动脉粥样硬化模型的制备

动脉粥样硬化模型的制备

一、泡沫细胞模型的制备

(一)原理

巨噬细胞和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)表面存在清道夫受体(scavenger receptor)，能大量地摄取修饰变性的低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)，特别是氧化LDL(oxidized LDL,OX-LDL)，使细胞内大量充盈脂质，在电镜或光镜下呈泡沫状，故称泡沫细胞。经油红O染色后呈红色颗粒状，含大量胆固醇，且胆固醇酯约占其50%。因而通过先制备OX-LDL，再使其作用于巨噬细胞或血管平滑肌细胞，即可造成泡沫细胞模型。

(二)实验步骤

1.LDL的制备：取新鲜全血200ml，不加抗凝剂分离出血清120ml，加入NaN324mg，EDTA(100mg/L)0.6ml以防腐和防氧化。调整血清密度为1.019，4?C，30000r/min，超速离心18小时。吸出上层乳白色液体(为极低密度脂蛋白，VLDL)及次层淡黄色液体(为中密度脂蛋白，IDL)；再调整密度为1.063，4?C，40000r/min，超速离心24小时。上层黄色液体即为LDL。经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为同一区带。在4?C，含10mg/L EDTA的磷酸缓(PBS)冲液中透析72小时，过滤除菌，4?C，保存备用。

2.OX-LDL的制备：将LDL在含10μmol/l CuSO4的PBS中，37?C,氧化72小时。然后于4?C，在含１００mg/L EDTA的PBS中透析，每８小时换液一次，透析２４小时。

LDL 的氧化程度通过测定样品中硫代巴比妥酸反应物质(thiobarbituric acid reactive substance,TBARS)的含量加以鉴定。取样品或丙二醛标准品0.1ml加入2.9ml复合液(CCl3COOH 0.92mol/L,C4H4N2O2S 0.026mol/L,HCl 0.25mol/L)中，置沸水浴30min，冷却后测定其在532nm的OD值，计算TBARS含量。再以胆固醇测定试剂盒测定LDL胆固醇含量。LDL的氧化修饰程度以每克LDL胆固醇的TBARS含量表示。

3.巨噬细胞源性泡沫细胞模型的制备：参考Leonard等的方法收集巨噬细胞。取雄性、10周龄C57BL/6J小鼠，腹腔注射无血清培养基RPMI 1640 2ml，4天后再次注射RPMI 1640 4ml 收集腹膜巨噬细胞，以109/L的密度种植于培养瓶中，培养12小时，弃培养液，用PBS冲洗掉未贴壁的细胞，重复3次。加入含OX-LDL(10mg/L)的RPMI 1640培养液，37?C下培养96小时(培养瓶中置盖玻片)。

1.VSMC源性泡沫细胞模型的制备：VSMC的培养参考本书有关章节。于培养液中加入OX-LDL

10mg/L，37?C下培养96小时。37?C下培养72小时(培养瓶中置盖玻片)。

2.泡沫细胞的鉴定

1)形态学观察：从培养瓶中取出盖玻片，以PBS冲洗3次，于4?C，10%甲醛中固定24小时，用油红O染色。具体方法如下：

(1)水洗5min。

(2)在60%异丙醇中放置5min。

(3)用新过滤的油红O(储备液含0.5%油红 O、98%异丙醇，用前以水稀释至40%，24小时后过滤)染色10min。

(4)用60%异丙醇分化5min。

(5)水洗5min。

(6)用Mayer氏苏木精明矾染液(含苏木精0.1%、碘化钠0.02%、钾矾5%、水合氯醛5%、枸橼酸0.1%)染色5min。

(7)水洗30min。

(8)干燥封片。光镜下观察、拍照。

2)细胞内胆固醇的测定：用0.25%胰酶消化1min，收集细胞，以1000r/min离心10min，弃上清液。细胞以PBS洗涤一次后，离心去上清液。加入异丙醇0.5ml，超声破碎细胞10秒?3次。离心，1000r/min，15min。取上清液以胆固醇测定试剂盒测定总胆固醇及游离胆固醇含量，二者之差为胆固醇酯含量。于离心沉淀物中加入0.1mol/L NaOH 0.5ml，用Lowry法测定细胞蛋白含量。细胞内胆固醇及胆固醇酯含量含量以细胞蛋白含量进行校正。

(三)注意事项

1.收取血清样品应从速，最好使用新鲜血清。

2.超速离心的上样和取样时均应细心操作，尽量减少机械扰动。

3.血清密度调节的公式为：

V o(d m-d o)

V n= --------------

d n-d m

式中：V n为需加入的高密度液体积(ml)；

d n为需加入的高密度液的密度(g/ml)；

d o为密度调节前血清的密度(g/ml)；

d m为需调节的密度(g/ml)；

V o为密度调节前血清的体积(ml)。