虫易感时期的重叠和Bt玉米的种植率，目前已商业化的大多数Bt玉米花粉对黑脉金斑蝶种群还不会构成威胁k a9j。但Losey等极端条件下的试验结果也为我们敲响了警钟。
墨西哥玉米受污染事件。2001年9月墨西哥政府报告Oaxaca州的玉米受到一种未被批准在墨西哥种植的Bt玉米基因的污染，在该州22个村庄的玉米样品中，15个村庄的样品污染率达3％一10％。由于墨西哥是玉米的起源中心，玉米种质资源特别丰富，且野外分布有多种能与玉米自然杂交的亲缘野生种——玉米草，因此该事件引起全球极大关注。此后美国科学家在Nature上报道了墨西哥玉米受到基因污染的分子证据。可见，墨西哥偏远地区的本土玉米品种无疑已经受到转基因的污染。
5基因漂移及杂草化问题
转基因植物可能通过与野生植物异种交配而使转基因植物中的目标基因进入野生植物。发生基因漂移需要具备两个条件：一是该转基因植物可以与同种或近源种植物进行异花授粉；二是这些同种或近源种植物与该转基因植物在同一区域种植，而且转基因植物的花粉可以传播到这些植物上。根据这两个条件，转基因玉米、甜菜、油菜及一小部分转基因水稻有可能产生基因漂移。基因漂移的后果是产生适应性或竞争力更强的品种，从而导致自然生态系统或农业生态系统的失衡。如果转基因植物中外源基因表达的是提升植物繁殖优势的特性，如抗除草剂、抗霜冻、延长种子在土壤中的活性时间、调剂花期、调节植物固氮能力等特性，则更可能发生这种生态系统的失衡。如果转基因植物可使野生植物具有抗虫特性，则可影响野生植物所维持的昆虫自然种群数量和群落结构，威胁某些生物的生存。如果基因流发生在转基因作物和生物多样性中心的近缘野生种之间，则可能降低生物多样性中心的遗传多样性；如果这种基因流发生在转基因作物和有亲缘关系的杂草之间，则可能产生难以控制的杂草。。这方面最引人注目的是前文所述的墨西哥玉米受污染事件。此外，有研究表明，把耐除草剂的转基因油菜籽和杂草一起培育可产生耐除草剂的杂草；转Bt和CpTI水稻与非转基因水稻间的基因流频率较低(<1％)，但转基因水稻的高密度种植，可增加其与非转基因水稻异型杂交的概率；抗除草剂基因可由转基因小麦转移至临近的圆柱山羊草(Aegilops cylindrica)，且自然变异频率低的品系通过杂交发生基因漂移的风险更大。可见通过转基因技术产生的基因可扩散到自然界中去，现有的风险评估方案即便设计得很完善，也可能
低估转基因植物基因漂移的实际风险。此外，有预测模型表明，虽然抗除草剂作物基因漂移的频率很低，高效除草剂的频繁使用将促使转基因作物成为难于控制的先锋植物，并不利于保持转基因作物的抗性水平。
此外，转基因抗病毒植物可能通过重组过程产生新的植物病毒株系。基因重组在生物界普遍存在，当一种非目标病毒侵入转基因抗病毒植物的细胞，入侵病毒就可能与植物中的外套蛋白基因(Coat protein gene)进行部分遗传物质的交换，从而产生新病毒，这对自然生态系统的风险难以估量。
6应用转基因作物后植保费用的变更
目前应用的大多数抗虫转基因植物所使用的目的基因为苏云金芽孢杆菌毒素基因，不同的毒素基因分别具有高度专一性，只能作用于其靶标害虫。由于转基因抗虫植物的应用，对目标害虫的田间用药量将会大幅度下降，可能导致次要害虫种群增长，进而增大农药的使用量，降低转基因植物的预期经济和环境效益。根据环境影响系数(EIQ，一种基于促成某一独立活性成分对环境产生净影响的不同因素的复合测量方法)的测算，1996～2004年间，由于转基因作物的推广种植，全球杀虫剂累计减少量为172 500 Mt的活性成分，相当于作物用杀虫剂对环境的破坏作用降低了14％。
7 结语
综上所述，转基因植物是环境安全农业的一个重要组成部分，为保证转基因植物的可持续利用，有必要密切关注转基因植物的生态安全性，这方面的关键问题包括：(1)目标害虫对转基因植物抗性发展预测和监测、抗性治理和延缓策略；(2)转基因作物对非目标生物的潜在急性和慢性毒性效益，转基因作物系统中天敌和其他生物种群数量和群落结构的变化及其保护利用对策；(3)耐除草剂转基因植物中的目标基因在农田生态系统中发生漂移的频率预测和监控技术；(4)转基因作物中非目标次要害虫的种群发展趋势及其综合治理对策；(5)特定化学农药使用量增大可能带来的生态效益评价；(6)转基因植物对生物多样性和生态系统结构的影响评价和长期监测。
植物的病原物有很多，不同的病原物致病机制不同。
比如真菌里面卵菌中的某些种，他们通过游动孢子与植物表皮细胞接触而逐渐形成附着孢，
附着孢产生强大的膨压将游动孢子里面的物质“挤”植物细胞，在植物细胞内形成附着器吸收
植物细胞营养，进而导致植物出现病症。
大多数植物病原细菌通过外界条件如风雨等传播，进入植物的伤口、气孔或是蜜腺中，通过
鞭毛（或是其他）与植物识别，进而将自身的遗传物质传递给植物，在植物体内大量繁殖，
是植物产生病症。
病毒的致病过程有几点：大多数植物病毒依赖介体传毒，其中主要是昆虫介体。比如灰飞虱
传播的RSV。首先灰飞虱在感染病毒的水稻上取食将RSV病毒带进体内，RSV随着灰飞
虱的体液循环进入淋巴细胞，并进行大量复制，之后随着带有病毒的灰飞虱侵染健康的水稻
而将将RSV传递，当然也可卵传。RSV很轻松的进入有伤口的水稻细胞中，并依赖其养分
自我繁殖。导致水稻出现矮缩病状。
线虫的致病过程主要有三点：一是机械损伤，线虫的口针对植物细胞会造成破坏；二是唾液
腺体有害的物质的释放，线虫通过口针将自身体内有毒物质释放到植物细胞内部；三是与其
他病原物共危害。从而使植物致病。
其他病原如寄生植物（菟丝子等等），其致病过程也不同。
植物病原物的致病性是个非常重要的研究方向。虽然很多研究阐述了各种致病机理，但科学的路是循序渐进的过程，新技术的发展会给研究工作带来新的视野。
诺禾致源高分文章集锦-植物基因组
