分子生物学 常用引物序列
日常备库引物序列(5'-3') 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT
27F\8F AGAGTTTGATCCTGGCTCA
35S GACGCACAATCCCACTATCC
3'AD AGATGGTGCACGATGCACAG
3'AOX\AOX1rev GGCAAATGGCATTCTGACAT
3'BD TAAGAGTCACTTTAAAATTTGTATAC 5'AD\GAL4AD\P17110 TACCACTACAATGGATGATG
5'AOX\AOX1for GACTGGTTCCAATTGACAAGC
5'BD\GAL4-BD-Cfor TCATCGGAAGAGAGTAG
96gIII\M13-96 CCCTCATAGTTAGCGTAACG
a-FACTOR\Alphafor TACTATTGCCAGCATTGCTGC
BAC1 AACCATCTCGCAAATAAATA
BAC2 ACGCACAGAATCTAGCGCTT
BGH\pCDNA3.1R TAGAAGGCACAGTCGAGG
CMV-24 TTAGGACAAGGCTGGTGG
CMV-30 ATAACCCCGCCCCGTTG
CMV-F\CMV-Profor CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG\ATGGGCGGTAGGCGT G
CMV-R TCGTTGGGCGGTCAGC DuetDOWN1 GATTATGCGGCCGTGTACAA DuetUP1 GATCTCGACGCTCTCCCT DuetUP2 TTGTACACGGCCGCATAATC EBVrev GTGGTTTGTCCAAACTCATC EGFP-Cfor AGCACCCAGTCCGCCCTGAGC EGFP-Nrev CGTCGCCGTCCAGCTC
GAL1-Profor AACATTTTCGGTTTGTATTACTTC GLP1 TGTATCTTATGGTACTGTAACTG GLP2 CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA
GLP4 GCCCTTCTTAATGTTTTTG
H1-F\H1 TCGCTATGTGTTCTGGGAAA HSVtk-pArev GTCTCCTTCCGTGTTTCAG IRES-R CCTCACATTGCCAAAAGACG
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
M13-47 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC M13F\TrxReverse\M13-20\M13F-4
TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R CAGGAAACAGCTATGACC
malE GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC MT-Profor CATCTCAGTGCAACTAAA
mU6F2（mouse）TAGTATCCGACGCCGCCATC
NL1 GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG NL4 GGTCCGTGTTTCAAGACGG NOSR-primer CGTCCAGCTCCATGTTGC
P1 CCAGGCTTTACACTTTATGC
p10-Profor CGGACCTTTAATTCAACCC
P2 GCGATTAAGTTGGGTAACGC pBABE3' ACCCTAACTGACACACATTCC PBABE5' CTTTATCCAGCCCTCAC pBADfw CCATAGCATTTTTATCCATAAG pBADrv\pTrcHis-rv ATCTGTATCAGGCTGAAAATC PBV220F AAGAAGGGCAGCATTCAAAG pCDNA3.1F CTAGAGAACCCACTGCTTAC pCMV5F TTCCAAAATGTCGTAATAAC pCMV5R ATTATAGAGGACACCTAGTC PCMV-F TCTAAAAGCTGCGGAATTGT PCMV-R TCCAAACTCATCAATGTATC
pcoldI-R\pCold-SUMO-R GGCAGGGATCTTAGATTCTG
pCold-TF-F1 CCACTTTCAACGAGCTGATG pDBLeu-F GAATAAGTGCGACATCATCATC pDEST22-F TCGATGATGAAGATACCCCACC pDEST22-R CTCGACGTCTTACTTACTTAGC PDONR-F TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC PDONR-R GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC pDsRED-ex-C1-F TCCCACAACGAGGACTACAC
PEF-F\EF-1aForward TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC pEGFP-C-3' TATGGCTGATTATGATCAGT pEGFP-C-5’CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG pEGFP-N-3’\EGFP-Nrev CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG pEGFP-N-5' TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG pFastBac-fw GTCCGAAACCATGTCGTAC pFastBac-R TGGACAAACCACAACTAGAATG pFastBac-rev CCTCTACAAATGTGGTATGG