陆地棉基因组测序揭示四倍体棉进化与纤维发育机制Sequencing of allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum L. acc. TM-1) provides a resource for fiber improvement 研究对象：陆地棉遗传标准系TM-1 期刊：Nature Biotechnology 影响因子：41.514 合作单位：南京农业大学 发表时间：2015年4月 摘 要 Upland cotton is a model for polyploid crop domestication and transgenic improvement. Here we sequenced the allotetraploid Gossypium hirsutum L. acc. TM-1 genome by integrating whole-genome shotgun reads, bacterial artificial chromosome (BAC)-end sequences and genotype-by-sequencing genetic maps. We assembled and annotated 32,032 A-subgenome genes and 34,402 D-subgenome genes. Structural rearrangements, gene loss, disrupted genes and sequence divergence were more common in the A subgenome than in the D subgenome, suggesting asymmetric evolution. However, no genome-wide expression dominance was found between the subgenomes. Genomic signatures of selection and domestication are associated with positively selected genes (PSGs) for fiber improvement in the A subgenome and for stress tolerance in the D subgenome. This draft genome sequence provides a resource for engineering superior cotton lines.关键词 陆地棉；de novo；四倍体 研究背景 陆地棉（Gossypium hirsutum L.）隶属锦葵目（Malvales），锦葵科（Malvaceae），棉属（Gossypium），因最早在美洲大陆种植而得名，是世界上最重要的棉花栽培品种，占全球棉花种植面积的90%以上。尽管陆地棉在棉花产业中占据核心地位，但由于其为异源四倍体，相关的全基因组测序工作一直难以开展。来自南京农业大学、北京诺禾致源、美国德克斯大学的国际团队，利用最新测序技术，成功构建了高质量的陆地棉全基因组图谱，为进一步改良棉花的农艺性状提供了基础，同时也为多倍体植物的形成和演化机制提供了新的启示。
植物抗病基因在进化中形成了几种共有的进化形式
植物抗病基因在进化中形成了几种共有的进化形式。植物祖先抗病基因的复制创造了新基因座。基因间和基因内重组导致了变异，也导致了新特异性抗病基因的产生。另外，与特异性识别相关的富含亮氨酸重复区顺应于适应性选择。同样，类转座元件在抗病基因座中的插入加速了抗病基因的进化。随着抗病基因的进化，抗病反应也呈现出多样化，代表着植物与病原物动态进化的不同阶段。 几种抗病基因进化模式得到提出。重复拷贝对创造新的抗病基因起着重要的作用。抗病基因的复制与随后序列的差异性能创造或扩大基因家族中另一基因簇。不对等重组与基因转化（基因内）创造了基因数量上的多样性。基因外重组与基因转化能创造新的特异性抗病基因。而有的这些重组事件发生在高保守区域上。LRR区域的多态性为识别、配位及防卫大量病原物提供了进化优势。转座元件插入到某些抗病基因座中造成基因断裂或染色体重排，加速了抗病基因的进化。基因座内的过多重组将导致抗病基因特异性丧失，而寄主植物与病原物不断相互作用——双方相互施加压力并不断适应与反适应于选择压力，进行着协同进化，那么抗病基因就必须维持着序列的特异性。实际上，抗病基因的进化是基因变异与基因序列保守性之间的平衡。在抗病基因不断进化的推动下，抗病基因控制下的抗病反应表现出多样化（如过敏性反应、非过敏性反应、系统过敏性反应以及极度抗病等），不同类型的抗病反应代表着植物与病原物动态进化的不同阶段。有关与抗病基因的进化研究还存在一定困难，涂礼莉等人借助其他物种已获得的信息，利用生物信息学的方法来研究海岛棉抗病基因的抗病机制及抗病基因进化。这种研究方法可能也适用于其他农作物，可以说对抗病机制的研究、抗病基因的转育及抗病基因进化的研究具有重要的意义。 近年来抗性基因研究的突破性进展、抗性基因的克隆和序列分析所揭示的其编码蛋白的组 成、拓扑学和亚细胞定位等特征,为揭开抗性基因的作用特点提供了线索。一般来讲,基因克 隆的策略可分为两种:正向遗传学途径和反向遗传学途径。前者以欲克隆的基因所表现的功 能为基础,通过鉴定其产物或某种表型的突变进行,如功能克隆( Functional Cloning) 和表 型克隆( Phenotype Cloning) ;后者则着眼于基因本身特定序列或者在基因组中的特定位 置进行,如定位克隆( Positional Cloning) 和序列克隆( Sequence Cloning) 。
植物基因工程实验技术
植物基因工程实验技术
编者: 赵 燕
主审: 张学文
湖南农业大学植物科学实验教学中心
2007 年 4 月
前
言
基因工程是现代生物技术的核心, 也是现代分子生物学研究的重 要手段. 掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业 学生都很重要. 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技 术体系,本实验指导侧重于 DNA 重组操作,将基因工程操作的常用 和核心技术组织起来, 以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基 因工程实验提供简单而明确的指导. 为适应基因工程的飞速发展,一些生物技术公司匠心独运,开发 出专门的试剂盒,使一些复杂的实验操作简单化了.这对于实验者来 说自然是好事,但也使实验者动手胜于用脑.对于实验人员来说,一 定应知其然并知其所以然, 才会在实验中运用自己的知识予以创新性 的发展.期望本实验指导不成为实验中的教条.