pFlag-CMV-F GGTAGGCGTGTACGGTGG
pFlag-CMV-R GCACTGGAGTGGCAACTT
PGEX-F GGCAAGCCACGTTTGGTG
PGEX-R GAGCTGCATGTGTCAGAGG
PH-Profor AAATGATAACCATCTCGC pIRESrv GCCCTAGATGCATGCTCG
PJET1.2-F CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC PJET1.2-R AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG pLNCX-F AGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCG pLXSN-F CTTGAACCTCCTCGTTCGAC pLXSN-R GTTGCTGACTAATTGAGATG
pMAL-C2X-F TGCGTACTGCGGTGATCAAC
pMAL-C2X-R CTGCAAGGCGATTAAGTTGG
pMAL-C5x-R TGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCAC PPC86-F\pDEST22-F1998 TATAACGCGTTTGGAATCACT PPC86-R\pDBLeu-R GTAAATTTCTGGCAAGGTAGAC pQE30-F TGAGCGGATAACAATTTCAC pQE30-R GTTCTGAGGTCATTACTGG pSHUTTLE-CMV-R GTGGTATGGCTGATTATGATCAG pSilencer4.1-F\2.0rev AGGCGATTAAGTTGGGTA PTRC99C-F TTGCGCCGACATCATAAC PTRC99C-R\PBV220R CTGCGTTCTGATTTAATCTG pYes2.R\CYC1-Terminator GCGTGAATGTAAGCGTGAC
RFP-Nrev GTTCACGGTGCCCTCC
RV-M AGCGGATAACAATTTCACACAGGA RVP3 CTAGCAAAATAGGCTGTCCC RVP4 GACGATAGTCATGCCCCGCG
S.tag GAACGCCAGCACATGGAC
SeqL-A GCAGTTCCCTACTCTCGC
SeqL-B CATCAGAGATTTTGAGACAC
SP6 ATTTAGGTGACACTATAG
SV40 GGAGGCTTTTTTGGAGGC
SV40-pArev\pSG5rv GAAATTTGTGATGCTATTGC
T3 ATTAACCCTCACTAAAGGGA
T7 TAATACGACTCACTATAGG
T7(17base) ACATCCACTTTGCCTTTCTC
T7ter TGCTAGTTATTGCTCAGCGG
U6-promoter（human）CCGTAACTTGAAAGTATTTCG
v1.5 GGACTTTCCAAAATGTCG
V5rev ATCGAGACCGAGGAGAGG WPRE-R CATAGCGTAAAAGGAGCAACA
XL39\CMV-24 ATTAGGACAAGGCTGGTGGG
ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG
分子生物学 常用引物序列
日常备库引物序列(5'-3') 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT 27F\8F AGAGTTTGATCCTGGCTCA 35S GACGCACAATCCCACTATCC 3'AD AGATGGTGCACGATGCACAG 3'AOX\AOX1rev GGCAAATGGCATTCTGACAT 3'BD TAAGAGTCACTTTAAAATTTGTATAC 5'AD\GAL4AD\P17110 TACCACTACAATGGATGATG 5'AOX\AOX1for GACTGGTTCCAATTGACAAGC 5'BD\GAL4-BD-Cfor TCATCGGAAGAGAGTAG 96gIII\M13-96 CCCTCATAGTTAGCGTAACG a-FACTOR\Alphafor TACTATTGCCAGCATTGCTGC BAC1 AACCATCTCGCAAATAAATA BAC2 ACGCACAGAATCTAGCGCTT BGH\pCDNA3.1R TAGAAGGCACAGTCGAGG CMV-24 TTAGGACAAGGCTGGTGG CMV-30 ATAACCCCGCCCCGTTG CMV-F\CMV-Profor CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG\ATGGGCGGTAGGCGT G CMV-R TCGTTGGGCGGTCAGC DuetDOWN1 GATTATGCGGCCGTGTACAA DuetUP1 GATCTCGACGCTCTCCCT DuetUP2 TTGTACACGGCCGCATAATC EBVrev GTGGTTTGTCCAAACTCATC EGFP-Cfor AGCACCCAGTCCGCCCTGAGC EGFP-Nrev CGTCGCCGTCCAGCTC GAL1-Profor AACATTTTCGGTTTGTATTACTTC GLP1 TGTATCTTATGGTACTGTAACTG GLP2 CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA
分子生物学实验设计报告-四川大学
分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 一、引言 荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。 通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP） 传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。 而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。 < 菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省
时，快捷，但容易出现假阳性。为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。 三、实验步骤 1.质粒DNA的提取 实验原理： ~
常用的β-actin 引物序列
human actin f ctc cat cct ggc ctc gct gt human actin r gct gtc acc ttc acc gtt cc product size:268 rabbit actin r agt gcg acg tgg aca tcc g rabbit actin f tgg ctc taa cag tcc gcc tag product size:295 mouse actin r cgt tga cat ccg taa aga cc mouse actin f aac agt ccg cct aga agc ac product size:281 rat actin f TCAGGTCATCACTATCGGCAAT rat actin r AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA product size:432 human actin r gag cta cga gct gcc tga cg human actin f cct aga agc att tgc ggt gg product size:416 mouse actin f tca tca cta ttg gca acg agc mouse actin r aac agt ccg cct aga agc ac product size:399 rat actin f CCCATCTATGAGGGTTACGC rat actin r TTTAATGTCACGCACGATTTC product size:150 rabbit actin f tct tcc agc cct cct tcc tg rabbit actin r cgt ttc tgc gcc gtt agg t product size:409 内参基因名称引物引物最佳退火扩增 基因库序列号引物名称序列位置Tm 温度C 长度 Human actin beta F305 ctgggacgacatggagaaaa 305-324 52.3 BC002409 R868 aaggaaggctggaagagtgc 868-849 52.6 59.4 564 F1379 agcgagcatcccccaaagtt 1379-1398 57.3 R1663 gggcacgaaggctcatcatt 1663-1644 56.3 54 285 Rat actin beta F18 cacccgcgagtacaaccttc 18-37 54.5 NM_031144 R224 cccatacccaccatcacacc 224-205 54.4 60.4 207 F694 gagagggaaatcgtgcgtgac 694-714 54 R1146 catctgctggaaggtggaca 1146-1127 53.2 57.1 452 Mouse actin beta F91 atatcgctgcgctggtcgtc 91-110 57.5 NM_007393 R607 aggatggcgtgagggagagc 607-588 57.8 60.4 517 F1566 gtccctcaccctcccaaaag 1566-1585 54.5 F1831 gctgcctcaacacctcaaccc 1831-1811 54.4 55.7 266 human GAPDH F369 agaaggctggggctcatttg 369-388 55.6 BC004109 R626 aggggccatccacagtcttc 626-607 55.1 57.5 258
分子生物学实验报告
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
(完整版)分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。 11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。)
真菌检测鉴定通用引物-Fungal Primers