编
者
2007 年 4 月
1
目
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 附录:
录
大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存 ...............3 强碱法小量制备质粒 DNA.....................................................5 琼脂糖凝胶电泳......................................................................7 植物总 DNA 的提取,纯化和检测 ........................................9 DNA 的 PCR 扩增................................................................. 11 植物总 RNA 的分离 .............................................................15 RT-PCR..................................................................................17 体外重组分子的构建,筛选及检测.....................................21 植物表达载体的构建,筛选及检测.....................................22 植物遗传转化技术 ................................................................23 实验中常用的仪器与器皿 .....................................................24
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植物与病原菌互作和抗病性的分子机制
中国农业科学 1999,32(增刊):94～102 Scientia A gricultrua Sinica 植物与病原菌互作和抗病性的分子机制3 刘胜毅1 许泽永1 何礼远2 (1中国农业科学院油料作物研究所,武汉 430062;2中国农业科学院植物保护研究所) 提要 概述了近几年在寄主植物抗病基因与防卫反应基因、病原菌毒性基因、寄主抗病性机制和抗病基因工程策略等方面取得的主要进展,重点分析了抗病反应的一般过程、毒性基因 产物胞外水解酶和毒素的作用与关系、作物抗毒素基因工程策略。 关键词 植物;抗病基因;防卫基因;毒性基因;基因工程策略 早在40年代末50年代初,F lo r(1947;1955)在对亚麻和亚麻锈菌互作的遗传规律研究中,提出了基因对基因假说(gene2fo r2gene hypo thesis)〔4,5〕,这标志着对植物与病原菌互作的认识深入到了基因水平,从而为应用分子生物学手段研究植物抗病性奠定了基础。本文概要地综述近几年在寄主植物抗病基因、病原菌致病基因、寄主抗病机制等方面取得的主要进展,并试图侧重分析概括抗病反应的一般过程及毒素的作用与基因工程策略。 1 抗病相关基因 根据基因的作用性质,可把抗病反应过程中起作用的基因分为两类:抗病基因和防卫反应基因。抗病基因是决定寄主植物对病原菌的专化性识别,并激发抗病反应的基因。即按F lo r的基因对基因理论,它与病原菌的无毒基因互补;按Keen(1990)提出的用来解释基因对基因理论分子机制的配体2受体模型〔6〕,它的产物是抗病反应信号传导链的起始组分,即信息链的前端,当它与病原菌的无毒基因直接或间接编码产物互补结合后,启动信号传导激发植物的抗病反应。防卫反应基因是一类在抗病机制中最终起作用的基因,它们的编码产物直接或间接地作用于病原。除此之外,抗病基因和防卫反应基因的区别还有:(1)抗病基因编码产物具有特异性,而防卫反应基因编码产物具有普遍性,即不同的寄主植物中有一套类似的防卫反应基因,如植保素合成链中的酶基因、病程相关(PR)蛋白基因、植物细胞壁成分合成酶基因等。(2)抗病基因产物是植物防卫反应基因表达的直接或间接调节因子。防卫反应基因一般是受病原菌诱导表达的,编码产物比较容易分离的一类基因,而抗病基因是组成型表达的,编码产物不容易分离的一类基因。因此在基因克隆、基因编码产物的结构和功能分析等方面的研究工作中,防卫反应基因均早于抗病基因。所以植物防卫基因既有普遍性,又有特殊性。除有一部分是相似的外,还有一部分是不同的,如对真菌、细菌毒素的解毒基因,因毒素不同而不同。而人工赋予植物的解毒基因则可能更加不同,有动物源的,也有微生物源的。 1.1 抗病基因 接收病原菌信号,启动植物抗病反应信号转导的是植物抗病基因的编码产物,这是分子植物病理学研究寄主植物的重点和难点。自1992年应用转座子标签法分离出第一个抗病基 收稿日期 1999207215
农杆菌介导的植物转基因技术实验指导
农杆菌介导的植物转基因技术 一、实验目的 1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。 2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。 二、实验原理 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将 T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 实验一培养基配制 一、仪器和试剂 1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台 2、药品：Beef extract （牛肉浸膏） 5g/L ，Yeast extract （酵母提取物） 1g/L ，Peptone （蛋白胨） 5g/L ，Sucrose （蔗糖） 5g/L ，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ，Agar （琼脂）1.5g/100ml，MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA （6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif ），链霉素（str ）。 二、实验方法 第一组配制YEB固体培养基 1、配制250mlYEB固体培养基：先称取1.25g Beef extract （牛肉浸膏）； 1.25g Peptone （蛋白胨）；0.25g Yeast extract （酵母提取物）；1.25g Sucrose
（蔗糖）;1g MgS04.7H2O琼脂粉3.75g ;将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取 200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有250ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ）,以免温度过高导致抗生素失效。 4 、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒15ml 培养基，可以倒16个平皿，倒完后打开平皿盖，在紫外灯下照10min,等待培养基凝固，盖上平皿盖，封口备用。 第二组配制YEB液体培养基 1、配制500mlYEB液体培养基：先称取2.5g Beef extract （牛肉浸膏）;2.5g Peptone （蛋白胨）; 0.5g Yeast extract （酵母提取物）; 2.5g Sucrose （蔗糖）; 2g MgSO4.7H2O将上述药品置于500ml三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至500ml，用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ），以免温度过高导致抗生素失效。 4 、分装：将培养基分别分装到试管和三角瓶中，每个试管中分装5ml，分 装12个试管。每个三角瓶中倒入35ml，共12个三角瓶。 5、分装好后，封口备用。 第三组配制MS液体培养基 1、配制500mlMS液体培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS 粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后混匀定容至500ml,用NaOH 调pH=5.8。
进化基因组学研究进展
研究进化基因组学进展 摘要：进化基因组学是利用基因组数据研究差异基因功能、生物系统演化、从基因在水平探索生物进化的学科。随着近年来基因组数据的不断增加，进化基因组学得到了长足的发展。进化基因组学主要包括从基因组水平理解和诠释生物进化和新基因分析研究探索两方面的内容。本文介绍了进化基因组学研究的主要内容和较为常用的方法，以及近年来在细菌、酵母、果蝇进化基因组学方面的研究进展。 关键词：进化基因组学系统进化比较基因组学新基因 正文 随着基因测序技术的不断进步以及基因组学的飞速的发展，人们积累了大量的基因组学数据，利用所得的大量的基因组数据与进化生物学相结合，在基因组水平研究生物进化机制，随即产生了进化基因组学。 近年来进化基因组学取得了长足的进展，在研究差异基因功能、生物系统演化、从基因在水平探索生物进化的终极方式等方面有重大突破，对人类理解生命现象和过程有重要作用。 研究系统进化学通常包括两个关键步骤：一方面，在不同物种中鉴定同源性特佂，另一方面利用构建系统进化树的方法比较这些特征，进而重新构建这些物种的进化历史[1]。针对这两个关键步骤，传统系统进化学，常采用基于形态学数据和单个基因研究的同源性状鉴定和重建系统进化树（常包括距离法、最大简约法、概率法）[1]的方法来研究。在目前拥有丰富基因组数据的条件下，我们可以分析基因组数据，利用进化基因组学研究系统进化。 一、目前进化基因组学的研究内容主要集中于两个方面：（1）在比较不同生物的基因数据的基础上，从基因组水平理解和诠释生物进化；（2）通过对新基因的分析研究探索基因进化过程的规律两个方面。在进行全基因组进化分析方面，进化基因组学主要集中于构建系统进化树、研究基因组进化策略、研究生物功能变化和进化机制、进化和生态功能基因组学、基因注释的等方面；在新基因方面
植物抗病基因研究进展
植物抗病基因研究进展 摘要:植物抗病基因的研究是目前植物病理学科的热点及难点之一。近年来，通过基因工程技术培育抗病毒植物已经成为抵抗植物病毒的有效手段。本文简要讨论了近年来植物抗病毒基因工程的方法策略, 并对植物抗病基因工程的研究取得的成绩、存在的问题及展望进行了简介。 关键词植物病毒、抗病基因、基因工程、前景 一、植物抗病基因工程原理 植物抗病基因工程指的是用基因工程（遗传转化）的手段提高植物的抗病能力，以此获得转基因植物的方法。植物抗病基因工程主要包括：抗病及其他相关基因的分离和克隆、与合适的载体及标记基因构成适于转化的重组质粒、用不同的转化方法向受体植物导入重组质粒、筛选转化因子并鉴定转基因植株。此外，还有一种可以获得抗病转基因植物的方法即把具有抗病能力的植物或微生物的DNA 直接导入受体植物，从后代中筛选具有抗病能力的个体，经过稳定转化得到转基因抗病植株。 植物病毒每年给世界各地的农作物生产造成严重损失，每年全世界的农作物因病毒侵害的损失数百亿美元，传统的防治方法已远远无法满足现代农业的生产要求。病毒侵染之所以复杂，在于一方面病毒的高突变率所致的植物抗病品种抗性丧失速度远高于常规植物抗病育种速度；另一方面病毒在隐症野生植物中的储存；第三，无亲缘关系的病毒复合侵染以及病毒侵染的持久性，特别是以线虫和真菌传播的植物病毒能在土壤中存活许多年。因此，在适宜病毒介体生长的温度条件下，大面积连作缺乏抗病基因的植物，造成的经济损失会更高。Hamilton[1]于 20 世纪 80 年代初首先提出了基因工程保护的设想，在转基因植物中表达病毒基因组序列可能是防御病毒侵染的途径之一。近 20 多年来，基因工程的发展，为防治病毒病开辟了新途径。 二、利用非病毒来源的基因策略 1.植物自身基因介导的病毒抗性 一些植物在病毒侵染的时会启动主动防御机制，最普遍最常见的主动防御机制就是通常所说的过敏反应，也就是那些最初被病原侵染点周围的细胞发生程序性死亡最终在病原最初侵染点周围形成坏死斑。如番茄中的 Tm-1 或 Tm-2 和Tm-22基因，马铃薯的 Rx，Ry，烟草中的 N 基因等等[2]。这类基因通常称为 R 基因。根据其抗性水平的不同还分为：真实免疫指病毒复制完全不能发生、阈下侵染指病毒的复制仅局限于受侵染的细胞。不管 R 基因是在模式植物还是在