ITS1: 5’-CCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ Tm 55℃ NS17: CATGTCTAAGTTTAAGCAA NS3: GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC NS4: CTTCCGTCAATTCCTTTAAG NS22: AATTAAGCAGACAAATCACT NS24: AAACCTTgTTACgACTTTTA LR0R: 5’-GTACCCGCTGAACTTAAGC-3’ LR3: 5’-CCGTGTTTCAAGACGGG LR3R: 5’-GTCTTGAAACACGGACC (complementary to RLR3R: GGTCCGTGTTTCAAGAC) LR5: 5’-TTAAAAAGCTCGTAGTTGAAC-3’ LR7: 5’-TACTACCACCAAGATCT LR12: 5’-GACTTAGAGGCGTTCAG Lr0R/LR5: Tm 50-52℃ NL1: 5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG NL1: 5′-TGCGTTGATTACGTCCCTGC (also called V9: TGCGTTGATTACGTCCCTGC) NL1: 5’-TGCTGGAGCCATGGATC-3 NL2: 5’-CTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCT NL2: 5’-AACGGCTTCGACAACAGC-3 NL2: 5’-CTTGTTCGCTATCGGTCTC (also NL2A: 5′-CTTGTTCGCTATCGGTCTC) NL2: 5’-TACTTGTTCGCTATCGGTCT-3' NL3: 5’-GAGACCGATAGCGAACAAG (also NL3A: 5’-GAGACCGATAGCGAACAAG) NL3: 5’-AGACCGATAGCGAACAAGTA NL3: 5’ NL4: 5’（similar to RLR3R：5′-GGTCCGTGTTTCAAGAC) NL4: 5’-TAGATACATGGCGCAGTC-3
实验室常用缓冲液 常用引物序列汇总
实验常用试剂、缓冲液的配制方法 Na2HPO4，2 mM KH2PO4 1 M Tris-HCl 、11M Tris-HCl □组份浓度 □配制量□配制量1L 1L （pH7.4，7.6，8.0） □配置方法1. 称量下列试剂，置于1L烧杯中。烧杯中。□配置方法1. 称量121.1gTris置于1L NaCl 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。 8 g 2. KCl 0.2g 3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。 Na2HPO4 1.42 g 浓值 HCl pH KH2PO4 0.27g 7.4 约70mL 2. 向烧杯中加入约800 mL的去离子水，充分搅拌溶解。 7.6 约60mL 3. 滴加HCl将pH42mL 8.0 约值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1L。 4. 将溶解定容至1L。 4. 高温高压灭菌后，室温保存。 5. 高温高压灭菌后，室温保存。注意：上述PBS Buffer中无二价阳离子，如需要，可在配方中pH注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的补充1mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。pH值随温度的变化差很大，温度每升高1℃，溶液的值大约降低 6、10 M醋酸铵0.03个单位。□组份浓度10 M醋酸铵 □配制量100mL 1.5 M Tris-HCl 2、1.5 M Tris-HCl □组份浓度□配置方法1. 称量77.1g醋酸铵置于100～配制量pH8.8 （）□1L 200 mL烧杯中，加入约30 mL的去离子水搅拌溶解。1L1. □配置方法称取181.7gTris置于烧杯中。 2. 加入约800mL2.加去离子水将溶液定容至100mL。的去离子水，充分搅拌溶解。 3.使用8.8pH3. 用浓盐酸调值至。0.22μm滤膜过滤除菌。 4.密封瓶口于室温保存。。1L 4. 将溶液定容至 5. 高温高压灭菌后，室温保存。注意：醋酸铵受热易分解，所以不能高温高压灭菌。 7、Tris- HCl平衡苯酚□溶液的注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris配置方法 1. 使用原料：大多数市售液化苯酚是清亮无色的，pH值大约无需重蒸馏℃，溶液的值随温度的变化差异很大，温度每升高pH1便可用于分子生物学实验。0.03降低个单位。但有些液化苯酚呈粉红色或黄色，应避免使用。同时也应避免使用结晶苯酚，结晶苯酚必须在160℃对其，□TE Buffer、310×组份浓度100 mM Tris-HCl10 mM EDTA
ISSR通用引物序列
ISSR通用引物序列