植物基因组测序
千年基因将应邀参加第十六届全国植物基因组学大会 第十六届全国植物基因组学大会将于2015年8月19日-22日在陕西杨凌召开，千年基因应邀参加此次会议，并将在会场学术交流区设立展台。届时千年基因的技术团队会向大家展示我们最全面的测序平台、一站式的基因组学解决方案以及近年来在植物基因组学领域取得的科研成果，欢迎广大科研人员莅临指导交流！ 在测序平台方面，千年基因目前拥有国内最全面的测序平台，能够为科研人员提供一站式解决方案。以PacBio RS II三代平台为例，千年基因自去年提供PacBio RS II测序以来，通过项目经验的积累及严格的质量控制，目前各项数据指标已达国内最高水平。数据产出已稳步升级至1.4Gb/ SMRT cell，读长最长可达42 Kb，reads N50高达18Kb，远超PacBio官方提供的数据标准！在植物基因组de novo测序的研究中，千年基因提供的超长读长测序可更好地跨越基因组高重复序列、转座子区域以及大的拷贝数变异区域和结构变异区，从而实现对高杂合及高重复基因组的完美组装。在植物转录组测序的研究中，千年基因提供的超长读长测序无需拼接即可获得全长转录组序列信息，同时可获得全面的可变剪切、融合基因以及Isoform信息。另外，千年基因提供的HiSeq 4000及HiSeq 2000/2500测序可解决研究人员在植物基因组重测序、转录组测序、小RNA测序等方面的科研需求。 在项目经验方面，千年基因与来自全球的科研人员合作开展了大量植物基因组项目，相关成果已发表于Nature、Nature Genetics、Science等杂志。例如，油棕榈基因组项目在Nature 杂志同时发表两篇文章，辣椒基因组项目的成果发表于Nature Genetics，玉米基因组项目的成果发表于Science。在国外合作方面，千年基因与美国爱荷华州立大学Patrick Schnable教授领导的国际玉米基因组团队合作开展的上万份玉米样本重测序项目也正在进行中；千年基因与国际半干旱热带作物研究所建立长期战略合作关系，正在开展上千份木豆、鹰嘴豆及高粱样本的群体遗传学研究；同时千年基因与华盛顿大学的Evan Eugene Eichler院士及佐治亚大学的Jeffrey Lynn Bennetzen院士也有大量基因组项目合作。在国内合作方面，千年基因与广东省农科院、山东省农科院共同启动的花生基因组项目已全部完成de novo测序及数据挖掘，同时与中国科学院、北京大学、中国农业大学、中国科学技术大学、上海交通大学、
植物抗病、抗虫及抗除草剂基因与基因工程
植物抗病、抗虫及抗除草剂基因与基因工程 张永强 （西南大学植物保护学院， 重庆 400716） 摘 要：病虫草害历来是植物保护工作的重中之重，农药为病虫草害防治立下了汗马功劳。近来由于大量使用、滥用农药给环境带来了巨大的负面影响。20世纪70年代兴起的基因工程为这一问题的解决带来了新的途径。本文就植物抗病基因分类、最新报道的相关基因；抗虫基因的来源、最新报道的抗虫基因及试验结果；抗除草剂基因以及基因工程技术在现代农业中的应用予以综述。 关键词：植物抗病；植物抗虫；抗除草剂；基因工程 农药伴随人类改造自然，征服自然已经有100多年的历史，在促进农业发展和对人类发展做出卓越贡献的同时，也不可避免的带来许多负面影响，如：对非靶标生物的毒害、对环境的污染、对生态系统的破坏以及病虫草抗药性的产生等。特别是化学农药对动物和人类健康的影响，已经成为全人类普遍关心和急需解决的全球性问题。诞生在20世纪70年代的基因工程技术为这些问题的解决提供了一条新的途径。进入20世纪90年代具有实用价值的转基因生物品种因其诸多的优势，逐渐被人们所接受，而迅速走向商品化和产业化。 1 植物抗病基因与基因工程 植物受病原菌侵染时，会诱导相关的基因产生一系列参与植物防御反应的拮抗物质，阻止病害的传播和病原菌的进一步侵入。将这些参与植物防御反应的相关基因导入植物，使其在植物体内表达，可以提高植物的抗病能力。植物抗病基因在进化中形成了几种共有的进化形式。植物祖先抗病基因的复制创造了新基因座。基因间和基因内重组导致了变异，也导致了新特异性抗病基因的产生；另外，与特异性识别相关的富含亮氨酸重复区顺应于适应性选择；同样，类转座元件在抗病基因座中的插入加速了抗病基因的进化（庄军等，2004）。 1.1 植物抗病基因的分类 植物中许多抗病基因已被克隆，根据抗病蛋白（R蛋白）将抗病基因（R基因）分为以下几类。第一类，玉米抗圆斑病的基因Hml，其编码的解毒酶能钝化病原真菌所产生的HC 毒素，代表着抗病基因中与病原物亲和性因子作用的一类基因。 第二类，番茄抗细菌叶斑病的基因pto，其编码蛋白Pto是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。AvrPto 蛋白是病原菌假单胞杆菌Pseudomonas进入植物细胞中通过Ⅲ型分泌系统分泌的，现已证实Pto激酶噜噗结构域中204位苏氨酸决定着Pto对AvrPto的特异性识别。具有自动磷酸化能力的Pto激酶与AvrPto相互作用从而产生了过敏性反应。 第三类抗病基因所编码的蛋白显示出与细胞间信号转导蛋白具有结构相似性。这些蛋白所共有的基元是富含亮氨酸重复序列（Leucine-rich repeat，LRR），一般由24个氨基酸残基组成，其共同蛋白序列是LXXLXXLXXLXLXXNXLSGXIPXX（氨基酸的单字符号，X代表任何一种氨基酸）。这一类型基因的共同结构是LRR-TM，它们编码的蛋白包括胞外N端LRR 重复区、膜锚定蛋白和胞质内C末端部分（如图1所示）。 第四类是水稻抗白叶枯病Xanthomonas oryzae pv．oryzae，Xoo的基因xa27。这一基因所编码的Xa21蛋白具有3个受体激酶特征的主要结构域：胞外LRRs结构、跨膜结构域及胞内激