UBC Primer Set #9 (Microsatellite) 引物名称序列 801 ATA TAT ATA TAT ATA TT 802 ATA TAT ATA TAT ATA TG 803 ATA TAT ATA TAT ATA TC 804 TAT ATA TAT ATA TAT AA 805 TAT ATA TAT ATA TAT AC 806 TAT ATA TAT ATA TAT AG 807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 808 AGA GAG AGA GAG AGA GC 809 AGA GAG AGA GAG AGA GG 810 GAG AGA GAG AGA GAG AT 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 812 GAG AGA GAG AGA GAG AA 813 CTC TCT CTC TCT CTC TT 814 CTC TCT CTC TCT CTC TA 815 CTC TCT CTC TCT CTC TG 816 CAC ACA CAC ACA CAC AT 817 CAC ACA CAC ACA CAC AA 818 CAC ACA CAC ACA CAC AG 819 GTG TGT GTG TGT GTG TA 820 GTG TGT GTG TGT GTG TC
821 GTG TGT GTG TGT GTG TT 822 TCT CTC TCT CTC TCT CA 823 TCT CTC TCT CTC TCT CC 824 TCT CTC TCT CTC TCT CG 825 ACA CAC ACA CAC ACA CT 826 ACA CAC ACA CAC ACA CC 827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 828 TGT GTG TGT GTG TGT GA 829 TGT GTG TGT GTG TGT GC 830 TGT GTG TGT GTG TGT GG 831 ATA TAT ATA TAT ATA TYA 832 ATA TAT ATA TAT ATA TYC 833 ATA TAT ATA TAT ATA TYG 834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT 835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC 836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA 837 TAT ATA TAT ATA TAT ART 838 TAT ATA TAT ATA TAT ARC 839 TAT ATA TAT ATA TAT ARG 840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 841 GAG AGA GAG AGA GAG AYC 842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG
分子生物学实验设计实验
分子生物学实验 设计实验 题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ） 学院：生命科学学院 专业：生态学 教师：吴传芳 姓名/学号：余光辉/20 方成/20
一、实验目的 在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白 二、实验流程 三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌 体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g， 琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。 溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O
3.材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿 4.实验步骤 （1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜 （2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液 （3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中 （7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 （9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 （11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意 （1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、 开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开 环。 但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核 酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液 上样缓冲液（6×） 3.材料 提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，
分子生物学试验设计
分子生物学
利用半定量RT-PCR检测烟碱生物合成的方法 1 研究背景 烟碱是影响烟叶品质和安全性的最主要的因素之一，是烟草栽培和烟草制品消费者追求的主要目的物，也是烟草具有商品价值的根本所在。烟碱合成的第一步是腐胺到N-甲基腐胺的转化，由腐胺-N-甲基转移酶(PMT)催化，而腐胺-N-甲基转移酶(PMT)是合成烟碱过程中的关键限速酶。目前，国内外鲜有将烟碱的快速积累跟烟碱合成关键酶的转录水平直接对应起来的报道。研究表明，打顶后可导致烟草中烟碱的快速积累。所以利用烟草打顶可以增加烟碱生物合成的特点，选择参与烟碱合成的关键酶腐胺-N-甲基转移酶(PMT)，利用半定量RT-PCR检测PMT基因表达变化；同时结合上部烟叶烟碱含量的测定结果，比较两者的变化是否成正相关。这种方法的建立有利于通过检测烟碱合成关键基因的表达来分析烟草中烟碱生物合成情况，增强了检测不同大田管理措施影响烟碱合成的力度。 2 材料与方法 2.1 试验材料 试验材料为普通烟草栽培种K326。烟苗培育采用漂浮育苗法，烟苗长到4叶时，用作水培试验，烟苗管理按常规的溶液培养方法进行。烟苗水培65d时打顶，于打顶后24 h时取样，取烟株的上部叶和根系进行试验。 2.2 测定烟碱含量 烟碱含量的测定采用王瑞新(2003)的紫外分光光度法。每个样品5个重复，数据分析采用student,t检验，显著水平为P<0.05。 2.3 RNA提取 提取打顶烟草和不打顶烟草根部总RNA，总RNA提取后，分别测260nm、280 nm处的吸光值，计算A260/A280的值，估计总RNA的纯度，通过A260的值对总RNA进行定量。在l％琼脂糖凝胶上检测总RNA的提取质量。 2.4 RT-PCR法检测PMT表达变化 取等量打顶处理和不打顶烟株的总RNA，用RT-PCR法检测PMT基因的表达变化。 3 预计结果 3.1 烟碱含量的测定 与对照相比打顶后烟碱含量显著上升 3.2 RNA电泳检测 总RNA提取后，经检测RNA样品纯度好，并没有发生降解，可用于cDNA 第一链的合成。 3.3 PMT引物和内参引物进行分管PCR
常用的通用引物序列
常用之Universal Primer 序列 Primer Primer sequence Applicable vectors T7 TAATACGACTCACTATAGGG pGEM-T, pGEM-T-Easy, pCRII, pET, pBlueScript, pcDNA3.1, pT7Blue SP6 TATTTAGGTGACACTATAG pGEM-T, pGEM-T-Easy, pCRII T3 ATTAACCCTCACTAAAGGGA pBlueScript pUC/M13 Forward (-40) GTTTTCCCAGTCACGAC pUC, pGEM-T, pCRII, pBlueScript pUC/M13 Forward (-21) TGTAAAACGACGGCCAGT pUC, pCRII, pBlueScript pUC/M13 Reverse TCACACAGGAAACAGCTATGAC pUC, pGEM-T, pCRII, pBlueScript T7 Terminator GCTAGTTATTGCTCAGCGG pET pGEX 5’GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG pGEX pGEX 3’CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG pGEX pQEF GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG pQE pQER CATTACTGGATCTATCAACAGG pQE polyhedrin F AAATGATAACCATCTCGCAA Stag GAACGCCAGCACATGGACAGC pET-4x BGH reverse TAGAAGGCACAGTCGAGG pcDNA3.1, pTracer-CMV 5’ AOX GACTGGTTCCAATTGACAAGC pPlCZα α-factor TATTGCCAGCATTGCTGC pPlCZα 3’ AOX GCAAATGGCATTCTGACATCC pPlCZα
RT-PCR常用引物序列
RT-PCR常用引物序列 RT-PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb） β-actin 人有意义链CCTCG CCTTT GCCGA TCC 反义链GGA TC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62 kb β-actin* 大鼠有意义链TACAA CCTCC TTGCA GCTCC 反义链GGA TC TTCA T GAGGT AGTCA GTC 0.62kb β-actin 小鼠有意义链GTCGT ACCAC AGGCA TTGTG A TGG反义链GCAAT GCCTG GGTAC ATGGT GG 0.49 kb GAPDH 人有意义链GGTGA AGGTC GGAGT CAACG反义链CAAAG TTGTC ATGGA TGHACC 0.50kb GAPDH 大鼠有意义链GATGC TGGTG CTGAG TATGR CG反义链GTGGT GCAGG ATGCA TTGCT CTGA 0.20 kb Dynein 小鼠有意义链GCGGG CGCTG GAGGA GAA反义链GGA TC TTCA T GAGGT AGTCA GTC 12.3 kb Polymerase ε 人有意义链CGCCA AATTT CTCCC CTGAAA反义链CCGTA GTGCT GGGCA ATGTT C 6.8 kb Polymerase ε 人有意义链AAGGC TGGCG GATTA CTGCC反义链GA TGC TGCTG GTGAT GTACT C 3.5 kb Tuberous Sclerosis 人有意义链GGAGT TTATC ATCAC CGCGG AAATA CTGAG AG反义链TATTT CACTG ACAGG CAATA CCGTC CAAGG 5.3 kb 18S rRNA 大豆有意义链CTTTC GATGG