实验报告 植物基因组的提取和检测
四川大学实验报告 题目：的提取与检测植物基因组DNA一、实验目的 1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理； 2.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。 二、实验原理 1.在液氮中对植物组织进行研磨，破碎细胞； 2.SDS等离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来； 3.苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质； 4.上清液中加入异丙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE缓冲液中，即得植物基因组DNA溶； 5.DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。 三、实验材料 1.设备 移液器，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心管 2.材料 植物幼嫩叶片 3.试剂 （1）细胞提取液：100mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 5mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.25% SDS，1%β-巯基乙醇（去除酚类） （2）氯仿:异戊醇（24:1） （3）其它试剂：液氮、无水乙醇、 TE缓冲液、异丙醇、洗涤缓冲液 四、方法和步骤 0C水浴（金属浴）中加热备用；μ500L细胞提取液于651、取2、研钵用液氮预冷，新鲜植物叶片（自来水清洗，蒸馏水冲洗干），去除叶脉，剪成细条状，置于研钵中研磨成粉末状（越细越好）； 0C预热的细胞提取液中，迅速摇匀，65500、取0.1g粉末（大约两勺半）转移至
生物基因组进化
寒武纪物种大爆发是病毒的产物 is the result of virus creation 1984年6月中旬，中国科学院南京古生物所硕士毕业生侯先光，来到云南澄江县的帽天山，寻找曾经生存于寒武纪的高肌虫化石。7月1日下午3点左右，发现一块形状奇特又保存完整的化石，使他欣喜若狂，他用自己所学的知识判断，这是一块寒武纪早期的无脊椎动物化石。他再接再厉，当天就发现了三块重要化石，这三块经进一步鉴定，分别是纳罗虫、腮虾虫和尖峰虫化石。至此他打开了一扇古生物宝藏的大门，在以后的数天里，侯先光陆续发现了节肢动物、水母、蠕虫等许许多多同时期的古生物化石。返回南京后，他与导师张文堂教授，撰写了《纳罗虫在亚洲大陆的发现》，后来将在澄江发现的化石经技术处理复原后，展现在人们面前的是各种生物姿态奇特、色彩斑斓让人称奇的5.3亿年前的海洋全景图，澄江的动物化石因此闻名于世界，被定名为“澄江动物群”。在此之前的1909年，在加拿大发现的寒武纪中期的布尔吉斯动物化石群曾经轰动过世界，这个化石群距今有5.1亿年，比澄江动物群晚1500万年以上，澄江动物群是目前世界所发现的最古老、保存最完好的多门类动物群。1947年在澳大利亚发现了距今5.8亿年前寒武纪末期的埃迪卡拉动物化石群。奇异的是这个化石群与前上两化石群比较，物种间发生的突然性变化难以证明物种的连续性进化。这个化石动物群中没有发现任何寒武纪的属种，就如各类的动物是在寒武纪时期迅速起源，不是经过长时间的演化慢慢变来的，澄江动物群记录了这段特殊时期生物群的全貌。几乎现生动物的所有门类，都能在澄江化石群里找到它们的远祖代表，是寒武纪物种大爆发的最重要的记实。 寒武纪的物种大爆发是古生物学研究中的重大事件，因为其对达尔文的进化理论提出了严重的挑战，使其至今不能完善其说。古生物学研究表明，地球的“年龄”大约有46亿年，从地球生命出现到今天已经38亿年，但在距今5.4亿年前的寒武纪之前，生命只是以藻类和菌类的简单形式或个别简单的多细胞物种存在于海洋里。寒武纪之后，大量后生动物突然在海洋里出现，从单细胞藻类、菌类到多细胞后生动物演化特别快，短短千万年的时间里突然出现了大量不同门类的动物，这个星球上现存的物种几乎都是它们的后代。因此有学者用“神迹”来描述这个寒武纪的物种大爆发，这么多门类、多形态的生命在同一时期产生，并且已具备生命物种最初的复杂性，使人有理由认为是上帝选择了寒武纪作为创造生命的时期，对达尔文提出的渐进连续的生物进化论提出诘难。 按照达尔文的自然进化思想，物种的变化是各种微小变化的累积，进化应该是连续不断的。但这种设想显然与寒武纪的物种变化的实际情况不符，当科学家发现在寒武纪突然出现的三叶虫时，便认为可能会动摇进化论的基础。在当时的社会环境，如果谁提出快速进化，就有神创论的嫌疑。然而随着时间的推移和研究的深入，这些矛盾变得越发尖锐而不可调和。因此人们对达尔文的渐变论做了修正，“达尔文在他的时代由于研究条件的限制，对生物演化的历史了解并不是很全面，他认为进化应该是慢速进化。进入20世纪以来，大量的科学证据表明，进化应该是个快速的过程，澄江动物群就很典型。”但为什么在寒武纪的几百万年的时间中物种发生快速发展，而寒武纪之前的几十亿年中生命长期停留在藻类、菌类或简单多细胞的形式，其间找不到任何过渡物种的化石；寒武纪之后的几亿年中各种物种各自向高等类别缓慢进化，再也没有出现一次物种的快速发展，以至出现一个全新类型的物种呢？寒武纪前地球必定出现了什么。 为了达尔文学说与现实之间的矛盾，学术界争议了上百年，物种进化是连续性还是跳跃式发展？全力支持达尔文的赫胥黎曾私下多次劝告达尔文接受跳跃式的进化观点，并警告说，“你这样毫无保留地接受自然界绝无跃进的观点，使你陷入不必要的困难之中。”而达尔文深知，他的学说最具吸引力、最独到的地方乃是摒弃一切超然主义，用纯自然的观点解释生物的起源，他只有用渐进、微小的变化来解释复杂的大变化，才能持守他这种彻