TAGGA TAGTG GCCT反义链CAATG A TCCT TCCGC AGGTT CACCT AC 1.5 kb *引物不会扩增假基因 PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb） HIV gag region 病毒SK 38ATTAAT CACTA TCCAG TAGGA GAAAT SK 39TTTGG TCCTG TCTTA TGTCC AGAAT GC 0.11kb β-globin 人(29923)GGTGT TCCCT TGATG TAGCA CA (34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 4.1kb β-globin 人(31194)GCTGC TCTGT GCATC CGAGT GG (34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 2.8kb
分子生物学实验心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
引物设计常用序列
RT-PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb） β-actin 人有意义链CCTCG CCTTT GCCGA TCC 反义链GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62 kb β-actin* 大鼠有意义链TACAA CCTCC TTGCA GCTCC 反义链GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 0.62kb β-actin 小鼠有意义链GTCGT ACCAC AGGCA TTGTG ATGG反义链GCAAT GCCTG GGTAC ATGGT GG 0.49 kb GAPDH 人有意义链GGTGA AGGTC GGAGT CAACG反义链CAAAG TTGTC ATGGA TGHACC 0.50kb GAPDH 大鼠有意义链GATGC TGGTG CTGAG TATGR CG反义链GTGGT GCAGG ATGCA TTGCT CTGA 0.20 kb Dynein 小鼠有意义链GCGGG CGCTG GAGGA GAA反义链GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC 12.3 kb Polymerase ε人有意义链CGCCA AATTT CTCCC CTGAAA反义链CCGTA GTGCT GGGCA ATGTT C 6.8 kb Polymerase ε 人有意义链AAGGC TGGCG GATTA CTGCC反义链GATGC TGCTG GTGAT GTACT C 3.5 kb Tuberous Sclerosis 人有意义链GGAGT TTATC ATCAC CGCGG AAATA CTGAG AG反义链TATTT CACTG ACAGG CAATA CCGTC CAAGG 5.3 kb 18S rRNA 大豆有意义链CTTTC GATGG TAGGA TAGTG GCCT反义链CAATG ATCCT TCCGC AGGTT CACCT AC 1.5 kb *引物不会扩增假基因 PCR引物序列基因来源引物序列产物大小（kb） HIV gag region 病毒SK 38ATTAAT CACTA TCCAG TAGGA GAAAT SK 39TTTGG TCCTG TCTTA TGTCC AGAAT GC 0.11kb β-globin 人(29923)GGTGT TCCCT TGATG TAGCA CA (34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 4.1kb β-globin 人(31194)GCTGC TCTGT GCATC CGAGT GG (34016)CCAGG ATTTT TGATG GGACA CG 2.8kb 序列来源nvitrogen 公司
分子生物学 习题6
思考和练习 一、绪论—分子生物学实验的诞生和发展 1.简要概括分子生物学的发展历程。 2.分子生物学实验技术的发展给生命科学带来的影响如何？ 二、分子生物学实验基本知识简介 1.分子生物学实验常用的工具酶有哪些？它们的结构特点、功能及用途是什么？ 2.分子生物学实验常用的载体有哪些？它们的特点是什么？每种载体在分子生物实验中的功能是什么？ 3.克隆载体和表达载体有何不同点？ 4.如何保证克隆基因的保真性？ 5.如何选择合适的载体？ 6.都有哪些受体细胞？受体细胞的特点什么？ 7.载体和受体（宿主）细胞之间的关系是什么？ 8.如何选择合适的受体细胞？ 9.如何获得和鉴定目的基因？ 10.外源基因导入受体细胞的方法有哪些？各有什么优缺点？ 11.如何筛选重组子？ 三、分子生物学实验室常用仪器设备及其使用 1.分子生物学实验常规仪器都有哪些？它们的适用范围是什么？ 2.离心机在使用时应该注意什么？ 3.除了常规仪器设备外，还有那些仪器设备可用于分子生物学实验？ 四、大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化 1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？ 2.为什么要设置阴性对照？ 3.如阴性对照中长出菌，原因？ 4.在Amp培养板中，菌的密度过高或培养时间过长时会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是Amps的，原因？ 5.影响转化效率的因素有哪些？ 6.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？ 五、质粒DNA的提取及其定性定量分析 1.如何去除下列物质（蛋白、基因组DNA、RNA、糖类、脂类、小分子物质）？ 2.用什么方法能够定量核酸？ 3.分离基因组DNA和质粒DNA有哪些不同之处？ 4.如何提高核酸电泳的分辨率？ 5.EB染色的特点和注意事项是什么？ 6.核酸分离过程中酚、氯仿、异戊醇的作用是什么？ 7.在TE缓冲液中为什么要加入EDTA？ 8.纯化的核酸时如有酚和蛋白质的污染的话，对它的后期操作有何影响？ 9.有哪些因素影响核酸的沉淀？
分子生物学试验设计
分子生物学实验设计 田益夫（2013141241072） 唐子林（2013141241127） （一）实验目的 获得发绿色荧光的细菌。 （二）实验概述 通过体外扩增目的基因eGFP 并构建表达载体pET-28a-eGFP 转入大肠杆菌BL21，涂板观察细菌中外源绿色荧光蛋白基因表达情况。 （三）实验步骤及材料 1 实验准备与质粒提取 1.1 实验材料及试剂 含有pEGFP-N3质粒的大肠杆菌菌液和含有pET-28a 质粒的大肠杆菌菌液（或pEGFP-N3质粒、pET-28a 质粒及E.coli DH5α）；胰蛋白胨，酵母提取物，琼脂，去离子水，1N NaOH ；溶液I, 溶液II, 溶液III;卡那霉素储存液（50mg/ml ），工作浓度50μg/ml;氨苄青霉素储存液（100mg/ml ）,工作浓度100μg/ml ；饱和酚，氯仿，异戊醇；无水乙醇，含RNase 的双蒸水。 1.2 实验仪器 恒温摇床，超净工作台，高温灭菌锅，10、200、1000μl 移液器各一支及对应枪头各一盒，台式高速离心机，制冰机，混合漩涡器，EP 管，三角瓶等常用玻璃仪器，琼脂糖凝胶电泳仪等。 1.3实验流程 取灭菌50ml 三角瓶加入10ml 液体培养基及10μl 菌液 配置LB （KANA ）液体和固体培养基 37℃恒温摇床220r 过夜培养 碱裂解法提取质粒 超净台取800μl 菌液加入200μl 甘油-20℃菌保 加含RNase 双蒸水，-20℃保存 琼脂糖凝胶电泳检测 材料为冻干质粒和大肠杆菌时 pEGFP-N3和pET-28a 质粒 转化E.coli DH5α并活化
Invitrogen中国测序通用引物序列
Invitrogen中国测序通用引物序列 引物名称序列(5'-3') M13R CAG GAA ACA GCT A TG ACC M13F TGT AAA ACG ACG GCC AGT M13F(-47) CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC M13R(-48) AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA M13(-96) CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG SP6 A TT TAG GTG ACA CTA TAG T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG T7 terminator TGC TAG TTA TTG CTC AGC GG T3 A TT AAC CCT CAC TAA AGG GA pGEX-4T-5' GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG pGEX-4T-3' CCG GGA GCT GCA TGT GTC AGA GG GLp1 TGT A TC TTA TGG TAC TGT AAC TG GLp2 CTT TA T GTT TTT GGC GTC TTC CA RVp3 CTA GCA AAA TAG GCT GTC CC RVp4 GAC GA T AGT CA T GCC CCG CG pcDNA3.1R TAG AAG GCA CAG TCG AGG PinPoint primer CGT GAC GCG GTG CAG GGC G pCMV-F TCT AAA AGC TGC GGA A TT GT pCMV-R TCCAAACTCA TCAA TGTA TC pTRC99C-F: TTG CGC CGA CA T CA T AAC pTRC99C-R: CTGCGTTCTGA TTTAA TCTG pCEP-F: AGA GCT CGT TTA GTG AAC CG EBV-R : GTG GTT TGT CCA AAC TCA TC pIRES2-EGFP.P5’:GTA GGC GTG TAC GGT GGG AG pIRES2-EGFP.P3’: AAC GCA CAC CGG CCT TA T TC 3'AD: AGA TGG TGC ACG A TG CAC AG CMV -F CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG S1 CAA CGT GAA AAA A TT A TT A TT CGC S6 GTA AA T GAA TTT TCT GTA GTA GG 5`AOX1 GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC 3`AOX1 GCA AA T GGC A TT CTG ACA TCC α-Factor TAC TA T TGC CAG CA T TGC TGC GAL4 AD TAC CAC TAC AA T GGA TG pACT2-R GTGCACGA TGCACAGTTGAA pB42ADF: CCA GCC TCT TGC TGA GTG GAG A TG