植物功能基因组学概述
植物功能基因组学概述 XXX* (XXXXX) 摘要：植物功能基因组学是从整体水平研究基因的功能及表达规律的科学。对植物功能基因组学的研究将助于我们对基因功能的理解和对植物性状的定性改造和利用。本文简要介绍了植物功能基因组学的概念、研究内容和研究方法。 关键词：植物；功能基因组学；ESTs；SAGE Summarize of Plant Functional Genomics XXX （XXXXX） Abstract：Plant functional genomics studies provide a novel approach to the identification of genome-wide gene expression. It is currently being widely focused on the gene expression by transcript profiling and takes us rapidly forward in our understanding of plant biological traits. In this review, comprehensive of concepts, research contents and methodologies regarding plant functional genomics and transcript profiling are described. Key words: Plant; functional genomics; ESTs; SAGE 1 植物功能基因组学 基因组学(Genomics)是20世纪最后10年研究最活跃的领域之一。基因组学是指对所有基因的结构和功能进行分析的一门学科, 1986年由美国科学家Thomas Roderick提出, 兴起于20世纪90年代[1]。基因组学研究分为结构基因组学( structural genomics) 和功能基因组学( functional genomics)。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段, 以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主, 以研究基因序列为目标。功能基因组学(Functional genomics)的研究又被称为后基因组学(Post genomics)研究，它是利用结构基因组学提供的信息和产物，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向对多个基因或蛋白质同时进行系统研究。 植物功能基因组学是植物后基因时代研究的核心内容,它强调发展和应用整体的(基因 组水平或系统水平)实验方法分析基因组序列信息、阐明基因功能,其特点是采用高通量的实验方法结合大规模的数据统计计算方法进行研究。基本策略是从研究单一基因或蛋白质上升到从系统角度研究所有基因或蛋白质。在植物功能基因组学的研究中，拟南芥和水稻是两种最常用的模式植物。目前, 功能基因组学在水稻、拟南芥等模式植物中取得了较快进展, 主要原因在于这两种植物已完成全基因组测序工作[2], 获得了结构基因组数据, 且遗传背景清楚, 易于开展分子生物学研究, 已率先步入后基因组时代。 2 植物功能基因组学研究内容 2、1基因组多样性研究[1] *联系人Tel：XXXXX；E-mail：XXXXX
DNA序列在植物系统进化研究中的应用
收稿日期:2002-07-25.作者简介:石开明(1980-),男,硕士研究生,主要从事植物生化方面的研究. DNA 序列在植物系统进化研究中的应用 石开明1,彭昌操1,彭振坤1,罗正荣2 (1.湖北民族学院生物科学与技术学院,湖北恩施445000; 2.华中农业大学园艺林学学院,湖北武汉430070) 摘要:DNA 序列分析已广泛应用于植物系统与进化学研究,根据不同的研究对象和问题选择相对应的DNA 序 列来进行研究显得十分重要.目前在植物系统与进化学中主要一些DNA 的应用,主要是讨论叶绿体基因组 (rbcL 等)和核基因组(18S ,ITS 等)中的特定DNA 序列区段.研究表明,18S ,rbcL 等编码基因一般适用于较高 分类阶元甚至整个种子植物谱系间的系统发育的探讨,而ITS 及cpDNA 的非编码区序列等因其较快的进化速 率多用于较低分类阶元的系统关系研究. 关键词:DNA 序列;植物系统与进化;叶绿体基因组;核基因组 中图分类号:Q523+·8 文献标识码:A 文章编号:1008-8423(2002)04-0005-06 直到30年前,形态性状在进化和系统学研究中仍然占统治地位,但形态性状易受环境影响,普遍存在趋同和平行进化现象,使得许多分类群的进化地位难以确定.而DNA 序列则不同,它直接反映物种的基因型,并记录进化过程中发生的每一件事,含有极为丰富的进化信息.依据DNA 序列上的差异来比较植物的亲缘和演化关系,可以为植物系统与进化研究提供最直接的证据.随着PCR 和DNA 测序技术的产生和发展,分子数据为植物系统学研究提供了丰富而翔实的资料,成为解决系统与进化方面的一个十分重要的技术手段. 植物基因组因其机构和功能上的差异,进化速率有所不同,基因组内,不同部分之间的序列变异速率也不同,这些都为不同分类阶元的系统发育提供了可供选择的多样化的性状来源.一般情况下,基因组内非编码区序列(包括内含子,基因间区)因其功能上的限制较少,比编码区表现出更快的进化速率(Curtris &Clegg ,1984;Palmer ,1991;Clegg et al .1994).研究中,人们首先将目光投向了叶绿体DNA ,其基因组较少且相对保守,单亲遗传.核基因组和叶绿体基因组的起源不同,二者可能有着不同的进化机制,核基因组的研究也逐渐引起人们的广泛重视.植物线粒体基因组进化速率不到叶绿体的1/3(W olf et al .1987),应用到植物系统进化研究中的范围比较窄.目前,对线粒体基因组研究的报道极少见到(Hiesel et al .1994;Pesole et al .1996),其有效的研究体系难以建立,因此本文将不予评述. Olmstead &Palmer (1994)强调,选择一个序列进行系统发育分析时,通常要考虑到以下问题:(1)这个序列要足够长,以提供足够的带有系统发育的核苷酸位点,且所选序列的差异百分率必须适于所要解决的系统问题.一般认为所比较的分类群间的序列差异率在5%～15%间最为合适,这时既可以使性状间的多次置换降至最低,又能提供足够数量的性状(Ritland &Clegg ,1990);(2)此序列必须易于排序,这对性状的同源性的正确评价是十分必要的:(3)此序列必须是直系同源(orthologous )的.用于系统发育分析的许多核基因存在一个严重的问题即区分直系同源(与生物体系统发育有关的基因)和异系同源(paralogous ,基因组内与基因重复有关的基因)(Sanderson &Doyle ,1991:Doyle ,1992);叶绿体不存在这个问题,只要基因保留在叶绿体基因组内,所有的基因均为单拷贝. 1 叶绿体基因组(cpDNA ) 大多数叶绿体基因组具有相似的结构,为闭环双链DNA .叶绿体DNA 总量约占植物总DNA 的10%～20%,长度多在120～160kb 之间,其长度变异主要由2个反向重复系列(IR )引起.这2个反向重复序列长约第20卷第4期 2002年12月湖北民族学院学报(自然科学版)J ournal of Hubei Ins titute for Nationalities (Natural Science Edition )Vol .20 No .4Dec .2002
基因组学答案
1.什么是基因组学？基因组学有哪些特点？ 以基因组分析为手段，研究基因组的结构组成、时序表达模式和功能，并提供有关生物物种及其细胞功能进化信息的一门学科。特点：Genome sciences are sequence-based，Genome sciences are data-guided (not so hypothesis-driven)，Genome sciences is a systematic approach。 2.什么是模式生物？ 生物学家通过对选定的生物物种进行科学研究，用于揭示某种具有普遍规律的生命现象，此时，这种被选定的生物物种为模式生物。在人类基因组计划中，包括对五种生 物基因组的研究：大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和小鼠，称之为人类的五种“模式生物”。 3.人类基因组计划是哪一年完成的？在科学上有什么意义？ 2000年完成了人类基因组“工作框架图”。2001年公布了人类基因组图谱及初步分析结果。 意义： 首先,获得人类全部基因序列将有助于人类认识许多遗传疾病以及癌症等疾病的致病机理,为分子诊断、基因治疗等新方法提供理论依据。 第二,破译生命密码的人类基因组计划有助于人们对基因的表达调控有更深入的了解。4.基因组学的发展方向是什么？ 5. 3 大公共DNA 数据库名称是什么？ EMBL,GenBank，DDBJ。 6.什么是一级数据库和二级数据库？ Primary Databases：Original submissions by experimentalists，Content controlled by the submitter。 Derivative Databases：Built from primary data，Content controlled by third party。 7.什么是NCBI 的Refseq？什么是Unigene？Unigene 和Refseq 的区别和联系。 RefSeq (accessible via the main page of NCBI) provides an expertly curated accession number that corresponds to the most stable, agreed-upon “reference” version of a sequence. Unigene：MegaBlast based automated sequence clustering，Nonredundant set of gene oriented clusters，Each cluster a unique gene，Information on tissue types and map locations，Includes known genes and uncharacterized ESTs，Useful for gene discovery and selection of mapping reagents。 8.GEO 是什么类型数据库，主要包含什么类型数据？ 9.大致介绍一下UCSC GENOME BROWSER？ Stands for “Encyclopedia Of DNA Elements”，Public research consortium to carry out a project to identify all functional elements in the human genome sequence，Launched by The National Human Genome Research Institute (NHGRI)，Conducted in three phases:pilot project phase，technology development phase，planned production phase。 10.HAVANA 基因是什么类型数据？ 11.什么是细菌人工染色体（BAC） 是指一种以F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb个碱基对。 12.什么是遗传图谱？用来构建遗传图谱的标记有哪些？